一种淋球菌检测用引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种淋球菌检测用引物组，述引物组以淋球菌PorA基因为靶基因、基于环介导等温扩增技术设计，所述引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP，各引物的核苷酸序列分别如SEQ?ID：2～5所示。本发明的引物组灵敏度高、特异性强，可满足淋球菌的快速准确检测的需求。本发明还公开了一种淋球菌检测试剂盒，该试剂盒可快速检测淋球菌，具有检测时间短、成本低、准确率高等优点。
【专利说明】—种淋球菌检测用引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测领域，尤其涉及一种淋球菌检测用引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002]性病传播快，危害大，其中淋病在世界广泛流行，常年居性病发病率之首。其病原体是淋病奈瑟氏菌(简称淋球菌)。人是淋球菌的惟一自然宿主，淋球菌通常寄居于粘膜表面的柱状上皮细胞内，其主要致病物质包括菌毛、外膜蛋白、蛋白酶、脂多糖等，主要通过性接触直接感染泌尿生殖道、口咽部和肛门直肠粘膜，或在分娩时通过产道感染新生儿，临床表现为单纯性淋病、盆腔炎、口咽部和肛门直肠病、淋菌性结膜炎及播散性淋病。若不及时治疗，可引起尿道狭窄、输精管及输卵管狭窄甚或闭锁，继发宫外孕和男女不育不孕症。因此，对淋病的早期诊断和治疗十分重要。
[0003]淋球菌感染后约有1%男性无任何症状，75%的女性患者无症状，因此，仅凭有无临床症状作为判断是否感染淋球菌的依据，漏诊率极高，尤其是女性。目前，主要依靠涂片和培养检查，涂片容易漏诊，尤其是在淋病潜伏期，培养检查程序繁琐，耗时长，同样易出假阴性。因此，建立准确可靠的检测方法十分必要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于解决现有的淋球菌检测方法程序繁琐、耗时长、准确率较低的问题。
[0005] 因此，本发明提供了一种淋球菌检测用引物组，所述引物组以淋球菌PorA基因为靶基因、基于环介导等温扩增技术设计，所述引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP，各引物的核苷酸序列分别为:
[0006]外引物F3: (SEQ ID NO:2)
[0007]CCATTGATCCTTGGGACAG
[0008]外引物B3: (SEQ ID NO:3)
[0009]CAGACCGGCATAATACACAT
[0010]内引物FIP: (SEQ ID NO:4)
[0011 ] GGGAATCGTAACGCACGGAAATAATGTGGCTTCGCAATTG
[0012]内引物BIP: (SEQ ID NO:5)
[0013]AGCGGCAGCATTCAATTTGTTCCTGATTACTTTCCAGCGTGA。
[0014]在上述技术方案中，对于淋球菌而言，常用于其核酸扩增检测的基因有16SrRNA、cppB、orf 1、opa、porA,其中porA基因(其序列如SEQ ID N0:1所示)在临床应用中显示较好的敏感性、特异性和保守性，因此本发明选择PorA作为检测淋球菌的靶基因。
[0015]在上述技术方案中，环介导等温扩增技术(LAMP)是一种快速、灵敏、准确的核酸检测方式，它采用4-6条特异引物(针对基因的6-8个区域)及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在65°C左右对核酸进行等温扩增，短时间扩增效率可达到19~1ltl个拷贝。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂盒仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。其中，引物是LAMP法实现扩增的关键。
[0016]在上述技术方案中，所述引物组是经过对所有淋球菌不同菌株的porA基因进行比对，标出易突变的位点和突变频率，选择最保守的porA600-900bp区域作为引物设计的靶序列，使用软件设计得出的。LAMP引物组至少含有4条引物，包括两个外引物(F3和B3)和两个内引物(FIP和BIP，各约40bp)。其中，内引物FIP包含Flc (与Fl区域互补)和F2序列，内引物BIP包含Blc (与BI区域互补)和B2序列。F3和B3在起始扩增反应时起作用；FIP和BIP在整个扩增过程中都起作用，是最关键的一对引物，导致产生环状的茎环结构无限扩增。本发明的引物组，能够特异结合淋球菌PorA序列上的6个特异区域，进行淋球菌的LAMP检测时，出峰时间早，信号强，灵敏度高、特异性强，本发明的引物组根据是否扩增就能该判断靶标物质存在与否，可满足淋球菌的快速准确检测的需求。
[0017]作为对上述技术方案的进一步改进，所述引物组还包括环引物FLP和环引物BLP，两个环引物的核苷酸序列分别为:
[0018]环引物FLP: (SEQ ID NO:6)
[0019]ATACCGTCGTGGCGTTTG
[0020]环引物BLP: (SEQ ID NO:7)
[0021 ] CGCCTATACGCCTGCTAC。
[0022]加入环引物(FLP和BLP)的引物组能够特异结合靶序列上的8个特异区域，它不仅保持了原引物组(未加环引物之前的引物组)信号强、灵敏度高、特异性强的优势，还进一步使得LAMP反应加速,反应时间缩短,大大增加了扩增检测的效率。
[0023]本发明还提供了一种淋球菌检测试剂盒，所述淋球菌检测试剂盒包含所述的引物组。引物组可以仅包含所述外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP，还可以进一步包含所述环引物FLP和环引物BLP。为了提高检测效率，优选包含所述外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物FLP和环引物BLP的引物组。所述淋球菌检测试剂盒可快速检测淋球菌，灵敏性和特异性高、检测时间短、准确率高。
[0024]作为对上述技术方案的进一步改进,所述淋球菌检测试剂盒还包括BstDNA聚合酶、反应液、显色液和阳性对照液。Bst DNA聚合酶、反应液、显色液和阳性对照液是除引物组之外LAMP反应所必需的其他试剂，将这些试剂纳入试剂盒中，可便于使用者操作。其中，Bst DNA聚合酶具有5’ 一 3’ DNA聚合酶活性，能在恒温下扩增DNA核酸；Bst DNA聚合酶不具有3’ 一5’外切核酸酶活性，能将新合成的核酸单链从新生成的DNA双链上置换(取代)下来，形成两条独立的核酸单链以开启下一轮的DNA核酸合成，进而免去了每次扩增前的DNA变性环节。反应液一般包括LAMP反应时所需的dNTP、buffer、Mg2+和甜菜碱；显色液用于核酸检测，通常使用的显色液有SYTO-9、SYBR Green I ,SYBR Green IKSYBR Gold、GelStar 等。
[0025]作为对上述技术方案的更进一步改进，所述BstDNA聚合酶的浓度为6-10U/ μ L ；
[0026]所述反应液含有:1.4 ~1.8mmol/LdNTP、15 ~25mmol/LTris-HCl、9 ~12mmol/LKC1、9 ~12mmol/L (NH4)2SO4'5 ~8mmol/LMgS04、0.1 ~0.12 体积 ％ TritonX-100,0.8 ~1.2mol/L甜菜碱；
[0027]所述显色液为SYT0-9 或 SYBRGreen I ；
[0028]所述阳性对照为淋球菌PorA基因DNA片段；
[0029]所述引物组中各引物的浓度为:所述外引物F3和B3各0.15~0.25 μ mol/L,所述内引物FIP和BIP各1.4~1.8 μ mol/L ;或
[0030]所述外引物F3和B3各0.15~0.25 μ mol/L，所述内引物FIP和BIP各1.4~
1.8 μ mol/L,所述环引物 FLP 和 BLP 各 0.7 ~0.9 μ mol/L。
[0031]上述淋球菌检测试剂盒使用方便，具体使用方法包括以下步骤:(I)准备待测样品DNA; (2)在反应管中加入所述反应液10~14 μ L，所述BstDNA聚合酶0.8~1.2yL，ddH207~9μ L，所述引物组0.8~1.2μ L以及所述样品DNA1.5~2.5 μ L，进行环介导等温扩增反应；(3)在上述反应管和阳性对照组中分别加入所述显色液，混匀，样品组显色与阳性对照组相同则为阳性，否则为阴性。
[0032] 作为对上述技术方案的更进一步改进，所述BstDNA聚合酶的浓度为8U/ μ L ;
[0033]所述反应液含有:1.6mmo I /LdNTP, 20mmo I /LTr i s-HC IU Ommo I /LKCIU Ommo I /L(NH4)2S04、6mmol/LMgS04、0.1% TritonX-100、lmol/L 甜菜碱；
[0034]所述显色液为0.2 μ mol/L SYT0-9 ；
[0035]所述弓丨物组中各引物的浓度为:所述外引物F3和B3各0.2 μ mol/L,所述内引物FIP 和 BIP 各 1.6 μ mol/L ;或
[0036]所述外引物F3和B3各0.2 μ mol/L,所述内引物FIP和BIP各1.6 μ mol/L,所述环引物 FLP 和 BLP 各 0.8 μ mol/L。
[0037]为了保证LAMP反应的稳定性，优选地，所述淋球菌检测试剂盒还包括稳定剂，所述稳定剂优选为石腊油。
[0038]本发明还提供了所述的淋球菌检测用引物组或所述的淋球菌检测试剂盒在检测淋球菌中的应用。本发明的引物组和试剂盒均可用于淋球菌的检测，且具有检测灵敏度高、特异性强、效率高、成本低等优点。
[0039]作为对上述技术方案的进一步改进，所述的应用包括以下步骤:
[0040]I)提取样品中的DNA ；
[0041]2)以步骤I)中提取的DNA为模板，进行环介导等温扩增反应；
[0042]3)检测扩增产物。
[0043]所述步骤3)中，扩增产物的检测可通过扩增产物凝胶电泳、扩增产物浊度观测或扩增产物化学发光检测的方法进行，优选扩增产物化学发光检测的方法，即使用荧光染料如SYT0-9、SYBRGreen I等直接对产物进行染色，可以通过肉眼直接观察结果。
[0044]作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤2)中，所述环介导等温扩增反应的起始阶段温度为60~65°C，持续时间为25~35s ;扩增循环阶段温度为60~65°C，共进行80~100个循环，每个循环的持续时间为40~60s。
[0045]所述环介导等温扩增反应两个阶段的具体反应步骤如下:
[0046]I)起始阶段:
[0047]I步:当双链DNA处于65°C左右的动态平衡中时，引物组中的BIP引物就能通过互补结合到目标DNA双链上，在Bst DNA聚合酶作用下，启动DNA合成；
[0048]2步:从BIP的B2区域3’端开始合成DNA模板的互补链至F3C ；
[0049]3步:B3引物退火结合到模板DNA的互补区域B3C，启动链取代合成，同时释放由BIP引物引导合成的互补链；
[0050]4步:释放的DNA的BIC区域结合BI区域，形成茎环结构；3步释放的DNA链作为FIP引物以及F3引物的模板，按BIP端相同的模式启动DNA的合成及链取代，释放的DNA链的FIP端同样形成茎环结构。进而，形成哑铃结构扩增始发物。
[0051]2)扩增循环阶段(延伸阶段):
[0052]5步:哑铃结构通过自引导DNA合成迅速转换成茎状结构DNA ；
[0053]6步:BIP引物与茎环结构的环状单链区域结合并开始新的DNA合成，由于Fl及FlC的互补关系，再次形成茎环结构，先前合成的DNA链得以释放；
[0054]7步:FIP引物同样与对应的茎环结构的环状单链区域结合，由于BI及BlC的互补关系，再次形成茎环结构，先前合成的DNA链得以释放；
[0055]8步:如此周而复始，最终形成不同长度(目的片段长度的自然倍数)花椰菜cauliflower状的反向重复序列。
[0056]本发明与现有技术相比，具有以下有益效果:
[0057]本发明的引物组，在进行淋球菌的LAMP检测时，出峰时间早，信号强，灵敏度高，检测限可达Ipg/μ L，阴性的稳定性良好，而且特异性强，对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、草绿色链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷白杆菌、溶血性葡萄球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、无名念珠菌、季页蒙念珠菌、解脂酵母菌、克柔念珠菌、挪威念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、乳酸杆菌、灰色奈瑟氏菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、彭氏变形杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌27种菌均无非特异扩增，可满足淋球菌的快速准确检测的需求。
[0058]本发明的淋球菌检测试剂盒，只需一个恒定温度就能进行扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；本发明的淋球菌检测试剂盒利用针对六个区段的四条引物或针对八个区段的六条引物，根据是否扩增即能判断淋球菌存在与否，因此具有高度特异性；本发明的淋球菌检测试剂盒扩增快速且高效，在不到一个小时即可完成扩增，且产率高；本发明的淋球菌检测试剂盒鉴定简便，加入显色液后，阴阳性结构显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。
【专利附图】
【附图说明】
[0059]图1为本发明LAMP的引物组成及对应区域示意图；
[0060]图2为porAl、porA2’、porA3引物的LAMP反应结果图；
[0061]图3为porA2’引物引入环引物的LAMP反应结果图；
[0062]图4为LAMP引物porA2的灵敏度试验图；
[0063]图5为porA2引物扩增28种菌的特异性试验图；
[0064]图6为Ipg/ μ L精密度试验图；
[0065]图7为阴性精密度试验图。
【具体实施方式】
[0066]以下结合实施例对本发明进行更为详细的描述，但是以下描述仅用于对本发明进行解释性说明，并不对本发明的保护范围进行任何的限制，凡依据本
【发明内容】
所作的等同变换，均同理包含在本发明的范围内。实施例中所用淋球菌为标准菌株ATCC49266，购自卫生部临床检验中心，在广州医科大学附属第三医院保存。
[0067]实施例1
[0068]淋球菌检测用LAMP引物组的设计
[0069]设计步骤如下:
[0070]①查阅中外文文献，常用于淋球菌核酸扩增检测的基因有16SrRNA、cppB、orf Kopa、porA,其中porA在临床应用中显示较好的敏感性、特异性和保守性,本研究选择porA作为检测淋球菌的靶基因
[0071]②在NCBI搜索所有淋球菌不同菌株的porA基因进行比对，标出易突变的位点和突变频率
[0072]③选择最保守的porA 600_900bp区域作为引物设计的靶序列
[0073]④使用在线设计软件Primer Explorer vers1n4设计特异引物。
[0074]本发明LAMP的引物组成及对应区域如图1所示，设计得到的三组引物，其序列分别如下所示:
[0075](I)淋球菌引物组porAl,革巴基因:porA
[0076]表1-1淋球菌引物组porAl
【权利要求】
1.一种淋球菌检测用引物组，其特征在于:所述引物组以淋球菌PorA基因为靶基因、基于环介导等温扩增技术设计，所述弓丨物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP，各引物的核苷酸序列分别为: 外引物F3:
CCATTGATCCTTGGGACAG
外引物B3:
CAGACCGGCATAATACACAT
内引物FIP:
GGGAATCGTAACGCACGGAAATAATGTGGCTTCGCAATTG
内引物BIP:
AGCGGCAGCATTCAATTTGTTCCTGATTACTTTCCAGCGTGA。
2.如权利要求1所述的淋球菌检测用引物组，其特征在于:所述引物组还包括环引物FLP和环引物BLP，两个环引物的核苷酸序列分别为: 环引物FLP:
ATACCGTCGTGGCGTTTG
环引物BLP:
CGCCTATACGCCTGCTAC。
3.—种淋球菌检测试剂盒，其特征在于:所述淋球菌检测试剂盒包含权利要求1或2所述的引物组。
4.如权利要求3所述的淋球菌检测试剂盒,其特征在于:所述淋球菌检测试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、反应液、显色液和阳性对照液。
5.如权利要求4所述的淋球菌检测试剂盒，其特征在于: 所述Bst DNA聚合酶的浓度为6-10U/ μ L ； 所述反应液含有:1.4 ~L 8mmol/LdNTP、15 ~25mmol/LTris-HCl、9 ~12mmol/LKCl、9 ~12mmol/L(NH4)2S04、5 ~8mmol/LMgS04、0.1 ~0.12 体积 ％ TritonX-100、0.8 ~1.2mol/L甜菜碱； 所述显色液为SYT0-9或SYBRGreen I ； 所述阳性对照为淋球菌PorA基因DNA片段； 所述引物组中各引物的浓度为:所述外引物F3和B3各0.15~0.25 μ mol/L，所述内引物 FIP 和 BIP 各 1.4 ~1.8 μ mol/L ;或 所述外引物F3和B3各0.15~0.25 μ mol/L,所述内引物FIP和BIP各1.4~1.8 μ mol/L,所述环引物 FLP 和 BLP 各 0.7 ~0.9 μ mol/L。
6.如权利要求5所述的淋球菌检测试剂盒，其特征在于: 所述Bst DNA聚合酶的浓度为8U/ μ L ; 所述反应液含有:1.6mmol/LdNTP、20mmol/LTris-HCl、10mmol/LKCl、10mmol/L(NH4)2S04、6mmol/LMgS04、0.1% TritonX-100、lmol/L 甜菜碱； 所述显色液为0.2 μ mol/L SYTO-9 ； 所述引物组中各引物的浓度为:所述外引物F3和B3各0.2ymol/L，所述内引物FIP和BIP 各 1.6 μ mol/L ;或所述外引物F3和B3各0.2 μ mol/L,所述内引物FIP和BIP各1.6 μ mol/L,所述环引物 FLP 和 BLP 各 0.8 μ mol/L。
7.如权利要求3~6中任一权利要求所述的淋球菌检测试剂盒，其特征在于:所述淋球菌检测试剂盒还包括稳定剂，所述稳定剂为石蜡油。
8.如权利要求1或2所述的淋球菌检测用引物组或权利要求3~6中任一权利要求所述的淋球菌检测试剂盒在检测淋球菌中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于:包括以下步骤: 1)提取待测样品中的DNA; 2)以步骤I)中提取的DNA为模板，进行环介导等温扩增反应； 3)检测扩增产物。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于:所述环介导等温扩增反应的起始阶段温度为60~65°C，持续时间为25~35s ;扩增循环阶段温度为60~65°C，共进行80~100个循环，每个循环的持续时间为40~60s。
【文档编号】C12Q1/04GK104131112SQ201410404761
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】郭旭光, 夏勇, 江镜全, 陈琼, 刘美玲, 唐晓华 申请人:广州医科大学附属第三医院