Fas ii抑制剂abx的生物合成基因簇的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种作用于细菌FASII蛋白的活性天然产物ABX的生物合成基因簇，该基因簇包括了13个与ABX合成相关的特征基因。ABX具有很好的抗菌、降脂、降压活性，本发明所揭示的ABX生物合成基因簇，可以用于改造ABX的生物合成途径，实现ABX的结构改造和产量的提升，具有重要的经济实用价值。
【专利说明】FAS I I抑制剂ABX的生物合成基因簇
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及FAS II抑制剂ABX的生物合成基因簇。
【背景技术】
[0002] ABX是由默克公司从土壤细菌中发现的一小类II型芳香聚酮化合物（式1)，其包 括（-)-ABX和（-)-BABX (产自Str印tomyces sp.MA6657)。结构上，ABX具有两个罕见的芳 环骨架，包括一个非连续共轭的苯环和一个手性氧杂桥环骨架，显著有别于典型的连续共 轭芳环基础骨架（式2);此外，该类化合物还具有一个独特的（氯化）偕二甲基蒽醌结构。 在生物学活性上，ABX显示出优异的抗菌活性（Tetrahedron Lett.，1995, 36, 2013-2016)， 其对包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)、耐万古霉素屎肠球菌（Vancomycin-resistant Enterococcus，VRE) 在内的革兰氏阳性菌具有很强的抗菌活性（J. Nat. Prod.，2005, 68, 1437-1440)，尤 其是㈠ -BABX对细菌脂肪酸合成酶II (FAS II)具有强烈的的抑制活性（J. Biol. Chem.，2005, 280, 1669-1677);此外（-)-ABX具有优良的降胆固醇活性等（J. Nat. Prod.，2005, 68, 1437-1440)。最近研究表明氯化偕二甲基蒽醌结构（式1)是一类新型的 高效抑制细菌FAS II蛋白的药效基团（J. Am. Chem. Soc. ,2012, 134, 2981-2987)，此单元能 特异性地结合FAS II蛋白的底物结合口袋，起到强烈地抑菌作用，其作用机制和著名的FAS II 抑制剂平板霉素（platensimycin)非常相似（Nature, 2006, 441，358-361)。
[0003]
【权利要求】
1. 来自于细菌5?印5/7. MA6657,和II型芳香聚酮化合物ABX合成相关的基 因簇，包括： 1) 负责聚酮骨架形成的Π 型线性聚酮合成酶基因，即abxA、abxB和abxC共3个基因： 编码酮基合成酶的abxA位于基因簇核苷酸序列第1-1227个碱基处，序列如SEQ ID No 2所示； 编码酮基合成酶的abxB位于基因簇核苷酸序列第1230-2477个碱基处，序列如SEQ ID No 4所示； 编码酰基载体蛋白的abxC位于基因簇核苷酸序列第2514-2753个碱基处，序列如SEQ ID No 6所示； 2) 负责聚酮骨架成环的基因，即abxD、abxE和abxH共3个基因： 编码聚酮环化酶的abxD位于基因簇核苷酸序列第2750-3241个碱基处，序列如SEQ ID No 8所示； 编码聚酮环化酶的abxE位于基因簇核苷酸序列第3238-3579个碱基处，序列如SEQ ID No 10所示； 编码酮基还原酶的abxH位于基因簇核苷酸序列第6151-6921个碱基处，序列如SEQ ID No 16所示； 3) 负责聚酮合成过程中缩酮氧桥基础骨架手性选择的基因，即abxj基因，位于基因簇 核苷酸序列第8173-8901个碱基处，序列如SEQ ID No 20所示； 4) 负责后修饰的基因，即abxM、abxF和abxl共3个基因： 编码甲基转移酶的abxM位于基因簇核苷酸序列第11550-12299个碱基处，序列如SEQ ID No 26 所示； 编码卤化酶的abxF位于基因簇核苷酸序列第3622-4899个碱基处，序列如SEQ ID No 12所示； 编码甲基转移酶的abxl位于基因簇核苷酸序列第6996-8030个碱基处，序列如SEQ ID No 18所示； 5) 负责调节的基因，即abxG、abxK和abxL共3个基因： 编码调控因子的abxG位于基因簇核苷酸序列第4908-6239个碱基处，序列如SEQ ID No 14所示； 编码调控因子的abxK位于基因簇核苷酸序列第8972-10555个碱基处，序列如SEQ ID No 22所示； 编码调控因子的abxL位于基因簇核苷酸序列第10636-11208个碱基处，序列如SEQ ID No 24所示。
2. -种使用权利要求1所述基因簇产生ABX化合物的方法，包括如下步骤： 1)首先将Str印tomyces sp. MA6657来源的原始菌培养到0D值为1提取基因组DNA， 通过Sau3A I限制性内切酶对基因组DNA的部分酶切处理，待切到48kb大小DNA片段后 对外源片段采用电洗脱的方法进行胶回收，之后将上述48kb大小的DNA目的片段与Hpa I 和Bam HI限制性内切酶切处理好的载体pJTU2554连接进行后续的基因文库的包装、转染、 效价测定及单菌落挑取并完成阳性Cosmid 4E10的筛选工作，筛选工作涉及到筛选引物 ABX-L/R/M/S的确定，最终通过PCR的方法确定ABX化合物合成相关功能基因簇边界，从而 确定ABX化合物合成的关键基因簇；所述pJTU2554的改造过程如下： PSET152通过Xba I和Xho I双酶切后保留了阿泊拉抗性基因、oriT接合转移位点区 域、attp重组整合位点以及λ噬菌体的整合系统int区域； P0J446通过Pst I酶切后除去原有载体质粒的oriT接合转移位点区域构建成含有3 个cos位点的pJTU2553载体质粒，最后通过Xba I和Xho I双酶切将3个cos位点区域与 之前酶切好的PSET152保留部分连接成最终的PJTU2554改造后质粒； 2) 将筛选得到的4E10 Cosmid通过结合转移异源表达到S. albus宿主菌； 3) 挑选该工程菌的单菌落进行培养并且大量发酵，得到了 ABX化合物。
【文档编号】C12P17/18GK104263738SQ201410468972
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】瞿旭东, 于明加, 邓子新 申请人:武汉大学