一种狂犬病病毒灭活蛋白疫苗、其制备方法及应用的制作方法

一种狂犬病病毒灭活蛋白疫苗、其制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种新型的重组狂犬病病毒蛋白，所述重组蛋白是由融合了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白和狂犬病病毒基质蛋白自主组装而成；所述融合了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白是指将仿生核肽通过反向遗传技术整合到狂犬病病毒囊膜糖蛋白C端所形成的重组蛋白。本发明还提供利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统生产所述重组蛋白的方法。将所述杆状病毒/昆虫细胞表达系统制备的重组狂犬病病毒蛋白灭活后，与防腐剂混合，即制备得到狂犬病病毒灭活蛋白疫苗。本发明制备的疫苗具有免疫原性好、耐热性好、安全性高、无需佐剂等优点。
【专利说明】一种狂犬病病毒灭活蛋白疫苗、其制备方法及应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物病毒学、基因工程以及动物疫苗领域，具体地说，涉及一种狂犬病 病毒灭活蛋白疫苗、其制备方法及应用。

【背景技术】
[0002] 狂犬病，民间俗称为"疯狗病"或"恐水症"，是一种极为古老的人兽共患传染病，该 病是由狂犬病病毒（Rabies Virus，RV或RABV)感染所致，几乎所有的温血动物和人都易 感，病毒侵入机体的中枢神经系统，引起急性致死性脑脊髓炎，其特点是潜伏期长，一旦发 病，致死率近乎100%。目前为止尚无特效的治疗药物，最为有效的办法是通过注射狂犬病 疫苗进行预防。
[0003] 流行病学调查的结果显示，我国人的狂犬病95%由狂犬病病犬/猫或带毒犬/猫， 经抓伤、挠伤、咬伤所传染，所以控制人类狂犬病的关键是要控制住犬/猫狂犬病，综合防 控，以达到消灭人间狂犬病的目的。在我国，犬/猫的饲养量大，特别是偏远农村，虽然现有 狂犬疫苗能有效的保护犬猫免受狂犬病病毒的感染，但是由于疫苗价格昂贵，而且疫苗的 热稳定不佳运输保存不便，导致狂犬病疫苗接种率低，因此制备耐热、价廉、高效、易接种的 狂犬病疫苗是预防控制动物狂犬病的重要且可行方式。
[0004] RABV为单股不分节段负链RNA病毒，属弹状病毒科狂犬病毒属的成员。RABV粒子 直径75nm，长100-300nm，结构上呈现出子弹状。RABV粒子分为外壳和核衣壳，前者为一层 脂质双分子膜，是病毒复制过程中来源于宿主细胞的成分。糖蛋白（G)镶嵌于其中，形成穗 状的突起，与宿主细胞受体作用，是病毒刺激机体产生中和抗体的唯一结构蛋白。基质蛋白 (M)，属连接蛋白，在核衣壳和包膜间起连接作用，连接内外两部分。核衣壳是由一条核糖核 酸及包裹其外的核蛋白（N)构成，N蛋白和基因组RNA构成复合物，使基因组免遭核酸酶降 解，保证RNA完整性。L蛋白同P蛋白协同行使RNA依赖的RNA聚合酶功能。N、P、L蛋白同 RNA互相作用构成核糖核蛋白（RNP)复合物，是基因复制和转录模板。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种新型的耐热重组狂犬病病毒蛋白疫苗、其制备方法及应 用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的一种重组狂犬病病毒蛋白，所述重组蛋白是由融 合了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白与狂犬病病毒基质蛋白组成；所述重组了仿生核肽的 狂犬病病毒囊膜蛋白是指将仿生核肽通过反向遗传技术整合到狂犬病病毒囊膜糖蛋白上 所形成的重组蛋白。
[0007] 其中，所述重组了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2 所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列； 所述狂犬病病毒基质蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示，或该序列经替换、缺失或添加 一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0008] 本发明还提供上述重组狂犬病病毒蛋白的制备方法，其是利用杆状病毒/昆虫细 胞表达系统来生产所述重组蛋白：将狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核肽的融合基因，狂犬病 病毒基质蛋白基因分别按昆虫细胞偏爱密码子进行优化，将优化后的基因序列一起克隆到 具有多个启动子与表达盒（例如双启动子与双表达盒）的转移表达载体中，并位于不同启 动子下游，转化大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质 粒，用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞拯救获得重组杆状病毒（例如，待昆虫细胞 的细胞汇合度达到80%以上时进行转染），将获得的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养后 收获上清，即得到狂犬病病毒重组蛋白颗粒。
[0009] 其中，优化后的狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核肽的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，优化后的狂犬病病毒基质蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0010] 所述转移表达载体选自 AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII (pETL)、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、 pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、 pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAc JcC5、 pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、 pJVrsMAG、pMBac、pPIO、pPAKl、pPBac、pSHONEX I. 1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、 pFastBacDual、pFastBacl、pFastBacHT A、pFastBacHT EkpFastBacHT C、pFastBacDual 或 其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体中的至少一种。
[0011] 优选地，所述转移表达载体为PFastBacDual，优化后的狂犬病病毒囊膜蛋白和仿 生核肽的融合基因位于Pltl启动子下游，优化后的狂犬病病毒基质蛋白基因位于Ph启动子 下游，形成两个高效表达盒。
[0012] 所述昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda) Sf21、Sf9、Mimic Sf9 细胞系、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua)Se 301 细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLGl 细胞系、 BCIRL/AMCY-SeE-CLG4 细胞系、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni)H5 细胞系、BTI-Tn-5C1 细胞 系、BTI-Tn-5F2 细胞系、斜纹贪夜蛾（Spodoptera litura) ZSU-Sl-I 细胞系、IBL-SLlA 细胞 系和家蚕卵巢细胞系BmN等中的至少一种。
[0013] 优选地，用Sf9细胞进行重组杆状病毒的拯救和滴定，用H5昆虫细胞进行重组蛋 白颗粒的表达。
[0014] 前述制备方法中，将获得的重组杆状病毒按MOI = 0. 1接种昆虫细胞，4-5天后收 获上清，即得狂犬病病毒重组蛋白颗粒。
[0015] 本发明还提供所述重组狂犬病病毒蛋白在制备狂犬病病毒灭活蛋白疫苗中的应 用。将所述重组蛋白辅以灭活剂、防腐剂制备狂犬病病毒灭活蛋白疫苗。所述灭活剂为二 乙烯亚胺，终浓度为0. 025%，所述防腐剂为叠氮钠，终浓度为0. 01 %。
[0016] 本发明进一步提供由所述重组狂犬病病毒蛋白制备的狂犬病病毒灭活蛋白疫苗， 所述疫苗为肌肉注射疫苗或口服疫苗。
[0017] 本发明提出了一种能改善疫苗热稳定性和活疫苗免疫原性的组合设计方法，将仿 生核肽（biomimetic nucleating peptides)通过反向遗传学技术整合到狂犬病病毒囊膜 糖蛋白上，这样就能在生理条件下将磷酸钙矿化引入到疫苗表面，获得一个矿化表壳。这种 方法能利用疫苗自我生物矿化（self-biomineralization)作用，提高其稳定性和免疫原 性。
[0018] 这种自我生生物矿化工程蛋白复合体具有独特的结构，病毒学和化学性质。与许 多矿化物质相似，这种矿化外壳令封闭的疫苗产生了一些新特性，例如，自我矿化疫苗能储 存在26 °C下超过9天，在37 °C下保存约1周的时间，依然能有效地产生抗体的作用，这也就 减少了对于冷冻环境的依赖。
[0019] 制备包括囊膜糖蛋白作为外壳，基质蛋白作为内壳的蛋白复合物，去掉免疫抑制P 蛋白，既保有了保护性抗原，又具备一定的空间形态。嵌合的仿生核肽能够自动吸附培养基 中的钙离子（生物矿化），克服了通常纯化的蛋白并没有免疫原性，或免疫原性较弱，需要 强大的佐剂来诱导免疫应答反应。此外，一些外源性抗原无法到达APCs的细胞质，因此不 能够刺激CTL免疫应答反应。本发明制备的重组狂犬病病毒蛋白具有高的免疫原性，注射 免疫不需要任何佐剂。
[0020] 本发明提供的嵌合狂犬病病毒蛋白，是通过将空衣壳技术与生物矿化相结合从而 获得的新型耐热重组狂犬病病毒蛋白，这将有助于减少目前疫苗生产过程中的成本，尤其 适用于缺乏昂贵的制冷基础设施的发展中国家。
[0021] 本发明基于杆状病毒/昆虫细胞表达系统，在昆虫细胞生物反应器中安全、高效 地生产狂犬病病毒重组蛋白颗粒，并且在培养过程中狂犬病病毒重组蛋白颗粒能自动包裹 一层钙离子，使得该复合物的耐热性和免疫原性显著优于传统的狂犬病病毒抗原。本发明 方法制备的狂犬病病毒重组蛋白颗粒，表达量高、耐热性好、无需佐剂、免疫原性好、易发 酵，且制备方法成本低。

【专利附图】

【附图说明】
[0022] 图1为本发明高效表达转移载体构建模式图。
[0023] 图2为本发明重组杆状病毒基因组的PCR鉴定结果；其中，1.阴性对照，2和3. GBP 目的带，4和5. M目的带，M为DNA分子量标准。
[0024] 图3为本发明重组杆状病毒Bacmid杆粒转染昆虫细胞后的细胞病变情况。
[0025] 图4为本发明重组杆状病毒感染昆虫细胞后间接免疫荧光检测结果。
[0026] 图5为本发明包含仿生核肽的重组狂犬病病毒蛋白Western Blot检测结果。
[0027] 图6为本发明重组蛋白的电镜检测结果。
[0028] 图7为本发明重组蛋白的降解情况；其中，A. 25°C条件，B. 37°C条件。
[0029] 图8为本发明包含仿生核肽的狂犬病病毒重组蛋白颗粒体外刺激小鼠脾细胞，细 胞因子检测结果。
[0030] 图9为本发明包含仿生核肽的重组狂犬病病毒蛋白疫苗免疫小鼠后中和抗体水 平。
[0031] 图10为本发明包含仿生核肽的重组狂犬病病毒蛋白疫苗免疫小鼠后，攻毒保护 实验结果。

【具体实施方式】
[0032] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 [0033] 以下实施例中使用的试验材料：
[0034] 大肠杆菌株E. coli DH5 α购自Promega公司；克隆载体pEASY_T3购自全式金公 司；克隆载体PMD18-T购自TaKaRa公司；原核表达载体pET-28a+、受体菌E. coli TOPlO和 BL21(DE3)购自长春西诺生物科技有限公司，运载载体pFastBacDual购自Invitrogen公 司；狂犬病病毒HuNPB3株、SR9株，Sf9和H5昆虫细胞、N2A细胞、苜蓿银纹夜蛾核型多角体 病毒亲本株AcMNPV由长春西诺生物科技有限公司保存。
[0035] 酶与试剂：限制性内切酶和配套的缓冲液均购自Promega公司；T4 DNA Ligase及 缓冲液为Promega公司产品；LA Taq聚合酶及缓冲液购自TaKaRa公司；RnaseA、dNTPs购 自Sigma公司；各种规格的DNA和蛋白质分子量标准为TranGen Biotech公司产品；DEPC、 M-MLV-Rtase (逆转录酶）购自Promega公司。
[0036] 生化试剂：bisacrylamide、acrylamide、IPTG、X-Gal 购自 Promega 公司；Tris、 Ampicillin、Kanamycin、IPTG、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED (Ν，Ν, Ν'，Ν'-Tetram ethylethylene diamine)、过硫酸铵（Ammonium Persulfate)、卡那霉素（Kanamycin)、细 胞培养基TC-100购自Sigma公司；琼脂糖为Sunbiotech公司产品；酵母抽提物（Yeast Extract)、胰蛋白胨均购自英国OXOID公司；溴化乙锭（EB)、考马斯亮兰R-250购自Fluka 公司；琼脂粉为日本进口分装；Proteinase K、胎牛血清购自Invitrogen公司；其它均为国 产或进口分析纯试剂。引物由上海生工生物技术有限责任公司合成。
[0037] 试剂盒：IFN- γ、IL-2和IL-4细胞因子检测试剂盒购自R&DSYSTEMS公司；狂犬病 病毒糖蛋白定量试剂盒购自DRG公司。
[0038] 培养基：大肠杆菌培养基为LB培养基；昆虫细胞培养基为Grace培养基。
[0039] 实验动物：6_8周龄雌性BALB/C小鼠购自长春生物制品研究所冲华田园犬（6-8 月龄，抗狂犬病病毒中和抗体滴度小于0. 5IU)购自长春生物制品研究所。
[0040] 狂犬病病毒灭活蛋白疫苗的动物实验在国家规定的隔离实验室中进行。
[0041] 实施例1耐热狂犬病病毒蛋白灭活疫苗、制备方法、小鼠免疫及攻毒保护试验
[0042] 1实验方法
[0043] 1. 1有关溶液和培养基的配制
[0044] 溶液 I :50mmol/L 葡萄糖，2Smmol /T, Tris-HCl (pH8. 0), 10mmol/L EDTA。
[0045] 溶液 II :0· 2mol/L NaOH，I % SDS (现用现配）。
[0046] 溶液 III : IOOmL 体系，5mol/L 醋酸钾 80mL，冰乙酸 12mL，CldH2O 8mL。
[0047] TAE(50X) :242g Tris 碱，57. ImL 冰乙酸，IOOmL 0· 5mol/L EDTA(pH8. 0)，无菌水 定容至lOOOmL。
[0048] TER 溶液：胰 RNAse (RNAse A)溶解于 IOmM Tris-HCl、15mMNaCl 中，配成 10mg/mL 的储存液_20°C冻存，用I X TE缓冲液稀释成20 μ g/mL的工作液4°C保存。
[0049] PPt 缓冲液：异丙醇 22mL ；5mol/mL KAc ImL ;ddH20 2mL。
[0050] IXTE 缓冲液：10mmol/L Tris · Cl (ρΗ8· 0)，lmmol/L EDTA(pH8. 0)，121°C 高温高 压蒸汽灭菌20min后储存于4°C。
[0051] 溴化乙锭（EB)溶液母液：将EB配成浓度为10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器储存 于室温即可。
[0052] 6 mol/L NaI :将(λ 75g Na2SO3 溶于 40mL CldH2O 中，加入 45g NaI 并搅拌至完全溶 解，4°C储存。
[0053] 玻璃奶（Glassmilk):将 IOg (100mg/mL，Sigma S-5631)的 Silica 溶于 IOOmL PBS 中，沉淀2h，弃上清，重复该步骤2?3次；2000g离心2min，将沉淀物溶于3mol/L的NaI 中，终浓度为100mg/mL，4°C下避光保存。
[0054] New Wash 洗液：Tris-HCl (pH 7. 4) 20mmol/L ;EDTA lmmol/L ;NaCl lOOmmol/L ;与 等体积的无水乙醇配制而成。
[0055] 蛋白表达诱导物IPTG为I mol/L，超纯水配制后用0. 2 mm滤器过滤除菌。
[0056] 蛋白上样缓冲液（2X) :100mmol/L Tris-HCl (pH6. 8)、200mmol/L 二硫苏糖醇 (DTT)、4% SDS、0. 2%溴酚蓝、10%甘油。
[0057] 30%丙烯酰胺溶液：29g丙烯酰胺，Ig N，f -亚甲叉丙烯酰胺，溶于IOOmL水，过 滤。
[0058] 考马斯亮蓝染液：0· 24g考马斯亮蓝R250溶于90mL甲醇：水（1: 1，v/v)和IOmL 冰乙酸中。
[0059] 脱色液：90mL甲醇：水（I: 1，v/v)和IOmL冰乙酸。
[0060] 裂解缓冲液（ρΗ8· 0) :50mmol/L Tris_Base、0. IM NaCl。
[0061] 包涵体洗涤液 I (ρΗ8· 0) :20mmol/L Tris_Base、0. 2M NaCl、l% TritonX-100。
[0062] 包涵体洗涤液 II (pH8. 0) :20mmol/L Tris-Base、0. 2M NaCl、2M 尿素。
[0063] 包涵体蛋白溶解液（ρΗ8· 0) :20mmol/L Tris_Base、0. 2M NaCl、8M 尿素。
[0064] 脲 NTA-O 缓冲液：20mM Tris-HCl ρΗ7· 9,0· 5 M NaCl，10% Glycerol，8M Urea。 脲 NTA-500 缓冲液：20mM Tris-HCl ρΗ7·9,0· 5MNaCl，10 %Glycerol，8M Urea，0.5M Imidazole。
[0065] Bradford 试剂为 Bio-Rad 公司 Protein Assay Dye-Reagent Concentrate。
[0066] ELISA 所需试剂：包被液（pH9. 6) I. 59g Na2C03、2. 93g NaHC03、ddH20 定容至 1L，保 存于4°C;临用前配制封闭液，BSA溶于PBS中至终浓度为I 洗涤液为含0. 05% Tween-20 的PBS ;底物缓冲液为I. 84g Na2PO4 · 12H20、0. 51g柠檬酸、CldH2O定容至IOOmL ;0PD显色 液是4mg OPD溶于10 mL底物缓冲液，加15 μ L 30% H2O2，临用前配制；终止液为2 mol/L H2SO4。
[0067] Western Blot试剂：半干转电转膜缓冲液是14. 41g甘氨酸、12. llgTris_Base、50 mL甲醇、CldH2O定容至I L、4°C保存；IXPBS加 Tween-20至终浓度为0. 1 %配成洗涤液；BSA 溶于PBS中至终浓度为3%为封闭液；纯化的多克隆抗体用封闭液按1:1000稀释；HRP标 记的羊抗兔IgG抗体用封闭液按1:1000稀释；临用前配制DAB显色液，4mg DAB溶于10 mL 100 mmol/L ρΗ7· 5 的 Tris-Cl 中，力口 15μ L 30% H202。
[0068] LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，调整pH值7. 0(固体培养 基含1. 5%琼脂）。液体培养基中加入1. 5%琼脂粉，121°C高温高压蒸汽灭菌15 min，在温 度低于45°C且还未凝固时，加入相应抗生素溶液，混匀后倒入平板，为LB固体培养基，4°C 保存备用。
[0069] I. 2狂犬病病毒糖蛋白和基质蛋白基因原始序列的获得
[0070] I. 2. 1狂犬病病毒SRV9株
[0071] 狂犬病病毒SRV9株由中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所提供。
[0072] L 2. 2 TRIzol 法提取基因组 RNA
[0073] (1)将狂犬病病毒放入盛有Trizol (50-100mg组织/ImL)的玻璃匀浆器中混匀，液 体体积不要超过Trizol体积的10% ;
[0074] (2)将匀浆液在室温下放置5min以使核蛋白质复合体完全裂解；
[0075] (3)加入氯仿（0· 2mL/lml Trizol)，盖紧管盖并漩涡剧烈震荡15sec ;室温放置 2-15 min ；
[0076] (4)4°C，12000g离心15min。离心后，混合液被分为三相：处于下层的浅红色酚-氯 仿有机相、中间相和上层无色水相。RNA存留在水相中，而DNA和蛋白质则存留于间相和有 机相中，水相体积约为用于匀浆的Trizol体积的60% ;
[0077] (5)将水相移入新管，加异丙醇（0· 5mL/lmLTrizol);室温放置5-10min ;
[0078] (6)4-25°C，12000g离心8min，RNA沉淀在管壁或管底形成胶状的或白色的小球；
[0079] (7)弃上清，用ImL 75%乙醇清洗RNA沉淀；然后4-25°C，7500g离心5min ;
[0080] (8)弃上清，干燥；沉淀重溶于20 μ L DEPC处理的双蒸水（CldH2O)或去离子甲酰胺 中，-70°C保存备用。若沉淀难溶，可用吸管吹打数次并55-60°C温育10_15min。
[0081] 1.2. 3目的基因的扩增
[0082] 引物的设计：根据GenBank公布的序列AF499686,设计狂犬病病毒G基因和M基 因原始序列的扩增引物为：
[0083] SRV9G 上游：5, -AGGATCCAACATGGAGGGCAAAGCCCGCACAG-3,（BamHI)
[0084] SRV9G 下游：5，-GAGAATTCTCAGACATAAGAAAAGCCATTG-3,（EcoR I)
[0085] SRV9M 上游：5, -TTTCTCGAGATGAACTTCCTGCGCAAGATCG-3,（XhoI)
[0086] SRV9M 下游：5, -TTTGCTAGCTTATTCCAGCAGCAGGGAGGAG-3,（NheI)
[0087] L 2. 4 RT-PCR 反应
[0088] 1. 2. 4. I cDNA 第一链的合成
[0089] 取 2 μ LRNA (彡 1 μ g) +2 μ L RHDV-RT+13. 75 μ L DEPC 处理水；7(TC，5min，迅速置 冰上 5min ;加入 5 μ L 5 XM-MLV 缓冲液 +1. 25 μ LlOmM dNTPs+1 μ L M-MLV-RT (200U)，使终 体积为25μ L ;混匀后室温放置IOmin ;42°C反应Ih ;70°C 2min灭活RTase，-20°C保存备用。
[0090] L 2. 4. 2 PCR扩增目的基因
[0091] 反应体系及反应程序见表1。
[0092] 表1反应体系及反应程序
[0093]

【权利要求】
1. 重组狂犬病病毒蛋白，其特征在于，所述重组蛋白是由融合了仿生核肽的狂犬病病 毒囊膜蛋白与狂犬病病毒基质蛋白组成；所述融合了仿生核肽的狂犬病病毒囊膜蛋白是指 将仿生核肽通过反向遗传技术整合到狂犬病病毒囊膜糖蛋白C端上所形成的重组蛋白。
2. 根据权利要求1所述的重组狂犬病病毒蛋白，其特征在于，所述融合了仿生核肽的 狂犬病病毒囊膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个 或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；所述狂犬病病毒基质蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID No. 4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列。
3. 权利要求1或2所述重组狂犬病病毒蛋白的制备方法，其特征在于，其是利用杆状病 毒/昆虫细胞表达系统来生产所述重组蛋白：将狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核肽的融合基 因，狂犬病病毒基质蛋白基因分别按昆虫细胞偏爱密码子进行优化，将优化后的基因序列 一起克隆到具有多个启动子与表达盒的转移表达载体中，并位于不同启动子下游，转化大 肠杆菌DHlOBac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒，用重组杆状病 毒Bacmid质粒转染昆虫细胞拯救获得重组杆状病毒，将获得的重组杆状病毒接种昆虫细 胞，培养后收获上清，即得到重组狂犬病病毒重组蛋白。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，优化后的狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核 肽的融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，优化后的狂犬病病毒基质蛋白基因的核 苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述转移表达载体选自AcRP23-lacZ、 AcRP6_SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII (pETL)、 p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、 pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、 pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、 pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、 pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVPIO、pJVrsMAG、pMBac、pPIO、pPAKl、pPBac、 pSHONEXL UpSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL1392、pVL 1393、pVL941、 pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBacDual、pFastBacl、pFastBacHT A、 pFastBacHT B、pFastBacHT C、pFastBacDual或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体 中的至少一种。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转移表达载体为pFastBacDual,优化 后的狂犬病病毒囊膜蛋白和仿生核肽的融合基因位于P ltl启动子下游，优化后的狂犬病病 毒基质蛋白基因位于Ph启动子下游。
7. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述昆虫细胞选自草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda)Sf21、Sf9、Mimic Sf9 细胞系、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua) Se 301 细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLGl 细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4 细胞系、粉纹夜 蛾（Trichoplusia ni)H5细胞系、BTI-Tn-5C1细胞系、BTI-Tn-5F2细胞系、斜纹贪夜蛾 (Spodoptera litura) ZSU-Sl-I细胞系、IBL-SLlA细胞系和家蚕卵巢细胞系BmN中的至少 一种。
8. 权利要求1或2所述重组狂犬病病毒蛋白在制备狂犬病病毒灭活蛋白疫苗中的应 用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述重组狂犬病病毒蛋白辅以灭活剂、 防腐剂制备狂犬病病毒灭活蛋白疫苗；所述灭活剂为二乙烯亚胺，终浓度为〇. 025%，所述 防腐剂为叠氮钠，终浓度为〇. 01 %。
10. 由权利要求1或2所述重组狂犬病病毒蛋白制备的狂犬病病毒灭活蛋白疫苗，其特 征在于，所述疫苗为肌肉注射疫苗或口服疫苗。
【文档编号】C12N15/866GK104211817SQ201410469258
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】夏振强, 郑文文, 郑学星, 王化磊, 金宏丽 申请人:长春西诺生物科技有限公司