具有益生作用的短小芽孢杆菌315及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)315，保藏编号为CGMCC NO.8878。短小芽孢杆菌315具有提高饲料利用率，促进饲料中营养物质的消化吸收；增强动物的免疫功能，提高日增重，降低料肉比；无污染，无残留，生物环保等特点。本发明的短小芽孢杆菌可作为一种新型的益生菌添加剂，广泛应用于饲料中。CGMCC No.88782014.03.03
【专利说明】具有益生作用的短小芽孢杆菌315及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物学领域，具体地说，涉及一种具有益生作用的短小芽孢杆菌315 及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着我国畜牧业的快速发展，其数量与质量、生产与环境以及效益与资源之间的 矛盾越来越突出。尤其是畜禽排泄物对环境造成的污染日趋严重，大量的有害物排放使得 畜禽场污染物中的BOD(生化需氧量）和COD(化学需氧量）值急剧上升，同时也成为一些 疾病发生和传播的潜在诱因。
[0003] 另一方面，食品安全问题正引起越来越多的关注，在造成食品安全问题的诸多原 因中，重要原因之一是饲料中使用抗生素作为促生长剂。客观上，抗生素自20世纪50年代 以来广泛应用于畜禽养殖业，在促进动物生长，保证动物健康，节约饲料成本，提高经济效 益等方面做出了巨大贡献。但由于抗生素在动物养殖业中的长期使用，近些年来，由其所致 的毒副作用和药物残留问题已引起人们的关注。2006年，欧盟已经全面禁止了饲料中抗生 素的使用，美国和日本等国家也对其做出了严格的限制。2011年，韩国全国禁止在动物饲料 中添加抗生素。
[0004] 随着人们对畜产品安全和环境保护意识的不断加强，作为抗生素的替代品，益生 菌越来越多的应用于动物营养和饲料中。益生菌是一类能改善动物胃肠道微生态平衡，有 益于动物健康和生产性能发挥的微生物添加剂。其主要作用效果体现在改善动物新陈代 谢，提高营养物质吸收和利用，提高免疫力，减少环境污染等方面发挥重要作用。
[0005] 由于芽孢杆菌对干燥、高温、高压、氧化等不良环境抵抗力很强，这种稳定性增加 了它作为益生菌的潜力。因此，获得新型具有益生特性的芽孢杆菌的研究具有重大意义。分 离和筛选抗病原菌且具有益生效果的短小芽孢杆菌，可以更好的应用于饲料添加剂，以代 替抗生素。但短小芽孢杆菌作为益生菌制剂或饲料添加剂的研究与应用较少，尤其是在替 代饲养抗生素和减少环境污染等方面。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种具有益生作用的短小芽孢杆菌315及其在动物饲料中 的应用。
[0007] 为了实现本发明的目的，本发明的短小芽孢杆菌315(BacillUS pumilus)是从养 猪场附近土壤中筛选到的一株芽孢杆菌。经16S rRNA基因序列分析和体外益生效果评价， 该菌株为能够抑制病原菌且具有益生和减少畜禽养殖环境污染效果的短小芽孢杆菌，其 16S rRNA序列如SEQ ID NO. 1所示。该菌株已于2014年3月3日保藏在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)， 保藏号为 CGMCC No. 8878。
[0008] 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus) 315的微生物学特性为：革兰氏阳性菌，无鞭 毛和荚膜；菌体表面干燥，有褶皱，不透明，灰白色；需氧菌；可利用蛋白质、多种糖及淀粉。
[0009] 本发明提供含有该短小芽孢杆菌315的菌剂。
[0010] 本发明还提供短小芽孢杆菌315或上述菌剂在广谱抗菌中的应用。其中，短小芽 孢杆菌315的抑菌谱包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄 球菌，如Staphylococcus aureus IVDC C56005(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心）；所述革兰氏阴性菌为致病性大肠杆菌，如K88(Escherichia coli IVDC C83901)， 鼠伤寒沙门氏菌，如Salmonella typhimurium IVDC C79_13(中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心）。
[0011] 本发明还提供一种含有该短小芽孢杆菌315的动物饲料添加剂。该饲料添加剂含 有短小芽孢杆菌315的活菌数为I X 109CFU/g?I X 101(lCFU/g ;优选地，含有短小芽孢杆菌 315的添加剂的活菌数为5X109CFU/g。
[0012] 本发明还提供一种含有该具有益生作用的短小芽孢杆菌315饲料添加剂的动 物饲料。其中，所述动物饲料中短小芽孢杆菌315饲料添加剂的添加量为质量百分比的 1%。。因此，动物饲料中短小芽孢杆菌315的活菌数为IX 109CFU/kg?5X 109CFU/kg，优选 5 X IO9CFUAg0
[0013] 本发明通过体外法鉴定了短小芽孢杆菌315的益生效果，结果表明，短小芽孢杆 菌315能够耐酸、酸胆盐，能抵抗胃肠道的内环境，具备益生菌的潜力。
[0014] 本发明还采用体外法鉴定短小芽孢杆菌315耐酸、耐胆盐和模拟胃肠道环境中生 长的益生潜力，包括以下步骤：
[0015] 1)配制不同pH值的培养基，检测短小芽孢杆菌315的生长情况；
[0016] 2)配制不同胆盐浓度的培养基，检测短小芽孢杆菌315的生长情况；
[0017] 3)模拟人工胃肠液，检测短小芽孢杆菌315的生长情况。
[0018] 本发明进一步验证了短小芽孢杆菌315在断奶仔猪饲料添加中的应用效果。
[0019] 本发明的短小芽孢杆菌315 (Bacillus pumilus)，最适pH 7. 2?7. 4,最适温度 37°C，能够耐受体内环境，具有良好的益生效果。它是一株能够抑制肠道内病原菌的益生 菌，它能够耐酸、耐盐、耐人工胃肠液的环境，表明其具备益生菌的潜质。通过在猪、奶牛、蛋 鸡饲料添加中应用效果的研究，表明短小芽孢杆菌315可作为一种新型的益生菌添加剂， 广泛应用于饲料中。
[0020] 本发明筛选得到的短小芽孢杆菌315具有提高饲料利用率，促进饲料中营养物质 的消化吸收；增强动物的免疫功能，提高日增重，降低料肉比；无污染，无残留，生物环保等 特点。比枯草芽孢杆菌具有更好的益生特性和用作饲料添加剂的潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1短小芽孢杆菌315在不同pH值下的生长情况
[0022] 图2短小芽孢杆菌315对猪舍氨气浓度的影响
【具体实施方式】
[0023] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0024] 以下实施例中涉及的试验材料和试剂：
[0025] L菌株：病原菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus IVDC C56005)、鼠伤寒 沙门氏菌（Salmonella typhimurium IVDC C79-13)、大肠杆菌K88 (Escherichia coli IVDC C83901)由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供。
[0026] 2.生化试剂：DNA提取试剂盒购自天根公司，胆盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶购自Sigma 公司，其它均为国产试剂。
[0027] 3.培养基：
[0028] ⑴肉汤培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水lOOOmL，pH值7. 2? 7. 4,121°C 灭菌 20min。
[0029] ⑵肉汤固体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水lOOOmL，琼脂 20g，pH 值 7. 2 ?7. 4,121°C 灭菌 20min。
[0030] 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第三版）J.萨姆布鲁克一书中描述的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0031] 实施例1短小芽孢杆菌的315的（CGMCC NO. 8878)分离和鉴定
[0032] 采集养猪场附近的土壤，按1:10倍比稀释于生理盐水中。取IOOyL稀释液涂布 于营养肉汤固体培养基上，37°C培养24h。挑起菌落表面形成皱醭的单菌落在营养肉汤固体 培养基上划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化。通过此方法分离到34株菌种，分 别命名为301-334。
[0033] 应用琼脂扩散的牛津杯法筛选具有抑菌活力的短小芽孢杆菌。向肉汤培养基中加 入琼脂后，溶解均匀，高压灭菌，冷却到50°C左右，每20mL培养基加入20 μ L新鲜培养的指 示菌（108CFU/mL)，混匀倒入培养皿冷却。用灭菌的镊子将无菌的牛津杯轻轻的放入培养皿 中，在牛津杯中分别加入301-334各80 μ L单株菌液，向另一个牛津杯中加入80 μ L无菌营 养肉汤培养基作对照，37°C培养24h。筛选出能形成抑菌圈的菌液，其菌株编号为315。
[0034] 以上使用的指示菌分别为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus IVDC C56005)、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium IVDC C79-13)、大肠杆菌 K88 (Escherichia coli IVDC C83901)〇
[0035] 取IOmL 315培养液，低速离心获得菌体。用细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN， DP302)提取细菌总DNA。
[0036] 以IOng纯化的细菌总DNA作为模板，扩增16S rRNA基因。所用引物为原 核生物 16S rRNA 基因的通用引物：27F :5' -AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3' 和 1492R : 5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。引物由北京博迈德生物有限公司合成。
[0037] PCR 扩增体系为 50yL，包括 0.5yL Taq 酶（0.5U/mL)、5.0yL10XPCR 反应缓冲 液、4· 0μ L dNTP Mixture、l. 0μ L 模板DNA、1. 0μ L 正向引物 27F(25ymol/L)、1· 0μ L 反向 引物 1492R(25 μ mol/L)和 37. 5 μ L ddH20。
[0038] 扩增条件：95°C 5min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 2min，30 个循环；72°C 7min，4°C终 止反应。PCR产物序列测定由北京博迈德生物有限公司完成。
[0039] 短小芽孢杆菌315经16S rRNA基因测序，测得序列经Blast比对，结果该菌株 与 GenBank 中 Bacillus pumilus strain 3L-10F 16S ribosomal RNA gene(GenBank accession number :EU379272)序列相似性为98%。初步确定315为短小芽孢杆菌，该菌株 已于2014年3月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC， 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命 名为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)，保藏号为CGMCC No. 8878。其微生物学特性为：革 兰氏阳性菌，无鞭毛和荚膜；菌体表面干燥，有褶皱，不透明，灰白色；需氧菌；可利用蛋白 质、多种糖及淀粉。
[0040] 实施例2短小芽孢杆菌315耐酸耐胆盐特性测定
[0041] 测定短小芽孢杆菌315在低pH中的生长状态，用lmol/L盐酸调节营养肉汤培养 基为不同pH值梯度，分别为2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0和6. 4。短小芽孢杆菌315培养液按1 % (v/v)分别接种于不同pH值营养肉汤培养基中，37°C培养24h，测(?^^值。试验结果如图 1所示，短小芽孢杆菌315在pH = 4. 0的培养基中存活率为68%，说明短小芽孢杆菌315 在低酸的环境能够保持一定的活菌数。
[0042] 在营养肉汤培养基中加入猪胆盐，使其浓度分别为0% (对照）、0. 15%、0. 3%和 0. 6%。短小芽孢杆菌315接种于上述不同浓度的营养肉汤培养基中，37°C培养24h，通过平 板计数法计算活菌数。结果见表1，短小芽孢杆菌0.3%胆盐浓度下存活率达到80%。由于 动物体内胆盐浓度在〇. 3%左右，所以短小芽孢杆菌315能够耐受体内的胆盐环境。
[0043] 表1短小芽孢杆菌315在不同浓度胆盐中培养24h的活菌数
[0044]
【权利要求】
1. 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)315,其保藏编号为CGMCC NO. 8878。
2. 含有权利要求1所述的短小芽孢杆菌315的菌剂。
3. 权利要求1所述短小芽孢杆菌315在广谱抗菌中的应用。
4. 权利要求2所述菌剂在广谱抗菌中的应用。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，短小芽孢杆菌315的抑菌谱包括革兰氏阳 性菌和革兰氏阴性菌； 所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌；所述革兰氏阴性菌为致病性大肠杆菌、鼠伤寒 沙门氏菌。
6. 权利要求1所述的短小芽孢杆菌315在制备饲料添加剂中的应用。
7. 含有权利要求1所述短小芽孢杆菌315的饲料添加剂。
8. 根据权利要求7所述的饲料添加剂，其特征在于，饲料添加剂中短小芽孢杆菌315的 活菌数为 1. 〇 X 1〇9 ?1. 〇 X l〇1QCFU/g。
9. 根据权利要求8所述的饲料添加剂，其特征在于，饲料添加剂中短小芽孢杆菌315的 活菌数为 5.0X109CFU/g。
10. 含有权利要求1所述短小芽孢杆菌315的动物饲料。
【文档编号】C12R1/07GK104263683SQ201410469105
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】刁其玉, 张乃锋, 祁敏丽 申请人:中国农业科学院饲料研究所