一种环氧化物水解酶及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种环氧化物水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明涉及一种环氧化物水解酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还涉及一种环氧化物水解酶的应用，所述环氧化物水解酶以外消旋的芳香环氧化物为底物制备手性的芳香环氧化物。本发明提供的环氧化物水解酶可以整细胞的湿菌体或冻干菌体的形式，也可以粗酶液或纯酶的形式，以外消旋的芳香环氧化物为底物，制备得到对映纯的手性的芳香环氧化物(ee>99％)。
【专利说明】一种环氧化物水解酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶催化领域，更具体地涉及一种环氧化物水解酶及其编码基因和应 用。
【背景技术】
[0002] 环氧化物水解酶（EC 3. 3. 2. 3)是一组功能相似的酶系，能够立体选择性催化环 氧化合物生成光学纯的环氧化物和相应邻位二醇。作为一种水解酶它具有一般水解酶的特 点如：反应不需要辅酶的协助；具有广泛的来源；在非水溶剂中仍具有催化活力；以及这些 反应常常显示出化学、区域和立体对映选择性，能够对同类型广泛的底物进行作用。
[0003] 环氧化物水解酶广泛存在于自然界中，在哺乳动物、昆虫、微生物和植物中 均有发现。由于微生物种类的多样性、生长速度快、易于培养和产量高等优点，从微 生物中筛选获得环氧化物水解酶是目前主要的途径。近年，已从多种微生物中发现
【权利要求】
1. 一种环氧化物水解酶，其特征在于，所述环氧化物水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
2. -种环氧化物水解酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示。
3. -种根据权利要求1所述的环氧化物水解酶的应用，其特征在于，所述环氧化物水 解酶以外消旋的芳香环氧化物为底物制备手性的芳香环氧化物。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述芳香环氧化物为苯基缩水甘油醚、间 甲基苯基缩水甘油醚、间硝基苯基缩水甘油醚或对甲基苯基缩水甘油醚。
5. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述底物溶解于二甲基亚砜中，所述环氧 化物水解酶溶解于pH为7?8的缓冲液或纯水中，两者混合形成反应体系。
6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述环氧化物水解酶的制备方法包括： S1，将来源于 DSM20162 Tsukamurella paurometabola 的 SEQ ID N0:1 所不的环氧化物水 解酶的基因构建载体，将载体转化大肠杆菌；S2,获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培 养液分离获得含环氧化物水解酶的菌体细胞。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤S1包括：以GenBank登录号为 YP_003645475 的序列设计引物 SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4;以从DSM20162 Tsukamurella paurometabola提取的基因组为模板克隆获得全长1038bp的基因片段；经过BamHI和 Hindlll两个内切酶酶切后，与对应的经过酶切的pET-28a线性化质粒连接，将连接产物转 化至克隆宿主E. coli DH5a，获得的单克隆过夜培养提取质粒，转化至E. coli BL21。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤S2包括：获得的重组基因工程 菌以IPTG为诱导剂进行诱导培养，得到含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21的湿 菌体。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述环氧化物水解酶的制备方法还包括： S3,冷冻干燥所述湿菌体得到冻干菌体。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述环氧化物水解酶的制备方法还包 括：S4,破碎所述湿菌体或所述冻干菌体后得到粗酶液。
11. 根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述环氧化物水解酶的制备方法还包 括：S5,提纯所述粗酶液得到纯酶。
【文档编号】C12N15/55GK104450641SQ201410475055
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】王华磊, 吴锴, 魏东芝 申请人:华东理工大学