鉴别伪狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明涉及的鉴别伪狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒及检测方法，属于动物医学动物疫病分子生物学诊断【技术领域】。鉴别伪狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，该试剂盒由一扩反应混合液、二扩反应混合液、阴性对照和阳性对照组成。本发明将采用套式PCR扩增，且目的片段较小，保证了反应的高灵敏度。检测总时间控制在4小时左右，达到了快速检测的目的。本发明能彻底解决伪狂犬流行毒株和gE基因缺失疫苗毒株鉴别诊断问题，快速、灵敏，特异性好，非常适合伪狂犬疫情的大面积快速检测普查，适用于各实验室、动物疫病预防控制中心以及条件具备的大中型养殖场。
【专利说明】鉴别伪狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株复合套式聚合 酶链式反应诊断试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的鉴别伪狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株复合套式聚合酶链式反 应诊断试剂盒及检测方法，属于动物医学动物疫病分子生物学诊断【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病（Pseudorabies，PR)又名奥叶兹基氏病、猪疱疹病毒I型等，是由疽疹 病毒科（Herpesvirdae), α-疫病毒亚科（Alpherpesvirinae)中的伪狂犬病毒（PRV)引 起的一种或多种动物感染的急性传染病，迄今仍是我国主要的猪群传染病之一。伪狂犬病 毒可引起怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎；新生仔猪衰竭死亡，死亡率可达100%;成年猪多 呈隐性感染，长期带毒排毒，成为该病的主要传染源，由于缺乏临床症状，带毒猪很容易被 忽视，造成猪场伪狂犬病毒长期存在，危害巨大。自1902年匈牙利首次发现该病以来，该病 在世界各地已广泛流行。在我国，自1984年刘永纯首次报道此病后，迄今为止已有20多个 省份相继发生该病，给我国的养猪业特别是集约化养猪造成了巨大经济损失。鉴于伪狂犬 的重要性，我国农业部将其列为二类动物疫病。
[0003] 疫苗免疫接种则是防制乃至根除该病的主要手段之一。自20世纪70年代以来，人 工筛选的自然弱毒疫苗及基因工程缺失疫苗的广泛应用，对防制伪狂犬病做出重要贡献。 在我国广泛使用的Barth-k61株弱毒疫苗，其基因中有包括整个gE和大部分gl基因序列 缺失。基因缺失疫苗在减少伪狂犬病感染的机会、减轻感染后的症状、减少散毒量等方面较 弱毒苗和灭活苗都有了很大的改进，因而基因缺失疫苗成了目前预防控制伪狂犬病的主要 手段，西方许多国家的根除伪狂犬病的计划都依赖基因缺失疫苗进行免疫接种而制定。
[0004] 我国使用的诊断猪伪狂犬的血清学方法有病毒分离鉴定、血清中和试验（SN)、琼 脂扩散试验(AGP)、乳胶凝集试验（LA)、酶联免疫吸附试验（ELISA)和免疫荧光技术（IF)， 分子生物学方法有PCR技术和核酸杂交技术。病毒分离鉴定是诊断伪狂犬最可靠的办法之 一，但最大的缺点是耗时长，敏感性低。血清中和试验、琼脂扩散试验和乳胶凝集试验等优 点是特异性好，缺点是灵敏性较低。ELISA可区分疫苗免疫抗体和野毒感染抗体，且灵敏度 高，目前应用广泛。但ELISA检测猪群呈野毒抗体阳性并不代表猪群目前就感染伪狂犬野 毒，因为野毒抗体阳性也可能是猪群曾经感染野毒引起。因此，在伪狂犬野毒的定性诊断上 尚需要依赖病原的检测。
[0005] 随着分子生物学技术的飞速发展，PCR技术以其快速、敏感、易于操作等优点在动 物疫病诊断中得到了广泛应用。Belak等针对gB基因设计引物，最早使用PCR的方法检测 伪狂犬病毒。Jestin等从鼻拭子抽提核酸，通过扩增PRV的gD基因序列检测出伪狂犬病 毒。Talmage T B等应用gB基因引物对活检的扁桃体细胞和实质组织进行扩增，能应用于 潜伏感染的检查。国内娄高明、范伟兴等也分别建立了检测PRV的PCR方法，可用于伪狂犬 病的诊断和流行病学调查。由于我国多年一直采用疫苗预防为主的防控策略，猪群疫苗免 疫覆盖率高，导致疫苗毒株在猪群中广泛存在。常规PCR技术不能区分疫苗毒和伪狂犬野 毒，在诊断结果的判定上存在困难。
[0006] 国内有学者尝试建立相关的鉴别诊断方法，如刘丽娜等建立了多重PCR鉴别猪伪 狂犬病野毒与疫苗毒诊断方法，可以检测到106 pg三基因缺失疫苗毒或756 pg PRV野毒 的核酸模板量。但是，作者也意识到，多重PCR方法对病料模板的纯度和含量要求高于单一 的PCR方法，所以若要将其应用于兽医临床，还需进一步研究，且作者并没有将方法应用于 检测临床病理组织材料，不能确定其在临床应用中的表现。蔺芳等也建立了多重PCR方法， 设计了 3对引物对四种伪狂犬疫苗样品DNA进行多重PCR扩增，其中1种疫苗得到与设计 相符的1条特异性条带，其余为2条。但其最大的缺陷仍是仅限于纯培养的细胞毒，没有进 行临床样本的直接检测试验，所以其方法能否应用于生产实际，不需细胞培养进行病毒分 离纯化而直接检测组织或血清等材料，尚无定论。
【发明内容】
[0007] 为解决上述问题，本发明旨在提出一种操作简便、结果直观、灵敏度高、特异性好 的鉴别伪狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒。
[0008] 实现该发明目的的技术方案如下：鉴别伪狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株复 合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒，该试剂盒由一扩反应混合液、二扩反应混合液、阴性对 照和阳性对照组成； 所述一扩反应混合液由灭菌三蒸水、2XGC Buffer、10m mol · Ι/ΜΝΤΡ^δ μ mol · I71 PRgD-lF 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgD-lR 下游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-lF 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-lR下游引物、5U/y L rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为7 :12. 5 : 1 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5,共计 23 μ L，50 个反应共计 1150μ L，装成 1 管； 所述二扩反应混合液由灭菌三蒸水、2XGC Buffer、10m πιοΙ.Ι/ΜΝΤΡ^δ μπιο?·!/1 PRgD-2F 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgD-2R 下游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-2F 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-2R下游引物、5U/y L rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为7 :12. 5 : 1 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5,共计 23 μ L，50 个反应共计 1150μ L，装成 1 管； 所述阴性对照为ΡΚ-15正常细胞培养上清液； 所述阳性对照为gE基因缺失疫苗株Batha_k61细胞培养液； 其中，所述的引物 PRgD-lF 序列为：5' - TAAAATTGGGTCGGCGTCC-3' 所述的引物 PRgD-lR 序列为：5' - CGCCCTCAGGAATCGGAC -3' 所述的引物 PRgE-lF 序列为：5' - GTTCAGAGCATGCGCCGG -3' 所述的引物 PRgE-lR 序列为：5' - CGACAGCAGCCAGACGC -3' 所述的引物 PRgD_2F 序列为：5' - GACCGAGCACGAGGTGCG-3' 所述的引物 PRgD_2F 序列为：5' - GTCCACGCGCGCCTTGA -3' 所述的引物 PRgE_2F 序列为：5' - ATCGCGATCGGCGAGTCA -3' 所述的引物 PRgE_2R 序列为：5' - CGAGTCGAGCGTGCCACTA -3' 所述的引物 PRgE_2F 序列为：5' - ATCGCGATCGGCGAGTCA -3' 所述的引物 PRgE_2R 序列为：5' - CGAGTCGAGCGTGCCACTA -3'。
[0009] 本发明的另一个发明目的：提供一种鉴别伪狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株 复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒的检验方法，包括下列步骤： 1) DNAzol Reagent试剂法提取待检样品DNA，空气中自然干燥，用40 μ L 8mmol · L WaOH 溶解； 2) 取一扩混合液23 μ L，加入DNA溶液2 μ L，均匀混合后进行PCR扩增，反应条件为95 °C，预变性5 min，94 °C 60 s，62°C 60 s，72 °C 60 s共进行35个循环，最后72 °C延伸 10 min ； 3) 取二扩混合液23 μ L，加入二扩产物2 μ L，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95 °C 预变性5 min，94 °C 60 s，65 °C 60 s，72 °C 60 s共进行35个循环，最后72 °C延伸10 min ； 4) 10 g·!/1琼脂糖凝胶中电泳； 5) 结果分析：阴性对照不出条带，阳性对照出217bp -个条带，说明对照成立；样品中 出现217bp -个条带，即为gE基因缺失疫苗毒株；样品出现217bp、354bp两个条带，即为伪 狂犬流行毒株感染。
[0010] 试剂盒的验证性试验： ①特异性试验 使用本发明的诊断试剂盒，按照DNAzol Reagent试剂说明提取Batha-k61伪狂犬基因 缺失疫苗、伪狂犬野毒SXHX13株、PCV-2、PPV等DNA病毒的DNA作为模板，用试剂盒的一扩 混合液和二扩混合液进行复合套式PCR，扩增完毕后电泳观察。按照TRIzol Reagent试剂 说明提取猪瘟兔化弱毒活疫苗、猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗和猪流行性腹泻病毒SXJY12 株总RNA，反转录获得第一链cDNA，用本发明的诊断试剂盒一扩混合液和二扩混合液进行 复合套式PCR，扩增完毕后电泳观察。
[0011] 结果显示，Batha-k61伪狂犬基因缺失疫苗株出现217bp -个条带；伪狂犬野毒 SXHX13株出现217bp、354bp两个条带；PCV-2、PPV、猪瘟兔化弱毒活疫苗、猪繁殖与呼吸综 合征弱毒疫苗和猪流行性腹泻病毒SXJY12株均没有出现条带(见附图1)。
[0012] 回收各阳性样本的条带，纯化后连接PMD18-T载体，转化DH5a感受态细胞，取PCR 鉴定为阳性得菌液，提取质粒进行测序，将测得的序列与所用毒株基因序列进行比较，发现 序列完全一致。结果证实本试剂盒及检测方法具有很高的特异性，能准确扩增PRV基因片 段，并能直观区分gE基因缺失疫苗株和流行毒株。
[0013] ②灵敏度试验 使用本发明提供的诊断试剂盒，提取伪狂犬野毒SXHX13株DNA，紫外分光光度计测定 浓度为278pg · Γ1，按照10倍浓度梯度稀释至ΚΓ9,用试剂盒提供的一扩混合液和二扩混 合液进行套式复合PCR，扩增完毕后电泳观察。结果显示，本发明的试剂盒能检测的极限为 2. 78Xl(T4pg · ΙΛ提示本方法灵敏度高(见附图2)。
[0014] ③稳定性试验 本发明提供的诊断试剂盒保存条件为-20°C，每月1次用Batha-k61伪狂犬基因缺失 疫苗、伪狂犬野毒SXHX13株及对照进行检测试验，连续检测6个月，检测试剂盒存放的稳定 性。结果显示，6个月内试剂盒检测结果完全一致，说明试剂盒有良好的稳定性。
[0015] ④田间试验 采集了陕西省临床疑似伪狂犬组织病料和血清共65份，用本发明的试剂盒及检测方 法进行诊断，同时以单纯检测gD基因的PCR方法进行平行检测试验。结果本发明的检出阳 性率为64. 6% (42/65)，单纯检测gD基因的PCR方法检出阳性率为66. 2% (43/65)，两种方 法符合率97. 6% (42/43)，提示两种方法符合率高(见附图3)。
[0016] 本发明将采用套式PCR扩增，且目的片段较小，保证了反应的高灵敏度。检测总时 间控制在4小时左右，达到了快速检测的目的。本发明能彻底解决伪狂犬流行毒株和gE基 因缺失疫苗毒株鉴别诊断问题，快速、灵敏，特异性好，非常适合伪狂犬疫情的大面积快速 检测普查，适用于各实验室、动物疫病预防控制中心以及条件具备的大中型养殖场。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为本发明试剂盒及方法特异性试验电泳图； 图中Μ为DL2000 DNA分子质量标准，1为Batha-k61伪狂犬基因缺失疫苗株，2为伪狂 犬野毒SXHX13株，3为PCV-2毒株，4为PPV毒株，5为猪癌兔化弱毒活疫苗毒株，6为猪繁 殖与呼吸综合征弱毒疫苗毒株，7为猪流行性腹泻病毒SXJY12毒株。
[0018] 图2为本发明试剂盒及方法灵敏度试验电泳图； 图中Μ为DL2000 DNA分子质量标准，1-9为伪狂犬野毒SXHX13株DNA梯度稀释，浓度 范围为 278X10^^ · Γ1 ?278Xl(T9pg · L'
[0019] 图3为本发明试剂盒对部分临床样品检测结果； 图中Μ为DL2000 DNA分子质量标准，1-7为部分组织病料检测结果，其中3、6为疫苗毒 阳性结果；1、2、4、5、7为伪狂犬野毒阳性结果。
【具体实施方式】
[0020] 实施例1 1、引物的设计与制备 参考GenBank上公布的PRV全基因组序列，结合本课题组数年研究测定的PRV基因序 列，用DNAStar生物软件综合分析比对，针对gD、gE基因设计了 8条引物PRgD-lF、PRgD-lR、 PRgE-lF、PRgE-lF、PRgD-2F、PRgD-2R、PRgE-2F 和 PRgE-2F，引物的序列如下： PRgD-lF :5' - TAAAATTGGGTCGGCGTCC-3' PRgD-lR:5, - CGCCCTCAGGAATCGGAC -3， PRgE-lF :5' - GTTCAGAGCATGCGCCGG -3' PRgE-lR:5, - CGACAGCAGCCAGACGC -3， PRgD-2F :5' - GACCGAGCACGAGGTGCG-3' PRgD-2F :5, - GTCCACGCGCGCCTTGA -3， PRgE-2F :5, - ATCGCGATCGGCGAGTCA -3， PRgE-2R:5' - CGAGTCGAGCGTGCCACTA -3' 上述引物由生工生物工程(上海）股份有限公司合成。
[0021] 2、阴、阳性对照的制备 阴性对照为本实验室培养的正常PK-15细胞上清液，阳性对照为gE基因缺失疫苗株 Batha_k61细胞培养液。
[0022] 3、试剂盒的制备 本试剂盒由以下组分组成： ①一扩反应混合液：由灭菌三蒸水、2XGC Buffer、10m mol · Ι/ΜΝΤΡ^δ μ mol · I71 PRgD-lF 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgD-lR 下游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-lF 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-lR下游引物、5U/y L rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为7 :12. 5 : 1 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5,共计 23 μ L，50 个反应共计 1150μ L，装成 1 管。
[0023] ②二扩反应混合液：由灭菌三蒸水、2XGC Buffer、10m mol · ΓΜΝΤΡ、25 μ mol · Γ1 PRgD-2F 上游弓丨物、25 μ mol · Γ1 PRgD_2R 下游弓丨物、25 μ mol · Γ1 PRgE_2F 上 游引物、25 ymol.I^PRgEIR下游引物、5U/yL rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比 为 7 :12· 5 :1 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5,共计 23 μ L，50 个反应共计 1150μ L，装成 1 管。
[0024] ③阴性对照：为正常ΡΚ-15细胞培养上清液，每个反应需对照250 μ L，50个反应共 计12500 μ L，分装10管，每管1250 μ L。
[0025] ④阳性对照：为gE基因缺失疫苗Batha_k61株ΡΚ-15细胞培养液，每个反应需对 照250 μ L，50个反应共计12500 μ L，分装10管，每管1250 μ L。
[0026] 本发明试剂盒保存条件为_20°C。
[0027] 实施例2 1、引物的设计与制备 同实施例1。
[0028] 2、组织病料样品的处理与DNA提取 ①取疑似猪伪狂犬病的组织病料如扁桃体、脑或肺脏:T5g，剪碎成糊状，加 5倍无菌 PBS，用组织研磨器充分研磨，收集悬液，4 °C、12000 r/min离心15min，取上清液100 μ L加 入到无菌ΕΡ管，同时做试剂盒中提供的阴、阳性对照，给以上各管中加入1000yL DNAzol Reagent,颠倒混勻后于4°C静置5 min。
[0029] ②4°C、12000 r/min离心10min，上清液600 μ L转移至另一洁净EP管中，加入 500 μ L无水乙醇，颠倒混勻，室温放置5min。
[0030] ③4°C、12 000 r/min离心5min，取出EP管，弃去上清液，加入1 mL 75%乙醇沉 淀，4°C、12000 r/min离心2min，反复洗漆2次。
[0031] ④最后弃去上清液，倒置EP管干燥DNA,干燥后用40 μ L的8mmol/L NaOH溶 解，-20°C保存备用。
[0032] 3、用本发明试剂盒鉴别检测PRV。
[0033] ①吸取一扩混合液23 μ L，加入DNA溶液2 μ L，混合均匀进行PCR扩增，反应条 件为95 1：预变性51^11，941：，60;621：，6〇8;721：6〇8共进行35个循环，最后721：延伸 10min〇
[0034] ②吸取二扩混合液23 μ L，加入一扩产物2 μ L，混合均匀进行PCR扩增，反应条件 为 95 °C 预变性 5min，94 °C 60 s，65 °C 60 s，72 °C 60 s 共进行 35 个循环，最后 72 °C 延伸lOmin ;即得到扩增产物。
[0035] 实施例3 1、引物的设计与制备 同实施例1。
[0036] 2、血清样品的处理与DNA提取 ①取分离得到待检猪血清1〇〇 μ L加入到无菌的EP管，同时做试剂盒中提供的阴、阳性 对照，给以上各管中加入1000 μ L DNAzol Reagent,颠倒混勻后于4°C静置5 min。
[0037] ②4°C、12000 r/min离心lOmin，上清液600yL转移至另一洁净EP管中，加入 500 μ L无水乙醇，颠倒混勻，室温放置5min。
[0038] ③4°C、12000 r/min离心5min，取出EP管，弃去上清液，加入1 mL 75%乙醇沉淀， 4°C、12000 r/min离心2min，反复洗漆2次。
[0039] ④最后弃去上清液，倒置EP管干燥DNA,干燥后用40 μ L的8mmol/L NaOH溶 解，-20°C保存备用。
[0040] 3、用本发明试剂盒鉴别检测PRV ①吸取一扩混合液23 μ L，加入DNA溶液2 μ L，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95 °C预变性 5min，94°C，60s ;62°C，60s ;72°C ;60s 共进行 35 个循环，最后 72 °C延伸 10 min。
[0041] ②吸取二扩混合液23 μ L，加入一扩产物2 μ L，混合均匀进行PCR扩增，反应条件 为95 °C预变性5min，94 °C 60s，65 °C 60s，72 °C 60s共进行35个循环，最后72 °C延伸 10 min ;即得到扩增产物。
[0042] 实施例4 1、引物的设计与制备 同实施例1。
[0043] 2、全血样品的处理与DNA提取 ①取待检猪全血100 μ L加入到无菌无 RNA酶的EP管，同时做试剂盒中提供的阴、阳性 对照，给以上各管中加入1〇〇〇1^1^0嫩2〇11^386111:，颠倒混勻后于41€静置5111；[11。
[0044] ②4°C、12000 r/min离心lOmin，上清液600 μ L转移至另一洁净ΕΡ管中，加入 500 μ L无水乙醇，颠倒混勻，室温放置5min。
[0045] ③4°C、12 000 r/min离心5min，取出EP管，弃去上清液，加入lmL 75%乙醇沉淀， 4°C、12000 r/min离心2min，反复洗漆2次。
[0046] ④最后弃去上清液，倒置EP管干燥DNA,干燥后用40 μ L的8mmol/L NaOH溶 解，-20°C保存备用。
[0047] 3、用本发明试剂盒鉴别检测PRV ① 吸取一扩混合液23 μ L，加入DNA溶液2 μ L，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95 °C预变性 5min，94 °C，60s;62°C，60s，72°C 60s 共进行 35 个循环，最后 72 °C延伸 lOmin; ② 吸取二扩混合液23 μ L，加入一扩产物2 μ L，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95 °C预变性 5 min，94 °C，60 s;65 °C，60 s;72 °C，60 s 共进行 35 个循环，最后 72 °C延 伸10min ;即得到扩增产物。
[0048] 结果判定 1、 称取l.Og琼脂糖，加入100mL 1XTAE缓冲液中，微波炉中加热融化，加入5yL (100mg/mL)溴化乙锭均勻混合，倒入水平放置的凝胶盘中，胶板厚度为5mm，待冷却凝固后 拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入1XTAE缓冲液淹没胶面； 2、 分别取5 μ L上述实施例2~4所得PCR扩增产物和上样缓冲液均匀混合，加入加样孔 中，同时加5 μ L DL2000 DNA分子量标准； 3、 电压80 V?100V，或电流40 mA?50mA，电泳30min; 4、 取出凝胶，置入紫外分析仪中观察，或置入凝胶成像系统中观察照相； 5、以DL2000 DNA分子质量标准作为参照，阴性对照不出条带，阳性对照出217bp -个 条带，说明对照成立；样品中出现217bp、354bp两个条带，即为伪狂犬野毒株感染；样品出 217bp -个条带，即为gE基因缺失疫苗毒株。
【权利要求】
1. 鉴别伪狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株复合套式聚合酶链式反应诊断试剂盒， 其特征在于，该试剂盒由一扩反应混合液、二扩反应混合液、阴性对照和阳性对照组成； 所述一扩反应混合液由灭菌三蒸水、2XGC Buffer、10m mol · Ι/ΜΝΤΡ^δ μ mol · I71 PRgD-lF 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgD-lR 下游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-lF 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-lR下游引物、5U/y L rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为7 :12. 5 : 1 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5,共计 23 μ L，50 个反应共计 1150μ L，装成 1 管； 所述二扩反应混合液由灭菌三蒸水、2XGC Buffer、10m mol.I/MNTPJS μπιο?·!/1 PRgD-2F 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgD-2R 下游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-2F 上游引物、25 μ mol · Γ1 PRgE-2R下游引物、5U/y L rTaq DNA聚合酶组成，每个反应体积比为7 :12. 5 : 1 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5 :0· 5,共计 23 μ L，50 个反应共计 1150μ L，装成 1 管； 所述阴性对照为ΡΚ-15正常细胞培养上清液； 所述阳性对照为gE基因缺失疫苗株Batha_k61细胞培养液； 其中，所述的引物 PRgD-lF 序列为：5' - TAAAATTGGGTCGGCGTCC-3' 所述的引物 PRgD-lR 序列为：5' - CGCCCTCAGGAATCGGAC -3' 所述的引物 PRgE-lF 序列为：5' - GTTCAGAGCATGCGCCGG -3' 所述的引物 PRgE-lR 序列为：5' - CGACAGCAGCCAGACGC -3' 所述的引物 PRgD_2F 序列为：5' - GACCGAGCACGAGGTGCG-3' 所述的引物 PRgD_2F 序列为：5' - GTCCACGCGCGCCTTGA -3' 所述的引物 PRgE_2F 序列为：5' - ATCGCGATCGGCGAGTCA -3' 所述的引物 PRgE_2R 序列为：5' - CGAGTCGAGCGTGCCACTA -3' 所述的引物 PRgE_2F 序列为：5' - ATCGCGATCGGCGAGTCA -3' 所述的引物 PRgE_2R 序列为：5' - CGAGTCGAGCGTGCCACTA -3'。
2. 如权利要求1所述鉴别伪狂犬gE基因缺失疫苗毒株和野毒株复合套式聚合酶链式 反应诊断试剂盒的检验方法，其特征在于：包括下列步骤 ： 1. DNAzol Reagent试剂法提取待检样品DNA，空气中自然干燥，用40 μ L 8mmol · L WaOH 溶解； 2) 取一扩混合液23 μ L，加入DNA溶液2 μ L，均匀混合后进行PCR扩增，反应条件为95 °C，预变性5 min，94 °C 60 s，62°C 60 s，72 °C 60 s共进行35个循环，最后72 °C延伸 10 min ; 3) 取二扩混合液23 μ L，加入二扩产物2 μ L，混合均匀进行PCR扩增，反应条件为95 °C 预变性5 min，94 °C 60 s，65 °C 60 s，72 °C 60 s共进行35个循环，最后72 °C延伸10 min ； 4) 10 g 琼脂糖凝胶中电泳； 5) 结果分析：阴性对照不出条带，阳性对照出217bp -个条带，说明对照成立；样品中 出现217bp -个条带，即为gE基因缺失疫苗毒株；样品出现217bp、354bp两个条带，即为伪 狂犬流行毒株感染。
【文档编号】C12Q1/70GK104152586SQ201410404463
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】吴旭锦, 朱小甫 申请人:咸阳职业技术学院