一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的装置及方法
【专利摘要】本发明涉及医学细胞治疗领域，具体涉及一种快速、即时分离人皮肤中表皮细胞、黑色素细胞及成纤维细胞的装置，以及分离方法；本发明的分离装置由微型磁力加热搅拌器、操作面板、消化酶及等渗电解质溶液组成。本发明的分离方法不但明显减少了分离人体皮肤细胞所需仪器、简化了操作步骤，明显缩短了分离细胞所需时间，而且避免了血清的应用，显著减少过敏、病原微生物传播等严重并发症的发生，有利于人体皮肤细胞移植应用的广泛推广。本发明分离的细胞可用于瘢痕整形、各种原因所致色素异常改变(如白癜风、瘢痕性色素减退)的治疗及急慢性创面修复。
【专利说明】一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的装置及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学细胞治疗领域，具体涉及一种快速、即时分离人皮肤中表皮细胞、黑色素细胞及成纤维细胞的装置，以及分离方法；本发明分离的细胞可用于瘢痕整形、各种原因所致色素异常改变(如白癜风、瘢痕性色素减退)的治疗及急慢性创面修复。
【背景技术】
[0002]随着医学技术的发展，细胞治疗已成为多种疾病的重要治疗手段之一，受到研究者和临床医师的广泛关注。人皮肤中主要的细胞成份为表皮细胞、成纤维细胞及黑色素细胞，分离上述细胞后即时应用(即未经体外培养扩增)、或延时应用(即经体外培养扩增)，结合其它治疗手段已成功应用于瘢痕、瘢痕性色素减退或沉着、白癜风、烧伤深度创面、供皮区及各种慢性创面(如糖尿病足、静脉曲张性皮肤溃疡)等的治疗，并取得了良好的效果。例如:分离小块人皮肤中表皮细胞、黑色素细胞移植于经磨削的白癜风创面或其它原因所致的色素异常改变创面，可恢复治疗区正常颜色；分离皮肤中表皮细胞、成纤维细胞，经体外培养扩增后种植于真皮替代物表面，形成复层组织工程皮肤，可修复深度烧伤创面。
[0003]尽管人皮肤细胞治疗已取得一定效果，然而，存在的最大问题是目前尚无理想的表皮细胞、黑色素细胞及成纤维细胞分离设备和技术，常用的方法是切取患者断层皮片后采用中性蛋白酶或胰蛋白酶进行消化，第一步是分离断层皮片的表皮层，可采用热消化或冷消化。热消化是将断层皮片置于由中性蛋白酶或胰蛋白酶组成的消化液中，在实验室培养箱等清洁环境下于37摄氏度消化0.5-2小时，冷消化是指在4摄氏度下将断层皮片消化8-12小时，然后以摄子揭起表皮层。第二步是分离表皮层中的细胞成份，将分离的表皮层剪切成碎片，加入一定浓度的胰蛋白酶溶液，在37摄氏度下消化10-30分钟不等，适当吹打，然后以200目滤网过滤去除表皮碎片，加入l-5ml异体或异种血清中和胰酶，台式离心机上以800 - 1200rpm离心5_10分钟，吸除溶液，在沉淀物中加入培养基或其它类似溶液，适当吹打，获得含表皮细胞及部分黑色素细胞或成纤维细胞的细胞悬液(参见文献:陈俊颖，魏泓，周建华。人表皮细胞分离培养的研究。中国实验动物学报，2006，14 (2):114-117。)。上述方法操作步骤多、耗时长，且需专用仪器设备，难以在手术室内与手术同步进行，成为人体皮肤细胞治疗推广应用的主要障碍，具体表现如下:1.消化分离时间长:无论是热消化或冷消化，整个细胞分离过程需耗时2-16小时，分离的细胞难以在短时间内在手术室得到应用；2.分离细胞步骤多:需首次消化以分离表皮层、再次消化以分离表皮层中的细胞成份、然后过滤、离心、重悬细胞等，操作相对复杂、需一定的仪器设备及相关技术，只能在具备一定实验条件及技术人员的实验室内进行，难以在临床上推广应用；3.存在过敏及病毒、支原体、衣原体等病原微生物传播的严重并发症危险:细胞悬液中残余胰蛋白酶，需添加胰蛋白酶抑制剂或血清，中止胰蛋白酶活性以免加重细胞损伤，异体或异种血清成份复杂，可导致过敏甚至过敏性休克等严重并发症，且存在难以检测的病原微生物传播的风险；
4.所采用的分离方法据各实验室的条件及经验均有所不同，缺乏统一的流程和质控标准，临床应用效果不稳定。
[0004]目前急需一种快速、即时、无传染风险的人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的专用分离设备及其分离方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种快速、即时、无传染风险的人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的专用分离设备及其分离方法。
[0006]本发明拟对目前实验室及临床上所使用的人皮肤细胞分离设备及技术进行改进，不仅要减少细胞分离的步骤和所需仪器，而且要缩短细胞分离时间，最重要的是要避免血清的应用，提高细胞治疗的安全性。
[0007]本发明的第一方面，提供了一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的装置，该装置包括:
[0008]磁力加热搅拌器和操作面板，所述的操作面板镶嵌于磁力加热搅拌器上，二者形成一个整体；
[0009]所述的操作面板上设有3个以上孔，其中一个孔为磁力搅拌及过滤孔，其内放置一个磁力搅拌子，所述的磁力搅拌子的直径为0.1-1cm,长度为0.4-2cm。
[0010]所述的磁力加热搅拌器，也称加热磁力搅拌器，可控制温度在25-40摄氏度之间，搅拌速度为100-1200rpm。
[0011]磁力加热搅拌器驱动力为一次性电池或反复充电式电池或常用的220伏交流电。
[0012]在本发明的一个优选实施例中，所述的磁力加热搅拌器，可选用市售的微型磁力加热搅拌器加以组装或改造，例如但不限于上海欧河机械设备有限公司的0MS-5A多联动磁力搅拌机、常州普天仪器制造有限公司的六联磁力加热搅拌器等。
[0013]所述的操作面板上设有3个以上孔，各孔分别为:至少一个消化孔；至少一个漂洗孔；至少一个磁力搅拌及过滤孔，所述的磁力搅拌及过滤孔内装有可抽取式80目一 200目的过滤网。
[0014]在本发明的一个优选实施例中，所述的操作面板上设有5个孔，分别为A、B、C、D、E孔，其中A孔为皮片消化孔，呈圆形、正方形或其它任意形状，直径为l-5cm，深度为l-5cm，温度由加热磁力搅拌器精确控制在25-40摄氏度；B孔、C孔、D孔为皮片漂洗孔，为圆形、正方形或其它任意形状，直径为l_5cm，深度为l-5cm ；E孔为磁力搅拌及过滤孔，直径为
0.5-5cm，深度为0.5-5cm，孔内装有可抽取式80目一 200目的过滤网。
[0015]所述的操作面板，为高强度塑料或铝质、钢质、木质材料构成。
[0016]优选的，操作面板为长方体，长度为1cm?30cm,宽度为1cm?30cm,高度为5cm ?40cmo
[0017]本发明的装置还包括:
[0018]消化酶，为由胶原酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶组成的固态消化酶，优选的所述的胶原酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶的重量比为1:1:1;
[0019]等渗电解质溶液，为Ph值7.4的电解质溶液生理盐水、PBS液、D-hank’ s液，或Hank，S 液；
[0020]一次性手术刀，优选的为常规23号刀片；
[0021]一次性手术用镊子，优选的为无齿镊子。
[0022]优选的，本发明的装置还包括:注射器，为lml、2.5ml或5ml常规注射器。
[0023]本发明的第二方面，提供了一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的方法，该方法包括以下步骤:
[0024]A、将消化酶溶解于等渗电解质溶液中，配制成质量浓度为0.1% -1%的消化液，加入消化孔中，启动微型磁力加热搅拌器，预热5-10分钟，使溶液温度为25-40摄氏度；
[0025]B、将需要分离的断层皮片，处理成厚度为0.15-0.6mm,大小为0.5cm2_16cm2 ；
[0026]C、将切取步骤B的断层皮片置于消化孔中孵育5-45分钟；
[0027]D、漂洗孔中加入等渗电解质溶液，将孵育后的断层皮片进行漂洗；
[0028]E、将漂洗后的断层皮片平放于操作面板上，表皮面朝上，用手术用镊子揭起、分离表皮层，用一次性手术刀刮除表皮层的真皮面数次，并刮除真皮层的表皮面数次，得到少量的含细胞及部分杂质的溶液；
[0029]F、在磁力搅拌及过滤孔中加入等渗电解质溶液，将所获得的含细胞及部分杂质的溶液置于磁力搅拌及过滤孔中过滤，然后取出可抽取式80目一 200目的过滤网，即可获得含分离细胞的溶液；
[0030]G、进一步优选的方案为，将漂洗后的断层皮片平放于操作面板上，表皮面朝上，用手术用镊子揭起、分离表皮层，用一次性手术刀刮除表皮层的真皮面数次，并刮除真皮层的表皮面数次，得到少量的含细胞及部分杂质的溶液。然后用手术刀将表皮层适当切割成碎片，将所获得的含细胞及部分杂质的溶液和表皮碎片置于预先加入等渗电解质溶液的磁力搅拌及过滤孔中，常温下以100 - 1200rpm搅拌5-10分钟，然后取出可抽取式80目一 200目的过滤网，在磁力搅拌及过滤孔中即可获得含分离细胞的溶液。
[0031 ] 在本发明的一个优选实施例中，上述方法中，
[0032]优选的，步骤Ajf0.001-0.02克消化酶(胶原酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶为1:1:I比例)溶解于2-10ml等渗电解质溶液D-hank’ s液中，配制成质量浓度为0.1% -1%的消化液，加入A孔中，启动微型磁力加热搅拌器，预热5-10分钟，使溶液温度为25-40摄氏度；
[0033]优选的，步骤D、三个漂洗孔(B、C、D孔)中分别加入等渗电解质溶液如Hank’ S液，取出孵育后的断层皮，分别于B、C、D孔中漂洗1-3次(可为I次，也可为3次不等)；
[0034]优选的，步骤E、将漂洗后的断层皮片平放于操作面板上，以镊子等固定皮片，以另一镊子揭起分离的表皮层，然后以安装23号刀片的手术刀刮除表皮层的真皮面，刮除真皮层的表皮面，并适当将表皮层切割成碎片，即可获得一定量的分离的细胞；
[0035]优选的，步骤F、为进一步提高细胞分离量并去除表皮碎片，在E孔中加入0.5-5ml等渗电解质溶液如Hank’ S液，置入磁力搅拌子，将刮除后所得到的细胞溶液及表皮碎片置于E孔中，常温下以100 — 1200rpm搅拌5-10分钟，然后取出可抽取式80目一 200目的过滤网，在E孔中即可获得约0.5-5ml含分离细胞的溶液，以注射器抽吸细胞溶液，待用。
[0036]经多次实验表明，分离人皮肤细胞所需时间为15 - 60分钟。
[0037]分离细胞的组成，是由表皮细胞、成纤维细胞及黑色素细胞组成，其中表皮细胞占50-93 %、成纤维细胞占10-25 %，黑色素细胞占2-5 %。每平方厘米人断层皮片分离的细胞总数为1.0X 16 — 3.5 X 16个，细胞活性为80-95%。
[0038]分离的细胞，采用注射器均匀滴注或喷洒于经磨削等处理的瘢痕、白癜风或其它色素异常改变创面，包扎固定1-2周，可显著减轻瘢痕增生、恢复正常皮肤色泽。分离的细胞应用于供皮区、烧伤创面及各种慢性创面(如糖尿病足、静脉曲张性皮肤溃疡)等，移植后细胞存活并分泌生长因子，明显促进创面愈合。此外，分离的细胞也可用作实验室培养扩增表皮细胞、成纤维细胞或黑色素细胞，以供研究应用。
[0039]本发明的有益效果:本发明的一种快速、即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞及成纤维细胞的装置及方法，与目前常规的细胞分离技术相比，具有以下显著优点:
[0040]1.常规细胞分离方法需要培养箱或水浴箱及离心机等，不但体积大，而且操作复杂，需在实验室内进行操作。本发明的细胞分离装置由微型磁力加热搅拌器及操作面板形成一体化构件，体积小、携带简便，可一次性使用，或经薰蒸消毒后反复使用，尤其适合于在手术室使用，便于临床相关细胞治疗的开展；
[0041]2.常规细胞分离方法耗时2-16小时，分离的细胞难以在短时间内在手术室得到应用。本发明分离人皮肤细胞所需时间为15 - 60分钟，可与手术同时进行，分离细胞后即时应用，便于临床推广；
[0042]3.应用本发明提供的细胞分离装置分离细胞时，操作流程简便、标准化，具备一般医学知识的医护人员即可进行操作，不需在具备一定实验条件及技术人员的实验室内进行，且分离细胞数量及活性稳定、移植应用时存活率高；
[0043]4.本发明分离细胞时不需添加胰蛋白酶抑制剂或血清等中止残余胰蛋白酶活性，避免了因异体或异种血清导致过敏、过敏性休克及病毒、支原体、衣原体病原微生物传播等严重并发症的发生。
【专利附图】
【附图说明】
[0044]图1为本发明装置的结构示意图；
[0045]其中:
[0046]磁力加热搅拌器1、
[0047]操作面板2、
[0048]孔3，消化孔3A ;漂洗孔3B、3C、3D ;磁力搅拌及过滤孔3E ；
[0049]过滤网4、
[0050]温度指示5、
[0051]转速指示6。
【具体实施方式】
[0052]以下结合附图和具体实施例，对本发明做进一步说明。但本发明的实施并不仅限于此。
[0053]实施例1:
[0054]如图1所示，一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的装置，该装置包括:磁力加热搅拌器I和操作面板2，所述的操作面板2镶嵌于磁力加热搅拌器I上，二者形成一个整体；
[0055]所述的操作面板上设有5个孔，一个消化孔3A ;三个漂洗孔3B、3C、3D 个磁力搅拌及过滤孔3E，所述的磁力搅拌及过滤孔内装有可抽取式80目一 200目的过滤网4。所述的磁力搅拌及过滤孔，其内放置一个磁力搅拌子。
[0056]所述的磁力加热搅拌器，还包括温度指示5、转速指示6，可控制温度在25-40摄氏度之间，搅拌速度为100-1200rpm。
[0057]3A孔为呈圆形,直径为3cm,深度为3cm,温度由加热磁力搅拌器精确控制在25-40摄氏度；
[0058]3B孔、3C孔、3D孔为圆形,直径为3cm,深度为3cm ；
[0059]3E孔为磁力搅拌及过滤孔，直径为0.5cm，深度为1cm，孔内装有可抽取式100目的过滤网。
[0060]本发明的装置还包括:
[0061 ] 消化酶，为由胶原酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶组成的固态消化酶，优选的所述的胶原酶(购自Life Technologies公司，型号17100-017-lg)、中性蛋白酶(购自LifeTechnologies公司，型号17105-041_5g)及膜蛋白酶(购自Life Technologies公司，型号27250-018-100g)的重量比为 1:1:1;
[0062]等渗电解质溶液，为Ph值7.4的电解质溶液生理盐水、PBS液、D-hank’ s液，或Hank，S 液；
[0063]一次性手术刀，为常规23号刀片；
[0064]一次性手术用镊子，为常规无齿镊。
[0065]实施例2:
[0066]利用实施例1的装置，分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的方法包括以下步骤:
[0067]1.将0.001-0.02克消化酶(胶原酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶为1:1:1比例)溶解于2-10ml等渗电解质溶液D-hank’s液中，配制成质量浓度为0.1% _1%的消化液，加入A孔中，启动微型磁力加热搅拌器，预热5-10分钟，使溶液温度为25-40摄氏度；
[0068]2.切取人体任意部位断层皮片，厚度约0.15-0.6mm,大小为0.5cm2-16cm2等；
[0069]3.将切取的断层皮片置于3A孔中孵育5-45分钟；
[0070]4.3B、3C、3D孔中加入电解质溶液如Hank’ S液，取出孵育后的断层皮，分别于3B、3C、3D孔中漂洗1-3次；
[0071]5.将漂洗后的断层皮平放于操作面板上，以镊子等固定皮片，以另一镊子揭起分离的表皮层，然后以安装23号刀片的手术刀刮除表皮层的真皮面，刮除真皮层的表皮面，并适当将表皮层切割成碎片，即可获得一定量的分离的细胞；
[0072]6.为进一步提高细胞分离量并去除表皮碎片，在3E孔中加入0.5_5ml电解质溶液如Hank’S液，置入磁力搅拌子，将刮除后所得到的细胞溶液及表皮碎片置于E孔中，常温下以200 — 1200rpm搅拌5-10分钟，然后取出可抽取式80目一 200目的过滤网，在3E孔中即可获得约0.5-5ml含分离细胞的溶液，以注射器抽吸细胞溶液，待用。
[0073]所述的分离细胞主要由表皮细胞、成纤维细胞及黑色素细胞组成，其中表皮细胞占85%、成纤维细胞占11%，黑色素细胞占4%，细胞活性为90%。
[0074]以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述的实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可以作出种种的等同的变型或替换，这些等同变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
【权利要求】
1.一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的装置，其特征在于，该装置包括: 磁力加热搅拌器和操作面板，所述的操作面板镶嵌于磁力加热搅拌器上，二者形成一个整体； 所述的操作面板上设有3个以上孔，其中一个孔为磁力搅拌及过滤孔，其内放置一个磁力搅拌子，所述的磁力搅拌子的直径为0.1?Icm,长度为0.4?2cm。
2.根据权利要求1所述的一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的装置，其特征在于，所述的磁力加热搅拌器，控制温度为25?40摄氏度，搅拌速度为100 ?1200rpmo
3.根据权利要求1所述的一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的装置，其特征在于，所述的操作面板上设有3?5个孔，各孔分别为:一个消化孔；一到三个漂洗孔；一个磁力搅拌及过滤孔，所述的磁力搅拌及过滤孔内装有可抽取式80目?200目的过滤网。
4.根据权利要求3所述的一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的装置，其特征在于，所述的消化孔，呈圆形、正方形或其它任意形状，直径为I?5cm，深度为I?5cm ； 所述的漂洗孔，为圆形、正方形或其它任意形状，直径为I?5cm,深度为I?5cm ; 所述的磁力搅拌及过滤孔，直径为0.5?5cm,深度为0.5?5cm,孔内装有可抽取式80目?200目的过滤网。
5.根据权利要求1所述的一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的装置，其特征在于，操作面板为长方体，长度为1cm?30cm,宽度为1cm?30cm,高度为 5cm ?40cm。
6.根据权利要求1一5任一所述的一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的装置，其特征在于，该装置还包括: 消化酶，为由胶原酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶组成的固态消化酶，优选的所述的胶原酶、中性蛋白酶及胰蛋白酶的重量比为1:1:1; 等渗电解质溶液，为Ph值7.4的电解质溶液生理盐水、PBS液、D-hank’s液，或Hank’S液； 一次性手术刀； 一次性手术用镊子。
7.根据权利要求6所述的一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的装置，其特征在于，该装置还包括:注射器，为lml、2.5ml或5ml常规注射器。
8.一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: A、将消化酶溶解于等渗电解质溶液中，配制成质量浓度为0.1%?1%的消化液，加入消化孔中，启动微型磁力加热搅拌器，预热5?10分钟，使溶液温度为25?40摄氏度； B、将需要分离的断层皮片，处理成厚度为0.15?0.6mm,大小为0.5cm2?16cm2 ； C、将切取步骤B的断层皮片置于消化孔中孵育5?45分钟； D、漂洗孔中加入等渗电解质溶液，将孵育后的断层皮片进行漂洗； E、将漂洗后的断层皮片平放于操作面板上，表皮面朝上，用手术用镊子揭起、分离表皮层，用一次性手术刀刮除表皮层的真皮面数次，并刮除真皮层的表皮面数次，得到少量的含细胞及部分杂质的溶液； F、在磁力搅拌及过滤孔中加入等渗电解质溶液，将所获得的含细胞及部分杂质的溶液置于磁力搅拌及过滤孔中过滤，然后取出可抽取式80目?200目的过滤网，即可获得含分离细胞的溶液； G、进一步优选的方案为，将漂洗后的断层皮片平放于操作面板上，表皮面朝上，用手术用镊子揭起、分离表皮层，用一次性手术刀刮除表皮层的真皮面数次，并刮除真皮层的表皮面数次，得到少量的含细胞及部分杂质的溶液。然后用手术刀将表皮层适当切割成碎片，将所获得的含细胞及部分杂质的溶液及表皮碎片置于预先加入等渗电解质溶液的磁力搅拌及过滤孔中，常温下以100?1200rpm搅拌5?10分钟，然后取出可抽取式80目?200目的过滤网，在磁力搅拌及过滤孔中即可获得含分离细胞的溶液。
9.根据权利要求8所述的一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的方法，其特征在于，步骤Ajf0.001?0.02克消化酶溶解于2?1ml等渗电解质溶液D-hank’ s液中，配制成质量浓度为0.1%?I %的消化液，加入消化孔中，启动微型磁力加热搅拌器，预热5-10分钟，使溶液温度为25?40摄氏度。
10.根据权利要求8所述的一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的方法，其特征在于，步骤D、一到三个漂洗孔中分别加入等渗电解质溶液Hank’ S液，取出孵育后的断层皮，分别于一到三个漂洗孔中漂洗I?3次。
11.根据权利要求8所述的一种快速即时分离人皮肤表皮细胞、黑色素细胞和成纤维细胞的方法，其特征在于，步骤G、在磁力搅拌及过滤孔中加入0.2?5ml等渗电解质溶液Hank’ S液，置入磁力搅拌子，将刮除后所得到的含细胞及部分杂质的溶液及表皮碎片置于E孔中，常温下以100?1200rpm搅拌5-10分钟，然后取出可抽取式80目?200目的过滤网，在E孔中即可获得含分离细胞的溶液。
【文档编号】C12M1/00GK104232475SQ201410475101
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】肖仕初, 田松, 夏照帆, 吴海斌, 郑勇军, 王志红, 纪世召 申请人:中国人民解放军第二军医大学