一种发酵菌剂的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种发酵菌剂的制备方法，包括如下具体步骤：(1)将蒸熟的大米、麸皮、秸秆粉末、杨树木块混合，其重量比为：0.5～1.0∶1.5～3.0∶0.1～0.3∶0.3～0.8，获得培养基质；(2)在所述培养基质中接入黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和乳酸菌等产酶微生物，搅拌均匀；(3)将培养基质平铺散开，静置培养3～15天，获得发酵菌剂。本发明克服了微生物因环境变化和保存过程中菌株已发生变异或者退化的问题，保持了微生物产纤维素酶的能力，并且使用过程中可大大缩短微生物对外界环境的适应期，提高发酵效率。本发明的发酵菌剂为固体菌剂，更便于运输和储藏。
【专利说明】一种发酵菌剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于纤维基质利用领域，具体涉及一种发酵菌剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]我国纤维素资源非常丰富，每年可有10亿吨纤维素物质产生(包括秸杆、林业、采伐剩余物等)，虽然纤维素废弃物资源巨大，但是由于天然纤维素的利于途径有限，如果大量农作物秸杆和园林废弃物焚烧又会给大气带来严重的污染。近几年随着有机肥料行业的快速发展，农林废弃物常被用于有机肥生产原料。由于秸杆和树木枝杈的组成物质的特殊结构，化学处理过程需要高浓度的酸碱，会造成严重的二次污染。随着生物技术的发展，微生物发酵技术被越来越多的应用到该领域中，微生物发酵不需要太多设备，能量消耗低，反应条件温和，不需要高温、强碱等较为苛刻的条件。其原理是利用微生物分泌的纤维素酶系氧化分解纤维素、半纤维素和木质素等大分子物质，将其分解为小分子的聚合物和单糖等，这些小分子产物都是可被作物或土壤微生物直接吸收利用的营养物质。
[0003]目前国内普遍使用的发酵菌剂主要有两种形态:一种为液态菌剂，该种菌剂运输和保存条件要求较高，且多为单一菌剂，而自然环境中，对纤维素、木质素等成分的降解是多种微生物协同完成的，单一菌种的分解能力有限，且其使用过程中很容易被其它菌种污染；另一种为粉末状菌剂:该菌剂具有很好的携带性，多为复合微生物，但是活化过程中活化难度大，会因培养基的不同，而导致优势菌种的变化，活化得到的各菌种不能达到最优比例。但上述两种发酵菌剂的储存时间不易太长，否则菌种的产酶能力会出现下降等现象。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术存在的上述问题，本发明提供一种发酵菌剂的制备方法，该方法操作简便，所得发酵菌剂产品具有稳定的生物活性，并且易于储存和运输。
[0005]本发明提供的一种发酵菌剂的制备方法，主要包括如下步骤:
(1)将蒸熟的大米、麸皮、稻杆粉末、杨树木块混合，其中大米、麦麸、桔杆粉末和木块优选重量含量比为:0.5?1.0:1.5?3.0:0.1?0.3:0.3?0.8，混合后的物料湿度控制在40%?90%，121 °C条件下灭菌20min，获得培养基质；
(2)培养基质冷却至40°C?60°C，在所述培养基质中接入黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和乳酸菌等产酶微生物，搅拌均匀；
(3)将培养基质平铺散开，培养温度为20°C?40°C，培养环境湿度控制在40%?90%，静置培养3?15天，获得发酵菌剂。
[0006]将培养基质平铺散开，可增加微生物与空气的接触面积，加快微生物的繁殖。
[0007]本发明以自然选取的大米、麦麸、稻杆粉末、木块为微生物生长的培养基质，为微生物种群提供更接近天然的生存环境，使微生物保持稳定的产酶能力，有效避免菌种老化和退化的现象。
[0008]麦麸、桔杆粉末和木块中所含的营养物质较少，不利于微生物生长繁殖，因此，加入温度为40?60°C的蒸熟大米，其重量为占培养基重量的0.5%?1%。
[0009]所述木块与培养基质的重量比优选为0.3?0.8:1。
[0010]所述黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和乳酸菌等产酶微生物分别在PDA培养基中培养12h后接种，接种量为0.1%?3%培养基质，接种温度控制在20?60°C环境中。
[0011]本发明提供的一种发酵菌剂的制备方法，其有益效果在于，本发明克服了微生物因环境变化和保存过程中菌株易发生变异或者退化的问题，因为在含有丰富纤维素基质上培养，微生物能保持产纤维素酶的能力，并且可大大缩短微生物对外界环境的适应期，提高发酵效率，本发明的发酵菌剂为固体菌剂，便于运输和储藏。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例，对本发明进行详细的描述。
[0013]实施例1 1.底物制备
将大米蒸熟，麸皮、麦稻杆磨成粉末，过20目筛,杨树木块粉碎至长度不超过3cm,麦麸、秸杆粉与杨树木块在121°C条件下灭菌20min，待冷却至60°C左右，加入刚蒸熟的大米，搅拌混合均匀，其中大米、麦麸、秸杆粉末和木块的重量比为0.5:2:0.2:0.3。
[0014]2.发酵菌剂制备
将黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和乳酸菌等菌种加入培养基质，搅拌均匀，并平铺散开，控制发酵物料的温度30°C，湿度在80%，静置培养10天，获得发酵菌剂。
[0015]3.微生物含量的测定和纤维素酶活性的测定 (I)微生物含量的测定
采用梯度稀释法进行微生物含量的测定，取Ig发酵物料，溶于9mL的灭菌生理盐水中，经过充分震荡后，经过7次梯度稀释后，取10微升的溶液涂至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，培养条件为28°C，经24h后测定微生物含量，发酵10天后微生物含量为265个/g°
[0016](2)纤维素酶活的测定
取10g发酵物和0.5M的柠檬酸酸钠缓冲液(pH 4.8)按比例(w/v = I:7)混合后，放入30°C水浴60min，然后在室温下3000rpm离心取上清液，得到酶液。加0.5mL酶液到试管中，再加入0.5mLl%的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液，50°C保温30min。加入0.75mLDNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温，加入1mL蒸馏水，测定其产生的还原糖量。所得发酵10天时，纤维素酶活为22.802U/g。
[0017]4、发酵剂稳定性
在20°C环境中，将发酵菌剂放置6个月后，按上述发酵方法进行微生物含量和纤维素酶活的测定，测定结果显示，放置6个月后微生物含量比发酵10天后的菌体含量降低了20%，总微生物的产酶能力仅降低了 2%。由此可见，本发酵菌剂生态稳定，保质期长，且酶活性高，产酶能力强。
[0018]实施例2 1.底物制备
将大米蒸熟，麸皮、麦稻杆磨成粉末，过40目筛,杨树木块粉碎至长度不超过2cm,麦麸、秸杆粉与杨树木块在121°C条件下灭菌20min，待冷却至40°C左右，加入刚蒸熟的大米，搅拌混合均匀，其中大米、麦麸、秸杆粉末和木块的重量比为1:2:0.2:0.5。
[0019]2.发酵菌剂制备
将黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和乳酸菌等菌种加入培养基质，搅拌均匀，并平铺散开，控制发酵物料的温度25°C，湿度在90%，静置培养13天，获得发酵菌剂。
[0020]3.微生物含量的测定和纤维素酶活性的测定 (I)微生物含量的测定
采用梯度稀释法进行微生物含量的测定，取Ig发酵物料，溶于9mL的灭菌生理盐水中，经过充分震荡后，经过7次梯度稀释后，取10微升的溶液涂至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，培养条件为28°C，经24h后测定微生物含量，发酵13天后微生物含量为302个/g°
[0021](2)纤维素酶活的测定
取10g发酵物和0.5M的柠檬酸酸钠缓冲液(pH 4.8)按比例(w/v = I:7)混合后，放入30°C水浴60min，然后在室温下3000rpm离心取上清液，得到酶液。加0.5mL酶液到试管中，再加入0.5mLl%的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液，50°C保温30min。加入0.75mLDNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温，加入1mL蒸馏水，测定其产生的还原糖量。所得发酵13天时，纤维素酶活为34.602U/g。
[0022]4、发酵剂稳定性
在20°C环境中，将发酵菌剂放置6个月后，按上述发酵方法进行微生物含量和纤维素酶活的测定，测定结果显示，放置6个月后微生物含量比发酵13天后的菌体含量降低了18%，总微生物的产酶能力仅降低了 0.97%。由此可见，本发酵菌剂生态稳定，保质期长，且酶活性高，产酶能力强。
[0023]实施例3
1.底物制备
将大米蒸熟，麸皮、麦稻杆磨成粉末，过80目筛,杨树木块粉碎至长度不超过Icm,麦麸、秸杆粉与杨树木块在121°C条件下灭菌20min，待冷却至50°C左右，加入刚蒸熟的大米，搅拌混合均匀，其中大米、麦麸、秸杆粉末和木块的重量比为0.8:2:0.1:0.5。
[0024]2.发酵菌剂制备
将黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和乳酸菌等菌种加入培养基质，搅拌均匀，并平铺散开，控制发酵物料的温度50°C，湿度在75%，静置培养5天，获得发酵菌剂。
[0025]3.微生物含量的测定和纤维素酶活性的测定
(I)微生物含量的测定
采用梯度稀释法进行微生物含量的测定，取Ig发酵物料，溶于9mL的灭菌生理盐水中，经过充分震荡后，经过7次梯度稀释后，取10微升的溶液涂至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，培养条件为28°C，经24h后测定微生物含量，发酵5天后微生物含量为218个/g。
[0026](2)纤维素酶活的测定
取10g发酵物和0.5M的柠檬酸酸钠缓冲液(pH 4.8)按比例(w/v = I:7)混合后，放入30°C水浴60min，然后在室温下3000rpm离心取上清液，得到酶液。加0.5mL酶液到试管中，再加入0.5mLl%的羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液，50°C保温30min。加入0.75mLDNS试剂，沸水浴加热5min，冷却至室温，加入1mL蒸馏水，测定其产生的还原糖量。所得发酵5天时，纤维素酶活为18.370U/g。
[0027]4、发酵剂稳定性
在20°C环境中，将发酵菌剂放置6个月后，按上述发酵方法进行微生物含量和纤维素酶活的测定，测定结果显示，放置6个月后微生物含量比发酵5天后的菌体含量降低了 21%，总微生物的产酶能力仅降低了 4.2%。由此可见，本发酵菌剂生态稳定，保质期长，且酶活性高，产酶能力强。
【权利要求】
1.一种发酵菌剂的制备方法，其特征在于:主要包括以下步骤: (1)将蒸熟的大米、麸皮、稻杆粉末、杨树木块混合，其中大米、麦麸、稻杆粉末和木块优选重量含量比为:0.5?1.0:1.5?3.0:0.1?0.3:0.3?0.8，混合后的物料湿度控制在40%?90%，121 °C条件下灭菌20min，获得培养基质； (2)培养基质冷却至40°C?60°C，在所述培养基质中接入黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和乳酸菌等产酶微生物，搅拌均匀； (3)将培养基质平铺散开，培养温度为20°C?40°C，培养环境湿度控制在40%?90%，静置培养3?15天，获得发酵菌剂。
2.根据权利要求1所述的一种发酵菌剂的制备方法，其特征在于:所述黑曲霉、康氏木霉、枯草芽孢杆菌和乳酸菌分别在PDA培养基中培养12h后接种，接种量为0.1?3%培养基质，接种温度控制在20°C?60°C环境中。
3.根据权利要求1所述的一种发酵菌剂的制备方法，其特征在于:所述木块与培养基质的重量比为0.3?0.8:lo
【文档编号】C12R1/685GK104232536SQ201410444608
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月3日 优先权日:2014年9月3日
【发明者】董桂秀, 李洪涛 申请人:稼禾生物股份有限公司