多形汉逊酵母突变菌株及多形汉逊酵母生产d-阿拉伯糖醇的方法
【专利摘要】本发明提供一种多形汉逊酵母突变菌株及多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法，主要是采用基因工程技术，通过构建多形汉逊酵母酸性磷酸酯酶基因突变菌株，获得一株D-阿拉伯糖醇的高产突变菌株。该方法成本低、生产周期短、易于操作，为解决D-阿拉伯糖醇来源短缺问题提供了新途径。本发明提供的突变菌株通过葡萄糖分批补料进行生物转化生产D-阿拉伯糖醇，其底物葡萄糖的转化率为51.2％，比利用出发菌株通过葡萄糖分批补料进行生物转化生产D-阿拉伯糖醇的底物葡萄糖的转化率显著提高。
【专利说明】多形汉逊酵母突变菌株及多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖 醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物发酵【技术领域】，具体涉及利用基因敲除方法敲除多形汉逊酵母酸 性磷酸酯酶基因而构建的突变菌株，并利用该突变菌株通过生物转化法生产D-阿拉伯糖 醇。
【背景技术】
[0002] D-阿拉伯糖醇是一种五碳糖醇，分子式为C5H1205，分子量为152. 12,是木糖醇和核 糖醇的同分异构体。它是一种有甜味的白色晶体，其熔点为l〇3°C，旋光度为130°，在空气 中有很强的吸湿性。糖醇是经糖还原的一类多元醇，由于具有低热值、抗龋齿、不影响胰岛 素水平等优点，其在医药、食品、化工等领域具有重要的应用价值。
[0003] 在食品领域中，D-阿拉伯糖醇可用作改善酒精饮料品质的添加剂和调制糖浆的基 质；在化工领域中，D-阿拉伯糖醇可用作影响高分子发泡材料合成过程的激活剂、保护显 影材料置于高温环境长期保存的稳定剂、提高铝电容器高温可靠性及其电解质溶液粘度的 增强剂和提高亲水涂层或颗粒性固体溶解的辅助剂等；在医药领域中，D-阿拉伯糖醇可作 为药物中间体用于生产1，4-二脱氧-1，4-亚胺基-D-阿拉伯糖醇，可作为α -葡萄糖苷酶 的抑制剂，也可用于防治艾滋病。
[0004] 目前，常规生产D-阿拉伯糖醇的方法主要是通过化学法合成，通过还原D-阿拉伯 糖或来苏糖得到。但是该方法反应过程复杂、设备要求高、环境污染严重、底物昂贵，致使 D-阿拉伯糖醇不能规模化生产。针对化学合成法的缺点，通过生物转化法生产D-阿拉伯糖 醇，其反应条件温和、生产工艺简单，因而从长远考虑，该方法最有潜力。生物转化法是将细 胞生长一定的浓度后添加底物（葡萄糖），利用细胞中的酶系反应合成D-阿拉伯糖醇，该方 法产物单一、提取简单、对反应设备和条件要求低。
[0005] 截止目前，可用于生产D-阿拉伯糖醇的菌株，主要包括曲霉菌属（Aspergillus)、 假丝酵母属（Candida)、德巴利氏酵母属（Debaryomyces)、拟内袍霉属（EndomycoPsis)、 小丛梗袍属（Moniliella)、汉逊酵母属（Hansenula)、毕赤母属（pichia)、接合酵母 属（Zygosaccharomyces)。值得注意的是，汉逊酵母属中多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha)是当前国际公认的理想细胞工厂（Gellsissen，kunze et al.2005)。多形汉 逊酵母最适生长温度高（37?43°C )，生长速率快，易于大规模高密度发酵，易于培养，能在 廉价培养基中高密度生长。但是，大部分产D-阿拉伯糖醇的酵母菌株对底物葡萄糖的转化 率较低，多数酵母菌株的转化葡萄糖产D-阿拉伯糖醇的底物葡萄糖的转化率介于10%? 40%之间，并且普遍存在甘油及其他多元醇副产物。
[0006] 酵母的酸性磷酸酯酶（acid phosphatase, PH01)参与无机磷的输送，当该酶缺失 时，胞内的磷质量浓度不够，使糖酵解途径中的关键酶的活性受到影响，因而不能利用葡萄 糖产甘油。因此，当酸性磷酸酯酶缺失时，培养基中葡萄糖可以主要用于D-阿拉伯糖醇的 转化生产（曹钰等· 1999)。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种多形汉逊酵母突变菌株以及多形汉逊酵母生产D-阿 拉伯糖醇的方法。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0009] 一种多形汉逊酵母突变菌株，该突变菌株为酸性磷酸酯酶基因（PH01，GenBank Accession NO. AF051161)突变菌株，酸性磷酸酯酶基因突变导致突变菌株的酸性磷酸酯酶 活性消失。
[0010] 所述突变菌株为敲除了酸性磷酸酯酶基因的多形汉逊酵母DL-1(ATCC No. 26012)。
[0011] 一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法，包括以下步骤：
[0012] 1)利用基因敲除方法构建一株多形汉逊酵母酸性磷酸酯酶基因突变菌株，该突变 菌株的酸性磷酸酯酶活性消失；
[0013] 2)采用葡萄糖分批补料发酵的方法，利用所述突变菌株生物转化生产D-阿拉伯 糖醇。
[0014] 所述步骤1)具体包括以下步骤：
[0015] a)构建基因敲除质粒pMD18-PH0-kanMX，pMD18-PH0-kanMX的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，以pMD18-PH0-kanMX为模板，并分别采用PH0-L-U和pUG6-D组成的引物对 以及PUG6-U和PH0-R-D组成的引物对，利用PCR方法扩增酸性磷酸酯酶基因敲除片段， PH0-L-U的核苷酸序列如SEQ. ID. N0. 2所示，pUG6-D的核苷酸序列如SEQ. ID. N0. 6所示， PUG6-U的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 7所示，PH0-R-D的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，将 所述敲除片段采用电穿孔法转化多形汉逊酵母DL-1 ;
[0016] b)利用高磷培养基显色筛选法从转化后的多形汉逊酵母DL-1中获得初筛菌株， 然后以初筛菌株基因组为模板，并分别采用PH0-Y-U和pUG6-D组成的引物对以及pUG6-U 和PH0-Y-D组成的引物对，利用PCR方法筛选突变菌株，当采用PH0-Y-U和pUG6-D组成的 引物对以及PUG6-U和PH0-Y-D组成的引物对均扩增出片段时，所对应的初筛菌株为突变菌 株，PH0-Y-U的核苷酸序列如SEQ. ID. N0. 8所示，PH0-Y-D的核苷酸序列如SEQ. ID. N0. 9所 /_J、1 ο
[0017] 所述高磷培养基的组成包括5g/L的硫酸铵、100g/L的葡萄糖、0. 5g/L的硫酸镁， 〇. lg/L的氯化钙、500 μ g/L的硼酸、40 μ g/L的硫酸铜，100 μ g/L的碘化钾，200 μ g/L的氯 化铁，400 μ g/L的硫酸锰、200 μ g/L的钥酸铵、400 μ g/L的硫酸锌、500mg/L的磷酸二氢钾 以及15g/L的琼脂；高磷培养基显色筛选的显色剂的制备方法为：将α -萘酚磷酸盐、固蓝 盐Β和琼脂溶解于0. 05mol/L醋酸水溶液中得混合物，混合物中α -萘酚磷酸盐的浓度为 5mg/mL，固蓝盐Β的浓度为50mg/mL，琼脂的浓度为10mg/mL，依据高磷培养基上菌落颜色变 化，挑选出白色菌落，得初筛菌株。
[0018] 所述步骤2)具体包括以下步骤：
[0019] 种子培养：将突变菌株接种于50?100mL种子培养基中并于28?37°C以及 100?200r/min条件下培养14?24h得种子液；
[0020] 发酵培养：将种子液按5?10% (v/v)的接种量接种于300?500mL发酵培养基 中并于28?37°C以及100?200r/min条件下连续培养，发酵培养基含有作为生物转化的 底物的葡萄糖，连续培养期间分批补加葡萄糖。
[0021] 所述种子培养基的组成包括4?10g/L的酵母浸粉、10?20g/L的葡萄糖以及 10?20g/L的蛋白胨，pH为6. 0。
[0022] 所述发酵培养基的组成包括5?10g/L的酵母浸粉、10?20g/L的葡萄糖、10? 20g/L的蛋白胨，0. 5?2. 5g/L的硫酸镁，1?3g/L的磷酸二氢钾，0. 1?0. 5g/L的氯化 钙以及〇. 75?3. 75g/L的硫酸铵，pH为6. 0,种子液接种于发酵培养基后连续培养96? 144h，连续培养期间每隔24?28h补加50?60g/L的葡萄糖。
[0023] 所述发酵培养基的组成包括10g/L的酵母浸粉、20g/L的葡萄糖、20g/L的蛋白胨， 2. Og/L的硫酸镁，1. 5g/L的磷酸二氢钾，0. 3g/L的氯化钙以及2. 35g/L的硫酸铵。
[0024] 所述分批补加葡萄糖的具体步骤为：种子液接种于发酵培养基后于37°C以及 160r/min下培养24h，然后加入50g/L的葡萄糖，然后继续在37°C以及160r/min下培养并 每隔24h加入50g/L的葡萄糖。
[0025] 本发明的有益效果体现在：
[0026] 本发明通过基因敲除方法构建多形汉逊酵母酸性磷酸酯酶基因突变菌株，结合葡 萄糖分批补料发酵方法以提高底物葡萄糖的转化率，从而实现高效生产D-阿拉伯糖醇的 目的，显著的提高了多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的产率。本发明所述突变菌株通过葡 萄糖分批补料进行生物转化生产D-阿拉伯糖醇，其底物葡萄糖的转化率为51. 2%，比利用 出发菌株通过葡萄糖分批补料进行生物转化生产D-阿拉伯糖醇的转化率（33. 7 % )提高了 51. 9%。本发明所述方法成本低、生产周期短、易于操作，为解决D-阿拉伯糖醇来源短缺问 题提供了新途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为步骤1. 1中PCR扩增结果的电泳图谱，其中，1 :以PH0-L-U和PH0-L-D进行 扩增的结果（PH01基因的左同源臂）；2 :以PH0-R-U和PH0-R-D进行扩增的结果（PH01基 因的右同源臂）；3 :空白对照，以ddH20为模板，以PH0-L-U和PH0-L-D为引物；M :Marker ;
[0028] 图2为步骤1. 2中PCR扩增结果的电泳图谱，其中，1 :同源臂组合片段，2 :空白对 照，以 ddH20 为模板；M :Marker ;
[0029] 图3为步骤2. 1中PCR扩增结果的电泳图谱，其中，1 :以pUG6-U和PH0-R-D进行 扩增的结果（5'截断的KanMX抗性基因和PH01基因右同源臂）；2:以PH0-L-U和pUG6-D 进行扩增的结果（PH01基因左同源臂和3'截断的KanMX抗性基因）；M :Marker ;
[0030] 图4为步骤2. 3中PCR扩增结果的电泳图谱，其中，1 :以出发菌株基因组为模板 的PCR扩增反应，引物为pUG6-U和PH0-Y-D ;2 :以PH01基因突变菌株基因组为模板的PCR 扩增反应，引物为PUG6-U和PH0-Y-D ;3 :以出发菌株基因组为模板的PCR扩增反应，引物为 PH0-Y-U和pUG6-D ;4 :以PH01基因突变菌株基因组为模板的PCR扩增反应，引物为PH0-Y-U 和 pUG6-D ;M :Marker。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。实施例用于说明本发明，但不用来 限制本发明的范围。
[0032] 本发明的目的之一是提供多形汉逊酵母酸性磷酸酯酶基因（PH01)突变菌株。
[0033] 本发明的目的之二是提供利用该突变菌株生物转化生产D-阿拉伯糖醇的方法。
[0034] 本发明的目的之三是提供该突变菌株在生物转化生产D-阿拉伯糖醇中的应用。 [0035] 利用基因工程方法，构建基因敲除质粒pMD18-PH0-kanMX，利用PCR方法扩增PH01 基因敲除片段，结合常规电转化方法转化多形汉逊酵母，利用高磷培养基显色筛选方法和 PCR方法对突变菌株进行筛选；将筛选出来的突变菌株进行发酵培养，利用HPLC测定发酵 液中D-阿拉伯糖醇的含量，并计算突变菌株的底物葡萄糖的转化率。
[0036](一）突变菌株的构建和筛选
[0037] 本发明将以基因敲除质粒pMD18-PH0_kanMX为模板，并利用PCR方法扩增的PH01 基因敲除片段，采用电转化方法导入多形汉逊酵母，通过筛选得到酸性磷酸酯酶基因突变 菌株。具体说明如下：
[0038] 1、质粒 pMD18-PH0_kanMX 的构建
[0039] (1. 1)以多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha)DL-1(ATCC No. 26012)为 出发菌株，以多形汉逊酵母DL-1的基因组DNA为模板（基因组提取方法参考Dymond JS.Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 2013 ;529:153-60)，分别利用 PH0-L-U 和 PH0-L-D 以及 PH0-R-U 和 PH0-R-D 组成 的引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物（PH01基因左同源臂，为470bp ;PH01基因右同 源臂，为572bp)。
[0040] 反应体系 25 μ L :10*PCR 反应缓冲液 2. 5 μ L，dNTP (各 10mM) 1. 0 μ L，Taq 聚 合酶（1U) 1· 0 μ L，引物（浓度为10 μ M)各1· 5 μ L，模板（浓度为2 μ g/mL) 2· 0 μ L， ddH2015. 5μ L ；
[0041] 反应程序：95°C 5min ;循环 30 次：94°C 30s，50°C 45s，72°C lmin ;72°C 10min。扩 增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，可以看到所扩增产物分别为470bp 和572bp左右的目的片段。
[0042] 所述引物为：
[0043] PH0-L-U :5' -GTAATATGCAAGCTGCTGG-3'（序列表 SEQ. ID. N0. 2)
[0044] PH0-L-D ：
[0045] 5' -ATGAGTCCAAGAGCAGTGATGCGGCCGCGCATGAACAATTGGGCCT-3,(参见 SEQ. ID. NO. 3)
[0046] 所述PH0-L-D由三部分组成，具体为：其3'端为用于扩增左同源臂的序列，中间是 Notl限制性酶酶切位点，下划线标注Notl酶切位点，5'端序列是引物PH0-R-U的互补序列。
[0047] PH0-R-U :5, -ATCACTGCTCTTGGACTCAT-3,（序列表 SEQ. ID. N0. 4)
[0048] PH0-R-D :5, -ACTTCCCCCATATGCCTT-3'（序列表 SEQ. ID. Ν0· 5)
[0049] (1.2)将步骤（1. 1)获得的PH01基因的左同源臂和右同源臂1:1(体积比）混合 后作为模板，以PH0-L-U和PH0-R-D组成的引物对，进行PCR扩增，获得同源臂组合片段。
[0050] 反应体系 25 μ L :10*PCR 反应缓冲液 2. 5 μ L，dNTP (各 10mM) 1. 0 μ L，Taq 聚 合酶（1U) 1· 0 μ L，引物（浓度为10 μ M)各1· 5 μ L，模板（浓度为2 μ g/mL) 2· 0 μ L，， ddH2015. 5μ L ；
[0051] 反应程序：95°C 5min ;循环 30 次：94°C 30s，52°C 45s，72°C lmin ;72°C lOmin。扩 增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，可以看到所扩增产物为1022bp左右 的目的片段。
[0052] (1. 3)将步骤（1. 2)获得的同源臂组合片段和pMD18-T通过TA克隆方法进行连接 获得质粒 pMD18-PH0(3714bp)。
[0053] (1. 4)用限制性内切酶Notl酶切pUG6质粒，回收约1619bp的片段（含有kanMX 抗性基因）。
[0054] (1.5)用限制性内切酶Notl酶切pMD18-PH0并进行脱磷酸化后与步骤（1.4) 回收的约1619bp的片段连接，得到质粒pMD18-PH0-kanMX(即将左同源臂序列、Notl酶 切pUG6质粒所得的1619bp序列以及右同源臂序列插入pMD18-T的t位点）。所述质粒 pMD18-PH0-kanMX序列长度为5333bp，具体核苷酸序列如下（序列表SEQ. ID. N0. 1)，由 PMD18-T的起始位点开始：
[0055] TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTC TGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAAC TATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAA ATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTAT TACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGT TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATGTAATATGCAAGCTGCTGGAACGACTAGC ACTTTCGATGCAGTATAGAGACAGAAGGGGATCTTTGTAGGGCAGTTTTGGGCCGGAATACGCCTAATTCATCACAC GTGCTAAAAATTATTGTGGTGTACAATACTGCATGCAATATATTCACCCGGAATAGTAATGCTAAAATAAAAAATAA CCTTTGATACTCCACTATAAATATGGTCAATCTACCTCACTCTTGACCTCAATGTTTTCCTTTGCAACGACACTTCT AGTTGGCGCCATTGTGGCCAATGGGCTCATCTTGCACCCTGGCTACGACCAGGTTGCCACAGACCAGTATAACTTAC TCAAGTTCATGATCGGCGCTGGTCCCTTTGTCGAGCATAGTGGGTTTGGCATTCCACTTGACACTCCTCCTCATTGT GAAATTGAACAGGCCCAATTGTTCATGCGCGGCCGCCAGCTGAAGCTTCGTACGCTGCAGGTCGACAACCCTTAATA TAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGCCTCGTCCCCGCCGGGTCA CCCGGCCAGCGACATGGAGGCCCAGAATACCCTCCTTGACAGTCTTGACGTGCGCAGCTCAGGGGCATGATGTGACT GTCGCCCGTACATTTAGCCCATACATCCCCATGTATAATCATTTGCATCCATACATTTTGATGGCCGCACGGCGCGA AGCAAAAATTACGGCTCCTCGCTGCAGACCTGCGAGCAGGGAAACGCTCCCCTCACAGACGCGTTGAATTGTCCCCA CGCCGCGCCCCTGTAGAGAAATATAAAAGGTTAGGATTTGCCACTGAGGTTCTTCTTTCATATACTTCCTTTTAAAA TCTTGCTAGGATACAGTTCTCACATCACATCCGAACATAAACAACCATGGGTAAGGAAAAGACTCACGTTTCGAGGC CGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCG ACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGA TGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTA CTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGAT TCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTT TAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTG ATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCA GTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGG ACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTAC AGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAG TTTTTCTAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCTTGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTA GTTGTTCTATTTTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTCGCCTCGACATCATCTGCCCAGATGCGAAGTT AAGTGCGCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTGCTGTCGATTCGATACTAAC GCCGCCATCCAGTGTCGAAAACGAGCTCTCGAGAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT TAGGTGATATCAGATCCACTAGTGGCCTATGCGGCCGCATCACTGCTCTTGGACTCATCACCGATACCGAGTTGGGA ACAGAAGACGTGGATTTCCACCGAAGTTTCAAAACCTCTGAGCTCGTTCCTCAAGGAGCCAGACTGATTATTGAGAA ACTTAACTGTTCTGACACGTCGTTTGTGAGAACCATTCTGAACGACAAGGTGTACCCTGTTCCAGGATGTTCTTCAG GACCGGGTTACTCTTGTCCACTGGAGGACTACCTGGACATTATAACTCCAGAGGTTGACTATGCCTCCGCCTGTGAG CTTCCAGACGATGCCCCTAAGGAAATTAGCTTTTACTGGGACTGGAAGCCGACCTTTGAGAACAACTAAATACCAAT GCAGAGCGAGCTGGTTCTGCGAGTTATATTCAGTAGCACTTTAGATGCTACGGAAACGAAGTTCTTGAACAATAAAA ATCGTCTGATATTCAAGAGTAAGTTCTAATTTATTGACCTATAGCTTAGATTCTCTCTGGTTGTAGCTAGCGACAC ACTCCAGTTCGACTTTCACTTGCTTGTTAGGGAATCCCACAACGCAAGATCTAGAAGGCATATGGGGGAAGTATCTC TAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC ACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATT AATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCG CGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTG CGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACAT GTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCC CTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTT CCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTC GGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCT GTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGA CACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTT CTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCT TCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAG CAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGA AAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAA GTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATC TCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTT ACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGC CAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAA GCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTC GTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAA AAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCA GCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATT CTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAA CTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGT TCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAAC AGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAAT ATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATA GGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAA AAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC
[0056] 质粒 pUG6 :带有 kanMX 筛选标记，购自 Eurosacrf (Frankfurt，Germany ; http://web. uni-frankfurt.de/fbl5/mikro/euroscarf/data/pUG6.txt)(见 Guld ener, U. , Heck, S. , Fielder, T. , Beinhauer, J. , and Hegemann, J. H. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res.24 (13)，2519-2524(1996))。
[0057] pMD18_T购自宝生物工程（大连）有限公司。
[0058] 2、突变菌株的构建
[0059] (2. 1)以质粒 pMD18-PH0-kanMX 为模板，分别以 PH0-L-U 和 pUG6-D 以及 pUG6-U 和 PH0-R-D组成的引物对进行PCR扩增，获得PCR扩增产物（分别为PH01基因左同源臂和3' 截断的KanMX抗性基因，约1544bp，和5'截断的KanMX抗性基因和PH01基因右同源臂，约 1565bp)。
[0060] 反应体系 25 μ L :10*PCR 反应缓冲液 2. 5 μ L，dNTP (各 10mM) 1. 0 μ L，Taq 聚 合酶（1U) 1· 0 μ L，引物（浓度为10 μ M)各1· 5 μ L，模板（浓度为2 μ g/mL) 2· 0 μ L， ddH2015. 5μ L ；
[0061] 反应程序：95°C 5min ;循环 30 次：94°C 30s，53°C 30s，72°C lmin ;72°C lOmin。扩 增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，可以看到所扩增产物分别为1544bp 和1565bp左右的目的片段。
[0062] PH0-L-U :5' -GTAATATGCAAGCTGCTGG-3'
[0063] pUG6-D :5, -TCCCCTCGTCAAAAATAAG-3'（序列表 SEQ. ID. N0. 6)
[0064] pUG6-U :5, -TGAAACATGGCAAAGGTAGC-3,（序列表 SEQ. ID. Ν0· 7)
[0065] PH0-R-D :5' -ACTTCCCCCATATGCCTT-3'
[0066] (2. 2)将步骤（2. 1)获得的PCR扩增产物（1544bp条带以及1565bp条带） 利用电穿孔法（电击参数为1.(^ν，100Ω，50μΡ)转化多形汉逊酵母DL-1(感受态 细胞制备方法参考 Faber, K.N.，Haima, P·，Harder, W.，Veenhuis，M.，Ab，G·，1994. Highly-efficient electrotransformation of the yeast Hansenula polymorpha. Curr. Genet. 25, 305 - 310.)，然后将多形汉逊酵母DL-1涂布于高磷培养基固体平板上，37°C恒 温培养48h后，在其表面滴加一层50°C的显色剂，37°C恒温静置60min后观察菌落颜色变 化。若产生酸性磷酸酯酶，菌落会变为深红色；若无酸性磷酸酯酶产生，则菌落仍为白色。 依据菌落颜色变化，挑选出白色菌落，获得初筛突变菌株。
[0067] 所述高磷培养基配方：硫酸铵5g/L，葡萄糖100g/L，硫酸镁0. 5g/L，氯化钙0. lg/ L，硼酸500 μ g/L，硫酸铜40 μ g/L，碘化钾100 μ g/L，氯化铁200 μ g/L，硫酸锰400 μ g/L，钥 酸铵200 μ g/L，硫酸锌400 μ g/L，磷酸二氢钾500mg/L，琼脂15g/L。
[0068] 显色剂：将α -萘酚磷酸盐（Sigma)、固蓝盐B和琼脂溶解于0. 05mol/L醋酸水溶 液中得混合物，混合物中α -萘酚磷酸盐的浓度为5mg/mL，固蓝盐B的浓度为50mg/mL，琼 脂的浓度为10mg/mL，显色剂pH为4. 0。
[0069] (2. 3)以步骤（2. 2)获得的初筛突变菌株的基因组为模板（基因组提取方法参 考 Dymond JS.Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 2013 ;529:153-60)，以PHO-Y-U和pUG6-D 以及pUG6-U和PHO-Y-D组成的引物对分 别进行PCR扩增分析，其中引物PHO-Y-U和PHO-Y-D分别位于左右同源臂的外侧，因此只有 PH01基因发生正确突变才能扩增出目的基因片段，如果没有发生正确突变则不能扩增出任 何基因片段。
[0070] 反应体系 25 μ L :10*PCR 反应缓冲液 2. 5 μ L，dNTP (各 10mM) 1. 0 μ L，Taq 聚 合酶（1U) 1· 0 μ L，引物（浓度为10 μ M)各1· 5 μ L，模板（浓度为2 μ g/mL) 2· 0 μ L，， ddH2015. 5μ L ；
[0071] 反应程序：95°C 5min ;循环 30 次：94°C 30s，50°C 45s，72°C lmin ;72°C 10min。扩 增产物使用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，当采用PHO-Y-U和pUG6-D组成的引物对以及pUG6-U 和PH0-Y-D组成的引物对均扩增出片段时，所对应的初筛突变菌株为目标突变菌株（记为 多形汉逊酵母Hpphol Λ )，如图4所示，分别获得1582bp片段和1603bp片段，而出发菌株 未能扩增出片段。
[0072] PH0-Y-U :5, -AGCAATACCCAGACTCGA-3'（序列表 SEQ. ID. N0. 8)
[0073] PHO-Y-D :5, -TAAGGATGCTGCCACTGTCA-3,（序列表 SEQ. ID. Ν0· 9)
[0074] (二）出发菌株的摇瓶发酵实验（葡萄糖一次加入法）
[0075] 1、种子培养
[0076] 将斜面保藏的多形汉逊酵母DL-1 (ATCC No. 26012)在37°C活化3?4h后，取一 环，接种至装有50mL种子培养基的摇瓶中，然后在37°C、160r/min振荡培养18h得种子液。
[0077] 所述种子培养基配方为：酵母浸粉5g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，pH = 6. 0。
[0078] 2、发酵培养
[0079] 将种子液按5%的接种量接种至装有500mL发酵培养基的3L的三角瓶中，置于 37°C、160r/min连续发酵培养144h，收集发酵液。用HPLC测定胞外D-阿拉伯糖醇的含量 和葡萄糖的残留量，计算底物葡萄糖的转化率为22. 1%。
[0080] 所述发酵培养基的配方为：酵母浸粉5g/L，葡萄糖400g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁 2. 5g/L，磷酸二氢钾 3g/L，氯化钙 0· 5g/L，硫酸铵 3. 75g/L，pH = 6. 0。
[0081] 所述HPLC测定发酵液中D-阿拉伯糖醇的含量和葡萄糖的残留量的分析条件为： 色谱柱：SH1011 ;流动相：0· 01mol/L H2S04 ;流速：0· 8mL/min ;进样量：5 μ L ;柱温：50°C ;检 测器：示差检测器（RID)。
[0082] 根据葡萄糖到D-阿拉伯糖醇的反应式：
[0083] D-Glucose+ATP+NAD (P) ++H20 - D-Arabitol+ADP+Pi+NAD (P) H+C02
[0084] 所述底物葡萄糖的转化率=D_阿拉伯糖醇的含量八葡萄糖总加入量一葡萄糖残 留量）X100%
[0085] (三）出发菌株的摇瓶发酵实验（葡萄糖分批补料）
[0086] 1、种子培养
[0087] 将斜面保藏的多形汉逊酵母DL-1 (ATCC No. 26012)在37°C活化3?4h后，取一 环，接种至含50mL的种子培养基的摇瓶中，然后在37°C、160r/min振荡培养18h得种子液。
[0088] 所述种子培养基配方为：酵母浸粉10g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，pH = 6. 0。
[0089] 2、发酵培养
[0090] 将种子液按5%的接种量接种至装有500mL发酵培养基的3L三角瓶中，置于 37°C、160r/min培养24h后开始添加葡萄糖，每隔24h加入50g/L的葡萄糖，连续发酵144h， 收集发酵液。用HPLC测定胞外D-阿拉伯糖醇的含量和葡萄糖的残留量，计算底物葡萄糖 的转化率为33. 7%。
[0091] 所述发酵培养基配方为：酵母浸粉l〇g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，硫酸镁 2. Og/L，磷酸二氢钾 1. 5g/L，氯化钙 0· 3g/L，硫酸铵 2. 35g/L，pH = 6. 0。
[0092] (四）突变菌株的摇瓶发酵实验（葡萄糖一次加入法）
[0093] 1、种子培养
[0094] 将筛选出来的多形汉逊酵母Hpphol Λ，取一环接种至装有50mL种子培养基的摇 瓶中，然后于37°C、160r/min振荡培养18h得种子液。
[0095] 所述种子培养基配方为：酵母浸粉5g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，pH = 6. 0。
[0096] 2、发酵培养
[0097] 将种子液按5%的接种量接种至装有500mL发酵培养基的3L的三角瓶中，置于 37°C、160r/min连续发酵培养144h。用HPLC测定D-阿拉伯糖醇的含量和葡萄糖的残留量， 计算底物葡萄糖的转化率为42. 7%。
[0098] 所述发酵培养基的配方为：酵母浸粉5g/L，葡萄糖400g/L，蛋白胨10g/L，硫酸镁 2. 5g/L，磷酸二氢钾 3g/L，氯化钙 0· 5g/L，硫酸铵 3. 75g/L，pH = 6. 0。
[0099] (五）突变菌株的摇瓶发酵实验（葡萄糖分批补料）
[0100] 1、种子培养
[0101] 将筛选出来的多形汉逊酵母Hpphol Λ，取一环接种至含50mL的种子培养基的摇 瓶中，然后于37°C、160r/min振荡培养18h得种子液。
[0102] 所述种子培养基配方为：酵母浸粉l〇g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，pH = 6. 0。
[0103] 2、发酵培养
[0104] 将种子液按5%的接种量接种至装有500mL发酵培养基的3L的三角瓶中，置于 37°C、160r/min培养24h后开始向三角瓶中添加葡萄糖，每隔24h加入50g/L的葡萄糖，连 续发酵培养144h。用HPLC测定D-阿拉伯糖醇的含量和葡萄糖的残留量，计算底物葡萄糖 的转化率为51.2%。
[0105] 所述发酵培养基配方为：酵母浸粉l〇g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，硫酸镁 2. 0g/L，磷酸二氢钾 1. 5g/L，氯化钙 0· 3g/L，硫酸铵 2. 35g/L，pH = 6. 0。
【权利要求】
1. 一种多形汉逊酵母突变菌株，其特征在于：该突变菌株为酸性磷酸酯酶基因突变菌 株，酸性磷酸酯酶基因突变导致突变菌株的酸性磷酸酯酶活性消失。
2. 根据权利要求1所述一种多形汉逊酵母突变菌株，其特征在于：所述突变菌株为敲 除了酸性磷酸酯酶基因的多形汉逊酵母DL-1。
3. -种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 利用基因敲除方法构建一株多形汉逊酵母酸性磷酸酯酶基因突变菌株，该突变菌株 的酸性磷酸酯酶活性消失； 2) 采用葡萄糖分批补料发酵的方法，利用所述突变菌株生物转化生产D-阿拉伯糖醇。
4. 根据权利要求3所述一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所 述步骤1)具体包括以下步骤： a) 构建基因敲除质粒pMD18-PH0-kanMX，pMD18-PH0-kanMX的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，以pMD18-PH0-kanMX为模板，并分别采用PHO-L-U和pUG6-D组成的引物对 以及PUG6-U和PH0-R-D组成的引物对，利用PCR方法扩增酸性磷酸酯酶基因敲除片段， PH0-L-U的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示，pUG6-D的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示， PUG6-U的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 7所示，PH0-R-D的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，将 所述敲除片段采用电穿孔法转化多形汉逊酵母DL-1 ; b) 利用高磷培养基显色筛选法从转化后的多形汉逊酵母DL-1中获得初筛菌株，然后 以初筛菌株基因组为模板，并分别采用PH0-Y-U和pUG6-D组成的引物对以及pUG6-U和 PH0-Y-D组成的引物对，利用PCR方法筛选突变菌株，当采用PH0-Y-U和pUG6-D组成的引物 对以及PUG6-U和PH0-Y-D组成的引物对均扩增出片段时，所对应的初筛菌株为突变菌株， PH0-Y-U的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 8所示，PH0-Y-D的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 9所示。
5. 根据权利要求4所述一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于： 所述高磷培养基的组成包括5g/L的硫酸铵、100g/L的葡萄糖、0. 5g/L的硫酸镁，0. lg/L 的氯化钙、500 μ g/L的硼酸、40 μ g/L的硫酸铜，100 μ g/L的碘化钾，200 μ g/L的氯化铁， 400 μ g/L的硫酸锰、200 μ g/L的钥酸铵、400 μ g/L的硫酸锌、500mg/L的磷酸二氢钾以及 15g/L的琼脂；高磷培养基显色筛选的显色剂的制备方法为：将α-萘酚磷酸盐、固蓝盐B 和琼脂溶解于〇. 〇5mol/L醋酸水溶液中得混合物，混合物中α -萘酚磷酸盐的浓度为5mg/ mL，固蓝盐B的浓度为50mg/mL，琼脂的浓度为10mg/mL，依据高磷培养基上菌落颜色变化， 挑选出白色菌落，得初筛菌株。
6. 根据权利要求3所述一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所 述步骤2)具体包括以下步骤： 种子培养：将突变菌株接种于种子培养基中并于28?37°C以及100?200r/min条件 下培养14?24h得种子液； 发酵培养：将种子液接种于发酵培养基中并于28?37°C以及100?200r/min条件下 连续培养，发酵培养基含有生物转化的底物葡萄糖，连续培养期间分批补加葡萄糖。
7. 根据权利要求6所述一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所 述种子培养基的组成包括4?10g/L的酵母浸粉、10?20g/L的葡萄糖以及10?20g/L的 蛋白胨。
8. 根据权利要求6所述一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所 述发酵培养基的组成包括5?lOg/L的酵母浸粉、10?20g/L的葡萄糖、10?20g/L的蛋白 胨，0. 5?2. 5g/L的硫酸镁，1?3g/L的磷酸二氢钾，0. 1?0. 5g/L的氯化钙以及0. 75? 3. 75g/L的硫酸铵，种子液接种于发酵培养基后连续培养96?144h，连续培养期间每隔 24?28h补加 50?60g/L的葡萄糖。
9. 根据权利要求8所述一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所 述发酵培养基的组成包括l〇g/L的酵母浸粉、20g/L的葡萄糖、20g/L的蛋白胨，2. Og/L的硫 酸镁，1. 5g/L的磷酸二氢钾，0. 3g/L的氯化钙以及2. 35g/L的硫酸铵。
10. 根据权利要求8所述一种多形汉逊酵母生产D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于： 所述分批补加葡萄糖的具体步骤为：种子液接种于发酵培养基后于37°C以及160r/min下 培养24h，然后加入50g/L的葡萄糖，然后继续在37°C以及160r/min下培养并每隔24h加 入50g/L的葡萄糖。
【文档编号】C12N1/16GK104195059SQ201410404466
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】钱卫东, 王婷, 毛培宏, 宁肖肖 申请人:陕西科技大学