一种人神经干细胞库的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种人神经干细胞库的构建方法，步骤是利用人尿液分离获得人肾脏上皮细胞，传代培养人肾脏上皮细胞并部分冻存，诱导传代培养获得的人肾脏上皮细胞成神经干细胞，分离并扩增培养诱导获得的神经干细胞，鉴定该神经干细胞，冻存鉴定确认的神经干细胞，编码入库。本发明方法中全过程避免了使用胎牛血清，消除了异种蛋白的引入，减少了隐患；本发明方法将已经诱导成功并具有活性的干细胞保存并构建成库，使用时可实现3日内快速供给临床使用，且本发明方法中冻存细胞方式是冻存一定大小的神经球，冻存过程中保护剂分步导入，降温速率分级设定，使神经干细胞复苏后能保持较高的细胞活率和活性，显著高于目前常规的慢速低温冻存法。
【专利说明】一种人神经干细胞库的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细胞库的构建方法，尤其涉及一种人神经干细胞库的构建方法。
【背景技术】
[0002] 神经干细胞（Neural Stem Cell，简称NSC)是存在于胚胎或成体脑、脊髓等组织中 的一种干细胞，是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，可通过不对等的分裂方式 分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等神经组织的各类细胞。
[0003] 神经元的可再生修复的特性一直是医学科学难以超越的障碍。中枢神经系统组织 结构的脆弱易损且它决定智能活动，故而中枢神经系统疾病及其后遗症（包括帕金森病、 阿尔茨海默病、脑卒中、恶性神经胶质瘤及中枢和外周神经损伤等）始终是影响人类生命 健康和生存质量的顽疾，长期以来均缺乏有效的治疗手段。常规临床治疗方法主要是以减 少或防止继发性损伤为主，基本上没有治愈的可能。上世纪90年代神经干细胞的发现对上 述神经系统疾病的治疗带来了希望。
[0004] 目前，人们通过不断的实践证明了人神经系统内神经干细胞的存在并分离成功， 为神经系统损伤修复和退行性病变的细胞替代治疗带来了新希望。神经干细胞具有自我更 新、自我复制的特性。目前已在多种动物模型及人体中尝试过将神经干细胞移植到纹状体 等脑神经病变部位及受损伤的脊髓中，并获得一定疗效。
[0005] 神经干细胞的研究成为干细胞研究领域中最积极和最活跃的部分，并且神经干细 胞在临床方面拥有光明的应用前景。但要广泛地开展利用神经干细胞治疗神经系统疾病， 神经干细胞的来源、数量以及保存方法等等仍是制约其广泛应用于临床治疗领域的主要难 点。
[0006] 通过对人流产胎儿胚脑的处理，可以分离得到神经干细胞，但是这种方法存在严 重的伦理问题，使用这种方法得到的神经干细胞应用于临床不能得到社会的认同与允许。
[0007] 通过对胚胎干细胞（Embryonic stem cells,简称ES细胞）的诱导，同样可以得到 神经干细胞，但是ES细胞的取得本身也存在破坏胚胎的伦理问题，并且因为ES细胞能导致 畸胎瘤，故通过诱导ES细胞来得到神经干细胞需要完全去除未分化的ES细胞，而做到这一 点目前在技术上尚未实现。且ES来源的神经干细胞全部为异体，使用时会有排异反应。
[0008] 通过对多功能干细胞（iPS细胞）的诱导，同样能得到神经干细胞。iPS细胞本身 没有伦理问题，并且也不存在异体使用的问题。但是其同样面临技术上不能做到完全去除 未分化的iPS细胞的问题。
[0009] 近年来的研究发现，通过对成体细胞的诱导，同样可以得到神经干细胞，其来源为 自体，并且诱导中不经过多能干细胞阶段。但一般成体细胞有多种，有些细胞较难取得，有 些细胞的活动过程非常痛苦，而选择合适的成体细胞及其分离方法成为关键。
[0010] 无论上述何种方法得到神经干细胞，且数量和质量若能满足临床质量要求，其所 需时间均需2个月以上。然而有些神经性损伤疾病，使用干细胞治疗需要最佳治疗"时间窗 口"；比如脊髓损伤、新生儿缺氧缺血性脑病、颅脑损伤等等均需要在较短时间内使用干细 胞治疗才能有效果；治疗这些疾病，若临时采集患者样本进行诱导产生神经干细胞进行治 疗是不可行的。所以将已经诱导并体外扩增完成的神经干细胞保存并建立神经干细胞库来 满足临床需求势在必行，且具有十分重要的科学和临床应用价值。
[0011] 事实上，为了便于人们有效储存和使用组织和细胞资源，目前在世界范围内已经 建立有多种细胞库或组织库，比如脐血造血干细胞库，间充质干细胞库等细胞库。所谓细胞 库是指在约为-196°C液氮中储存细胞和归并相关档案及搜集相关资料的场所。但检索发现 目前尚无人神经干细胞细胞库建立的信息。
【发明内容】
[0012] 本发明的目的在于克服以上技术的不足，提供一种人神经干细胞库的构建方法。
[0013] 本发明所述人神经干细胞库的构建方法，步骤包括：利用人尿液分离获得人肾脏 上皮细胞，传代培养人肾脏上皮细胞并部分冻存，诱导传代培养获得的人肾脏上皮细胞成 神经干细胞，分离并扩增培养诱导获得的神经干细胞，鉴定该神经干细胞，冻存鉴定确认的 神经干细胞，编码入库；其特征在于：
[0014] 所述利用人尿液分离获得人肾脏上皮细胞的方法是：将人中段尿液400g离心， 弃上清，用含双抗的PBS或者生理盐水重悬沉淀，再400g离心，弃上清，用肾脏上皮细胞 培养基重悬沉淀，接种于已用0. 1%的明胶预包被处理的培养瓶中，静置于37°C、5% C02 的培养箱中，培养至有细胞贴壁出现，培养期间将培养箱氧气浓度始终控制在4.0%? 7. 5%，并每天补加肾脏上皮细胞培养基至初始量；其中：所述肾脏上皮细胞培养基的配方 为每100ml培养基包含：5ml Ultroser G(Pall公司，货号15950-017)、0.5ml非必需氨 基酸（Life technologies 公司，货号 11140050)、0.5ml Glutamax(Life technologies 公司，货号35050-061)、1以8表皮生长因子伍6?，1?&0)、0.11111胰岛素（1^〇1^&公司，货号 CC-4021L)、0· lml 氢化可的松（Lonza 公司，货号 CC-4031L)、0· lml GA-100 (Lonza 公司，货 号 CC-4081L)、0.1ml 肾上腺素 （Lonza 公司，货号 CC-2221L)、0.1ml T3(Lonza 公司，货号 CC-4211L)、0. lml 转铁蛋白（Lonza公司，货号 CC-4205L)、24ml ?70ml REBM培养基（Lonza 公司，货号 CC-3191)、24ml ?70ml a -MEM 培养基（HyClone 公司）；
[0015] 所述传代培养人肾脏上皮细胞并部分冻存的方法是：待分离出的人肾脏上皮细胞 生长至汇合度为80%以上时，用0. 01 %的胰酶消化传代，且每当细胞能满足传代要求时均 进行传代，细胞传代最多至第五代（P5);在人肾脏细胞传代至第二代（P2)时，取约10%量 的细胞进行冻存，冻存液配方为：l〇wt % DMS0+10wt %海藻糖+10wt %羟乙基淀粉+20wt % 的浓度为20%人血白蛋白溶液+50wt%人肾脏上皮细胞培养基；
[0016] 所述诱导传代培养获得的人肾脏上皮细胞成神经干细胞的方法是：1)取传代培 养获得的人肾脏上皮细胞，调整细胞浓度为IX 1〇6个/ml?IX 107个/ml，转移至无菌EP管 中，250g离心，弃上清，收集细胞并转入电转杯中；2)配制质粒转化体系：向上述电转杯中 依次力口入 82 μ 1 BasicSolution for Mammalian Epithelial Cells 和 18 μ 1 supplement 1 (Lonza 公司）轻轻混匀，再加入 3 μ g pCEP4-0ct4-Sox2-Klf4 质粒和 2 μ gpCEP4-miR-302 质粒3)将电转杯置于Amaxa电转仪（Lonza公司）上，选择T-013或T-020程序进行电 转；4)将电转后的细胞转移至包被有基质胶（Matrigel)的Τ25培养瓶中，每瓶接种1Χ10 6 个?5X106个，然后添加肾脏上皮细胞培养基并置于37°C、5% C02的培养箱中培养12? 18小时，之后将培养瓶中的培养基换成含有20ng/ml白血病抑制因子（LIF，R&D)的神经干 细胞培养基再进行培养，培养期间将培养箱氧气浓度始终控制在4. 0%?7. 5%，10-15天 后，可见排列成神经花环样结构的或者具有极性排列的神经干细胞样细胞团；其中：所述 神经干细胞培养基的配方为每l〇〇ml培养基包含：1ml N2(Life technologies公司，货号 17502-048)、lml Glutamax (Life technologies 公司，货号 35050-061)、lml 非必需氨基酸 (Life technologies 公司，货号 11140050)、lml B-27Supplement (Life technologies 公 司，货号17504044)、1 μ g表皮生长因子（EGF，R&D)、1 μ g碱性成纤维细胞生长因子（bFGF， R&D)、lyg TGF-β (BD)、25_75ml Neurobasal 培养基（Life technologies 公司，货号 211〇3〇49)、25_75ml DMEM/F12 培养基（HyClone 公司）；
[0017] 所述分离并扩增培养诱导获得的神经干细胞的方法是：机械法挑取上述步骤诱 导出来的神经干细胞样的细胞团，并转移到装有神经干细胞培养基的T25细胞培养瓶中； 用5ml移液管轻轻吹打细胞团，将细胞团吹成小块；并将培养瓶放入37°C、5% C02的培养 箱中培养，培养箱氧气浓度继续控制在4. 0% -7. 5%。神经干细胞悬浮生长于培养瓶中一 周后，细胞可形成边界清晰的神经球。此后，每2-3天进行半换液培养；当神经干细胞生长 5-7天时，神经干细胞球足够大（直径大约200-300 μ m)时可进行传代；将要传代的神经干 细胞转移至50ml离心管中，神经球离心（50g，3-5min)后，弃除上清液，并向离心管中添加 lml Accutase (神经干细胞消化酶，sigma)，使其于37°C下进行消化5-10min。用DMEM/F12 培养基终止消化后，50g离心3-5min ;弃上清，用神经干细胞培养基重悬神经干细胞，按照 1:3--1:6的比例进行传代分瓶后继续培养，此时神经干细胞记为P2代；之后每约5-7天 并且神经干细胞球足够大时再以前述方式进行传代扩增；
[0018] 所述鉴定神经干细胞的方法是：按行业规定的方法对扩增出的经诱导获得的神经 干细胞进行鉴定，主要鉴定其表型、分化能力、安全性等指标，各项指标合格后才能进行冻 存；
[0019] 所述冻存鉴定确认的神经干细胞的方法是：取鉴定确认后的由传代培养获得的 神经干细胞，按照常规方法对其进行消化传代培养，当观察到大多数细胞长至直径为80? 120 μ m的神经球时，将细胞转移到离心管中并取样计数，50g离心后弃掉上清，收集的细胞 按冻存时浓度为1. 5-10 X 106个/ml计算出需要使用的冻存液体积量；首先用1/3预计冻 存液体积量的神经干细胞培养基轻轻重悬细胞，再逐滴加入1/3预计冻存液体积的含有 18wt%海藻糖和18wt %羟乙基淀粉的神经干细胞培养基，加入完毕后将含上述溶液的离 心管放入4°C冰箱10_30min，使之冷却，之后再逐滴加入1/3预计冻存液体积的已经预冷 至4°C的含有18wt% DMS0的20wt%人血白蛋白溶液；完成后轻轻混匀细胞，并将其转移至 冻存管中；将冻存管转移至程序降温仪中，程序降温仪的降温速率设定为：4°C至?10°C为 0· 25°C/min ;-10°C至?40°C为 0· 5°C/min ;-40°C至?80°C为 l°C/min ;-80°C 以下为 2°C/ min ;完成后于弟_天转入液氣罐中；
[0020] 所述编码入库的方法是：将冻存的人肾脏上皮细胞和冻存的诱导获得的神经干细 胞按照顺序以每人为一组统一编号，标记冻存的细胞和存入的液氮罐，并将编码和保存位 置信息及保存人信息统一输入计算机以便于检索。冻存细胞信息包括细胞分离、培养、诱 导、扩增、冻存等操作记录，及最终的神经干细胞鉴定结果，除将其一并输入计算机中以外， 还应形成书面文件并统一编码存档。
[0021] 本发明与现有技术相比，具有以下优点：
[0022] 利用本发明建立的人神经干细胞库，神经干细胞冻存前已经扩增到临床使用所需 要的细胞数目、细胞活性和安全性均已经过检测、细胞复苏后的活率和有完全活性的细胞 比率高，完全可以直接复苏给临床使用，不需要再进行任何扩增处理，故可3日以内快速的 供给临床使用。
[0023] 利用本发明建立的人神经干细胞库，神经干细胞是利用本人自体的细胞诱导而成 的，故使用时完全避免了排异反应；并且在诱导生产神经干细胞时，细胞并未经过诱导的多 能干细胞阶段，而是由肾脏上皮细胞直接诱导生成了神经干细胞，故也避免了多能干细胞 使用上的安全性问题。
[0024] 利用本发明建立的人神经干细胞库，全部操作过程避免了使用胎牛血清，有效避 免了异种蛋白的引入，消除了临床上应用上存在隐患。
[0025] 利用本发明建立的人神经干细胞库，全程培养中，培养箱环境设置为低氧，氧气浓 度接近于人体的生理氧浓度，不但整个操作过程大大缩短，而且细胞在移植入人体内后更 能适应体内环境，能够取得更为优良的疗效。
[0026] 利用本发明建立的人神经干细胞库，冻存神经干细胞的方式是冻存一定大小的神 经球，并且冻存保护剂是分步导入的，且设定了最佳的降温速率，使神经干细胞复苏后保持 较高的细胞活率和活性，显著高于目前常规的慢速低温冻存法。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1 :人神经干细胞库的构建流程图。
[0028] 图2 :人肾脏上皮细胞形态。
[0029] 图3 :诱导生成的神经干细胞样细胞团。
[0030] 图4 :诱导的神经干细胞传代前形态。
[0031] 图5 :诱导的神经干细胞传代后24h形态。
[0032] 图6 :冻存前的神经干细胞形态。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1人外周血免疫细胞库的构建方法
[0034] (1)、分离人肾脏上皮细胞：取中段尿液150-200ml于无菌容器中，无菌容器提前 加入适量双抗；将上述尿液转入50ml离心管，400g离心lOmin ;离心完毕，弃上清，用含双 抗的PBS或者生理盐水重悬细胞，然后400g离心lOmin ;离心完毕后，弃上清，用肾脏上皮 细胞培养基5ml重悬沉淀；将上述收集到的细胞接种于已用0. 1 %的明胶预包被处理的 T25培养瓶中；将接种有细胞的培养瓶置于37°C、5% C02的培养箱中，并且将培养箱氧气浓 度一直控制为5. 0% ;其中：所述肾脏上皮细胞培养基的配方为每100ml培养基包含：5ml Ultroser G(Pall 公司，货号 15950-017)、0· 5ml 非必需氨基酸（Life technologies 公司， 货号 11140050)、0· 5ml Glutamax (Life technologies 公司，货号 35050-061)、1 μ g 表皮生 长因子（EGF，R&D)、0. lml胰岛素（Lonza公司，货号CC-4021L)、0. lml氢化可的松（Lonza公 司，货号 CC-4031L)、0· lml GA-100 (Lonza 公司，货号 CC-4081L)、0· lml 肾上腺素 （Lonza 公 司，货号CC-2221L)、0· lml T3(Lonza公司，货号 CC-4211L)、0· lml 转铁蛋白（Lonza公司，货 号 CC-4205L)、24ml ?70ml REBM 培养基（Lonza 公司，货号 CC-3191)、24ml ?70ml a -MEM 培养基（HyClone公司）；优选肾脏上皮细胞培养基中REBM培养基和a -MEM培养基的比例 为 1:1。
[0035] (2)、培养并扩增人肾脏上皮细胞：步骤（1)中接种有细胞的培养瓶在培养箱中静 置3天；之后每天补加培养基lml至观察到少许细胞贴壁；观察到有细胞贴壁后完全换液 并于之后每两天换液一次；6天后待培养瓶中细胞汇合度50%以上时，用0. 05%的胰酶消 化传代；此时细胞记为P1代；之后每次待细胞汇合度达80 %以上时重复如上方法连续传代 扩增。
[0036] (3)、冻存部分肾脏上皮细胞：步骤（2)中在人肾脏细胞传代至第二代（P2)且细胞 汇合度达到80 %以上时，取约10 %量的细胞进行冻存，冻存密度为0. 5 X 107个/ml ;冻存液 配方为：10wt % DMS0+10wt %海藻糖+10wt %羟乙基淀粉+20wt %的浓度为20 %人血白蛋白 溶液+50被％人肾脏上皮细胞培养基。
[0037] (3)、诱导肾脏上皮细胞成神经干细胞：取步骤（2)中得到的P3至P5代细胞，调整 细胞浓度为〇. 5 X 107个/ml，然后转移至1. 5ml的无菌EP管中，250g离心8min ;吸弃EP管 中的上清，收集细胞并转入电转杯中；配制质粒转化体系：向上述电转杯中依次加入82 μ 1 BasicSolution for Mammalian Epithelial Cells 和 18 μ 1 supplement 1 (Lonza 公司） 轻轻混匀，然后加入3 μ g pCEP4-0ct4-Sox2-Klf4质粒和2 μ g pCEP4-miR-302质粒；将电 转杯置于Amaxa电转仪（Lonza公司）上，选择Τ_013(或T-020)程序进行电转（电转条件 为：pulse voltage(脉冲电压）1650V，pulse width(脉冲持续时间）10ms，pulse width(脉 冲次数）3);将电转后的细胞转移至包被有基质胶（Matrigel)的T25培养瓶上，每瓶接种 约1 X 106个细胞，然后添加肾脏上皮细胞培养基并置于37°C、5% C02的培养箱中培养12? 18小时，之后将培养瓶中的培养基换成含有20ng/ml白血病抑制因子（LIF，R&D)的神经 干细胞培养基再进行培养，培养期间将培养箱氧气浓度始终控制在5. 0% ;在电转后第14 天，可见具有极性排列的神经干细胞样细胞团；其中：所述神经干细胞培养基的配方为每 100ml 培养基包含：1ml N2 (Life technologies 公司，货号 17502-048)、lml Glutamax (Life technologies 公司，货号 35050-061)、lml 非必需氨基酸（Life technologies 公司，货号 11140050)、lml B_27Supplement (Life technologies 公司，货号 17504044)、1 μ g 表皮生 长因子（EGF，R&D)、1 μ g 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，R&D)、1 μ g TGF- β (BD)、25-75ml Neurobasal 培养基（Life technologies 公司，货号 21103049)、25-75ml DMEM/F12 培养基 (HyClone公司）；优选神经干细胞培养基中Neurobasal培养基和DMEM/F12培养基的比例 为 1:1。
[0038] 上述pCEP4为一种细胞表达载体，购买自Invitrogen公司； pCEP4-0ct4-Sox2-Klf4质粒是以pCEP4为载体构建的含有0ct4、Sox2、Klf4三种多功能干 细胞因子核酸序列的质粒；pCEP4-miR-302质粒是以pCEP4为载体构建的含有miR302核酸 序列的质粒。
[0039] (4)、分离诱导的神经干细胞：机械法挑取步骤⑶中诱导出来的神经干细胞样的 细胞团，并转移到装有神经干细胞培养基的T25细胞培养瓶中；用5ml移液管轻轻吹打细胞 团，将细胞团吹成小块；并将培养瓶放入37°C、5% C02的培养箱中培养，培养箱氧气浓度继 续控制在4. 0 % -7. 5 %。神经干细胞悬浮生长于培养瓶中一周后，细胞可形成边界清晰的 神经球。此后，每2天进行半换液培养；当神经干细胞生长7天时，神经球足够大（直径大 约200-300 μ m)时可进行如下的传代扩增；
[0040] (5)、扩增培养诱导的神经干细胞：将要传代的神经干细胞转移至50ml离心管中， 神经球离心（50g，3-5min)后，吸除上清，并向离心管中添加 lml Accutase细胞消化液，使 其于37°C下进行消化5-10min。用DMEM/F12培养基终止消化后，50g离心3-5min ;弃上清， 用神经干细胞培养基重悬神经干细胞，按照1:6的比例进行传代分瓶后继续培养，此时神 经干细胞记为P2代；之后每约5-7天并且神经干细胞球足够大时进行传代扩增；
[0041] (6)、鉴定诱导的神经干细胞：取步骤（5)扩增出的诱导的神经干细胞，按行业规 定的方法对其进行鉴定，主要鉴定其表型、分化能力、安全性等指标，各项指标合格后才能 进行冻存；
[0042] (7)、冻存诱导的神经干细胞：取步骤（5)中传代培养的神经干细胞（如P4代神经 干细胞），按照正常操作对细胞进行消化传代；培养3天后，当观察到大多数细胞长至直径 为80?120 μ m的神经球时，将细胞转移到50ml离心管中，先取样5ml计数，其余50g离心 5min，离心完毕后弃掉上清，收集的细胞按冻存时浓度为1. 5-10 X 106个/ml计算出需要使 用的冻存液体积量；首先用1/3预计冻存液体积量的神经干细胞培养基轻轻重悬细胞，再 逐滴加入1/3预计冻存液体积的含有18wt%海藻糖和18wt%羟乙基淀粉的神经干细胞培 养基，加入完毕后将含上述溶液的离心管放入4°C冰箱10_30min，使之冷却，之后再逐滴加 入1/3预计冻存液体积的已经预冷至4°C的含有18wt % DMS0的20wt %人血白蛋白溶液；完 成后轻轻混匀细胞，并将其转移至冻存管中；将冻存管转移至程序降温仪中，程序降温仪的 降温速率设定为：4°C至?10°C为0· 25°C /min ;-10°C至?40°C为0· 5°C /min ;-40°C至? 80°C为1°C /min ;-80°C以下为2°C /min ;完成后于第二天转入液氮罐中。
[0043] (8)、编码入库：将步骤（3)中冻存的人肾脏上皮细胞和步骤（7)中冻存的诱导获 得的神经干细胞按照顺序以每人为一组统一编号，标记冻存的细胞和存入的液氮罐，并将 编码和保存位置信息及保存人信息统一输入计算机以便于检索。冻存细胞信息包括细胞分 离、培养、诱导、扩增、冻存等操作记录，及最终的神经干细胞鉴定结果，除将其一并输入计 算机中以外，还应形成书面文件并统一编码存档。
[0044] 实施例2人诱导的神经干细胞的冻存
[0045] (1)、取可以传代的诱导获得的神经干细胞P4代细胞，转移至50ml离心管中，对 其离心（50g，3-5min)后，吸除上清，并向离心管中添加 lml Accutase细胞消化液，使其于 37°C下进行消化5min。
[0046] (2)、用DMEM/F12培养基终止消化后，50g离心3-5min ;弃上清，收集细胞并依据细 胞冻存时浓度为5X 106个细胞/ml冻存液计算出需要使用的冻存液体积；用上述体积的冻 存液悬起细胞后混匀，分装到冻存管中；冻存液成分为10% DMS0+90% FBS。
[0047] (3)、将冻存管转移至程序降温仪中，程序降温仪的降温速率为1°C /min ;完成后 于第二天转入液氮中；
[0048] 实施例1和实施例2中冻存的诱导的神经干细胞分别于液氮保存6个月、12个月、 18个月复苏，分别比较细胞复苏后活率、复苏后培养24h后的细胞数与冻存时细胞数之比、 复苏后至第一次传代需要的时间；结果见表1?表3,可见用本发明构建的神经干细胞库中 的神经干细胞，复苏后细胞活率明显高于普通的神经干细胞冻存方法，复苏后24h得到的 细胞较多且能更快的传代。
[0049] 表1 :神经干细胞复苏后平均细胞活率
[0050]
【权利要求】
1. 一种人神经干细胞库的构建方法，步骤包括：利用人尿液分离获得人肾脏上皮细 胞，传代培养人肾脏上皮细胞并部分冻存，诱导传代培养获得的人肾脏上皮细胞成神经干 细胞，分离并扩增培养诱导获得的神经干细胞，鉴定该神经干细胞，冻存鉴定确认的神经干 细胞，编码入库；其特征在于： 所述利用人尿液分离获得人肾脏上皮细胞的方法是：将人中段尿液400g离心，弃上 清，用含双抗的PBS或者生理盐水重悬沉淀，再400g离心，弃上清，用肾脏上皮细胞培养 基重悬沉淀，接种于已用0. 1%的明胶预包被处理的培养瓶中，静置于37°C、5% C02的培 养箱中，培养至有细胞贴壁出现，培养期间将培养箱氧气浓度始终控制在4. 0%?7. 5%， 并每天补加肾脏上皮细胞培养基至初始量；其中：所述肾脏上皮细胞培养基的配方为 每100ml培养基包含：5ml Ultroser G(Pall公司，货号15950-017)、0.5ml非必需氨基 酸（Life technologies 公司，货号 11140050)、0.5ml Glutamax(Life technologies 公 司，货号35050-061)、lyg表皮生长因子（EGF，R&D)、0. lml胰岛素（Lonza公司，货号 CC-4021L)、0· lml 氢化可的松（Lonza 公司，货号 CC-4031L)、0· lml GA-100 (Lonza 公司，货 号 CC-4081L)、0.1ml 肾上腺素 （Lonza 公司，货号 CC-2221L)、0.1ml T3(Lonza 公司，货号 CC-4211L)、0. lml 转铁蛋白（Lonza公司，货号 CC-4205L)、24ml ?70ml REBM培养基（Lonza 公司，货号 CC-3191)、24ml ?70ml a -MEM 培养基（HyClone 公司）； 所述诱导传代培养获得的人肾脏上皮细胞成神经干细胞的方法是：1)取传代培养获 得的人肾脏上皮细胞，调整细胞浓度为IX 1〇6个/ml?IX 107个/ml，转移至无菌EP管 中，250g离心，弃上清，收集细胞并转入电转杯中；2)配制质粒转化体系：向上述电转杯中 依次力口入 82 μ 1 BasicSolution for Mammalian Epithelial Cells 和 18 μ 1 supplement 1 (Lonza 公司）轻轻混匀，再加入 3 μ g pCEP4-0ct4-Sox2-Klf4 质粒和 2 μ gpCEP4-miR-302 质粒；3)将电转杯置于Amaxa电转仪（Lonza公司）上，选择T-013或T-020程序进行电 转；4)将电转后的细胞转移至包被有基质胶（Matrigel)的Τ25培养瓶中，每瓶接种1Χ10 6 个?5X106个，然后添加肾脏上皮细胞培养基并置于37°C、5% C02的培养箱中培养12? 18小时，之后将培养瓶中的培养基换成含有20ng/ml白血病抑制因子（LIF，R&D)的神经干 细胞培养基再进行培养，培养期间将培养箱氧气浓度始终控制在4. 0%?7. 5%，10-15天 后，可见排列成神经花环样结构的或者具有极性排列的神经干细胞样细胞团；其中：所述 神经干细胞培养基的配方为每l〇〇ml培养基包含：1ml N2(Life technologies公司，货号 17502-048)、lml Glutamax(Life technologies 公司，货号 35050-061)、lml 非必需氨基酸 (Life technologies 公司，货号 11140050)、lml B-27Supplement (Life technologies 公 司，货号17504044)、1 μ g表皮生长因子（EGF，R&D)、1 μ g碱性成纤维细胞生长因子（bFGF， R&D)、1 μ g TGF-β (BD)、25_75ml Neurobasal 培养基（Life technologies 公司，货号 211〇3〇49)、25_75ml DMEM/F12 培养基（HyClone 公司）； 所述冻存鉴定确认的神经干细胞的方法是：取鉴定确认后的由传代培养获得的神经干 细胞，按照常规方法对其进行消化传代培养，当观察到大多数细胞长至直径为80?120 μ m 的神经球时，将细胞转移到离心管中并取样计数，50g离心后弃掉上清，收集的细胞按冻存 时浓度为1. 5-10X 106个/ml计算出需要使用的冻存液体积量；首先用1/3预计冻存液体 积量的神经干细胞培养基轻轻重悬细胞，再逐滴加入1/3预计冻存液体积的含有18wt%海 藻糖和18wt%羟乙基淀粉的神经干细胞培养基，加入完毕后将含上述溶液的离心管放入 4°C冰箱10-30min，使之冷却，之后再逐滴加入1/3预计冻存液体积的已经预冷至4°C的含 有18wt% DMSO的20wt%人血白蛋白溶液；完成后轻轻混匀细胞，并将其转移至冻存管中； 将冻存管转移至程序降温仪中，程序降温仪的降温速率设定为：4°C至?10°C为0. 25°C / min ;-10°C至?40°C为 0· 5°C /min ;-40°C至?80°C为 1°C /min ;-80°C 以下为 2°C /min ;完 成后于第二天转入液氮罐中。
2. 如权利要求1所述人神经干细胞库的构建方法，其特征在于：所述肾脏上皮细胞培 养基的配方中REBM培养基与α -MEM培养基的混合比例为1: 1。
3. 如权利要求1所述人神经干细胞库的构建方法，其特征在于：所述神经干细胞培养 基的配方中Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基的混合比例为1:1。
【文档编号】C12N5/10GK104152488SQ201410404506
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】王肇光, 郭小星, 陈莉, 邢晓, 王惠, 孙帅帅, 田甜, 孟莹 申请人:济南干细胞再生与转化医学研究院