一种用于快速检测人类vkorc1和cyp2c9基因多态性的试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术，具体涉及一种用于快速检测人类VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒及其使用方法。本发明所述试剂盒包括3对引物、3条探针、6条PNA序列，1对β-Actin内标引物及1条内标探针，还包括Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶和ddH2O。利用本发明试剂盒能够对VKORC1和CYP2C9基因多态性位点进行定性检测，根据SNP位点进行两管PNA-PCR荧光扩增反应，只需根据两管荧光曲线是否起线就能进行结果判断，不会产生人为误差，假阳性和假阴性率低；本发明试剂盒更容易实现高通量检测，更能满足临床使用。
【专利说明】-种用于快速检测人类VK0RC1和CYP2C9基因多态性的试 剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术，具体涉及一种用于快 速检测人类VKORCl和CYP2C9基因多态性的试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 华法林是目前广泛应用的香豆素类口服抗凝药，用于预防和治疗血栓栓塞性疾病 的口服抗凝治疗。但是华法林的剂量窗口较窄，不同病人的所需用量可以相差十倍以上。目 前研究发现，CYP2C9和维生素 K环氧化物还原酶（VKOR)基因多态性对华法林治疗剂量的 影响逐渐被认识，其中他01?(：1(-16396/^)，0￥?209*2(430(：/1')和0￥?209*3(10754/〇多态 性位点与华法林治疗剂量关系最为密切，这些位点多态性都与华法林代谢酶的损伤有关， 从而导致个体间和民族间华法林用量的差异。目前，国际华法林实施协会根据VKORCl和 CYP2C9基因多态性制定了详细的华法林剂量计算公式，从而可以实现患者个体化给药。
[0003] 目前，用于基因分型的检测方法分为四类：测序法，聚合酶链反应-限制性片段长 度多态性技术（PCR-RFLP)、芯片法、荧光定量PCR法（qPCR)四种方法。
[0004] 测序法：先进行PCR扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后纯化PCR产物， 再对其进行测序，根据测序峰图判读基因型。优点：结果准确，测序法是基因多态性位点检 测的金标准。但是其成本较高，操作繁琐，试验周期长，限制了其在临床使用。
[0005] PCR-RFLP技术：先进行PCR扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后对PCR 产物进行酶切，电泳检测酶切条带，根据酶切条带进行判读。优点：成本低，结果比较直观； 缺点：有的多态性位点所在位置没有合适的限制性酶切位点，需要人工引入突变，另外容易 造成产物污染，导致假阳性结果，同时操作繁琐，试验周期长。
[0006] 芯片法：先进行PCR扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后将PCR产物与 突变探针、野生探针杂交，通过比较两个探针杂交的信号强度判断样品基因型。缺点=PCR 产物需要进行后续分析，操作繁琐；另外结果不好判读，容易出现假阳性。
[0007] qPCR法：又分为ARMS-PCR法、HRM法和Taqman探针法。qPCR的优点是操作简单， 试验周期短，PCR产物无需进行后续分析即可判断结果，因全过程在封闭的管内进行，减少 产物交叉污染。同时该方法操作简单，检测周期短。目前该方法已成为临床常用的检测方 法。
[0008] ARMS-PCR法又叫等位基因特异PCR，TaqDNA聚合酶缺少:V - 5'外切酶活性，在 一定条件下PCR引物3'末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，分别设计 突变引物、野生引物，2个引物主要是3'末端碱基不同。由于3'末端不配对的引物产物量 减少或不扩增，突变引物和野生引物的Ct值会有显著差异，通过设定区分野生型和突变型 的阈值，当突变引物与野生引物Ct值差值（ACt)大于阈值时即为突变型。缺点：引物设计 困难，对于多态性位点还有大量GC或AT序列时，往往束手无策，同时结果判断较为困难。
[0009] HRM法：高分辨率熔解曲线分析技术（High Resolution Melting，HRM)，有染料法 和荧光共振能量转移（FRET)双探针法等。染料法对荧光染料、PCR仪器要求较高，临床检 测比较少用。FRET (fluorescence resonance energy transfer, FRET)探针比较常用，罗氏 专利的FRET探针又称为双杂交探针。在SNP位点设计两条FRET探针，当两条探针和模版 互补、且相邻的特异探针组成，上游探针的3'端标记供体荧光基团，相邻下游探针的5' 端标记Red640受体荧光基团。当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和Red640受 体基团紧密相邻，激发供体产生的荧光能量被Red640基团吸收，使得检测探头可以检测到 Red640发出波长为640的荧光。当变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到640波 长的荧光。FRET探针检测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的 数量，非累积信号，可以用于做Tm曲线进行SNP检测。优点：一个SNP位点基因型，只需要 一管PCR完成检测；缺点：根据HRM溶解曲线Tm值差异不容易判读，不同基因型溶解曲线峰 图差异不明显。
[0010] MGB-Taqman探针法：Taqman探针是一种经典的定量PCR技术，现阶段得到广泛应 用，在PCR反应体系中加入一对引物的和一个特异性荧光探针，探针只与两条引物之间特 异性模板结合，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。探针的5'端连接报告荧光，3' 端连接淬灭荧光，随后进行实时定量PCR。如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸 时，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性会将探针序列上5'端的报告荧光切下，淬灭 荧光不再能对报告荧光进行抑制，使得报告荧光发光。针对SNP位点分别设计两个不同荧 光标记突变探针、野生探针，根据突变探针、野生探针荧光信号强度进行SNP位点基因型判 读。缺点=Taqman探针需要采用MGB-Taqman探针，当SNP位点的上游和下游含有大量GC或 AT碱基时，MGB-Taqman探针的设计和合成非常困难，且价格非常昂贵。
【发明内容】
[0011] 本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于快速检测人类VKORCl和 CYP2C9基因多态性的试剂盒及其使用方法，本发明提供的是一种基于PNA-PCR方法的基因 多态性检测试剂盒，该试剂盒成本低廉、操作简单、特异性和敏感性好，能够快速灵敏地检 测待测位点基因类型，从而准确对人类VKORCl和CYP2C9基因多态性进行基因分型。
[0012] 为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0013] 一种用于快速检测人类VKORCl和CYP2C9基因多态性的试剂盒，包括3对引物、3 条探针、6条PNA序列，1对β-Actin内标引物及1条内标探针序列，具体的包括：
[0014] 用于检测VKORCl基因 -1639G位点的引物序列如SEQ NO. 1、SEQ NO. 2所示，探针 序列如SEQ NO. 7所示，PNA序列如SEQ NO. 10所示；
[0015] 用于检测VK0RC1基因 -1639A位点的引物序列如SEQ NO. 1、SEQ NO. 2所示，探针 序列如SEQ NO. 7所示，PNA序列如SEQ NO. 11所示；
[0016] 用于检测CYP2C9基因 430C位点的引物序列如SEQ NO. 3、SEQ NO. 4所示，探针序 列如SEQ NO. 8所示，PNA序列如SEQ NO. 12所示；
[0017] 用于检测CYP2C9基因 430T位点的引物序列如SEQ NO. 3、SEQ NO. 4所示，探针序 列如SEQ NO. 8所示，PNA序列如SEQ NO. 13所示；
[0018] 用于检测CYP2C9基因 1075A位点的引物序列如SEQ NO. 5、SEQ NO. 6所示，探针序 列如SEQ NO. 9所示，PNA序列如SEQ NO. 14所示；
[0019] 用于检测CYP2C9基因 1075C位点的引物序列如SEQ NO. 5、SEQ NO. 6所示，探针序 列如SEQ NO. 9所示，PNA序列如SEQ NO. 15所示；
[0020] 用于β -Actin内标扩增的引物序列如SEQ NO. 16、SEQ NO. 17所示，内标探针序列 如SEQ NO. 18所示。
[0021] 按上述方案，所述的用于快速检测人类VK0RC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒还 包括Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶和ddH 20。
[0022] 按上述方案，所述的用于快速检测人类VK0RC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒 还包括6个不同的阳性对照品和1个阴性对照品，所述阳性对照品为包含有VK0RC1基 因 -1639G、VK0RC1 基因 1639A、CYP2C9 基因 430C、CYP2C9 基因 430T、CYP2C9 基因 1075A 或 CYP2C9基因 1075C的重组质粒和包含有内标基因的重组质粒的混合物，所述阴性对照品为 不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒。
[0023] 按上述方案，所述3条探针为Taqman探针，探针5'端的荧光基团为FAM，3'端的 淬灭基团为BHQl。
[0024] 按上述方案，所述1条内标探针为Taqman探针，探针5'端的突光基团为R0X，3' 端的淬灭基团为BHQl。
[0025] -种用于快速检测人类VK0RC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒的使用方法，包括 如下步骤：（1)提取待测人的基因组DNA作为检测样品；
[0026] (2)取1个PCR8联管，在其中A?F 6个管中分别加入检测样品，另取一个PCR8 联管，在A?F 6个管中分别加入6个不同的阳性对照品，再取一个PCR8联管，在A?F 6 个管中分别加入阴性对照品；
[0027] (3)将PCR8联管置于荧光PCR仪器中进行荧光PCR扩增反应，采集FAM和ROX荧 光信号；
[0028] (4)结果判断：a.当阳性对照均有FAM和ROX荧光信号起线，阴性对照均无 FAM和 ROX荧光信号起线，检测样品均有ROX荧光信号起线时，判断试验成功；b.根据检测样品A 管和B管的FAM荧光信号是否起线判断VK0RC1基因 -1639的分型，根据检测样品C管和D 管的FAM荧光信号是否起线判断CYP2C9基因 430的分型，根据检测样品E管和F管的FAM 荧光信号是否起线判断CYP2C9基因 1075的分型。
[0029] 按上述方案，所述PCR 8联管中A和B管内含有与检测人类VK0RC1基因 -1639分 型相关的PCR反应液，所述C管和D管内含有与检测人类CYP2C9基因 430分型相关的PCR 反应液，所述E管和F管中含有与检测人类CYP2C9基因 1075分型相关的PCR反应液，所述 PCR反应液包含与检测基因位点相对应的引物、探针、PNA序列、内标引物及内部探针、Taq 酶、dNTP混合液、Mg2+的PCR反应缓冲液和CldH2O。
[0030] 按上述方案，所述阳性对照品为包含有VK0RC1基因 -1639G、VK0RC1基因 1639A、 CYP2C9 基因 430C、CYP2C9 基因 430T、CYP2C9 基因 1075A 或 CYP2C9 基因 1075C 的重组质粒 和包含有内标基因的重组质粒的混合物，所述阴性对照品为不包含内标基因和目的基因位 点的重组质粒。
[0031] 本发明试剂盒是基于PNA-PCR方法的基因多态性检测试剂盒，其技术原理是：肽 核酸是（peptide nucleic acids,PNA) -类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物。它 是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反 义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了 DNA 中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形 式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和 RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA 间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂 交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、 不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA与互补DNA具有1个碱基不匹配时，其溶解温度会下 降8°C?20°C，2个碱基不匹配时则完全不能杂交，当PNA与互补DNA完全匹配时，因其PNA 为肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键，所以能够阻止DNA扩增。本试剂盒利用PNA的这些特性 进行人类VKORCl和CYP2C9基因多态性位点分型，此处以VKORCl基因 -1639分型为例说明 本发明试剂盒的工作原理：首先根据VKORCl基因 -1639G设计PNA序列1 (序列如SEQ ID NO. 10所示），根据VKORCl基因 -1639A设计PNA序列2 (序列如SEQ ID NO. 11所示），然 后对待测基因同时进行两管PNA-PCR荧光PCR反应（即在进行荧光PCR反应时加入PNA序 列），其中一管PNA-PCR荧光PCR反应中加入PNA序列1，另一管PNA-PCR荧光PCR反应中 加入PNA序列2,当PNA与待测基因的DNA序列相匹配时，荧光PCR反应被阻断，荧光PCR反 应无起线；当PNA与待测基因的DNA序列不相匹配时，荧光PCR反应顺利进行，荧光PCR反 应有起线，因此可以根据两管荧光PCR反应是否起线来判断VKORCl基因 -1639的分型，所 述分型为纯合野生型（仅一管PCR反应起线）、杂合型（二管PCR反应同时起线）或纯合突 变型（仅一管PCR反应起线）。
[0032] 本发明的有益效果：
[0033] (1)利用本发明试剂盒能够对人类VKORCl和CYP2C9基因多态性位点进行定性检 测，根据SNP位点进行两孔PNA-PCR荧光扩增反应，只需根据两孔荧光曲线是否起线就能进 行结果判断，不会产生人为误差，假阳性和假阴性率低，客服了传统ARMS-PCR方法需要根 据Λ ct值进行结果判断，结果判定困难的缺点；
[0034] (2)本发明试剂盒所使用的荧光检测探针为Taqman探针，该探针费用低廉；同时 本发明所有的反应全程闭管操作，PCR反应后不需要进行PCR产物纯化、电泳、酶切、杂交 等，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率，另外降低了 PCR 产物污染引起假阳性的风险。
[0035] (3)本发明试剂盒中包括内标引物和探针，通过检测内标基因，减少了因样本提取 问题导致的假阴性。
[0036] (4)本发明中使用的PNA设计简单，不需要进行特殊的修饰就可以满足人类 VKORCl和CYP2C9基因多态性检测分析。
[0037] (5)本发明试剂盒是采用PNA钳夹荧光定量PCR技术平台，相对于测序法、 PCR-RFLP、芯片法更容易实现高通量检测，更能满足临床使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0038] 附图1是VKORCl基因 -1639纯合野生型扩增曲线。
[0039] 附图2是VKORCl基因 -1639杂合型扩增曲线。
[0040] 附图3是VKORCl基因 -1639纯合突变型扩增曲线。
[0041] 附图4是CYP2C9基因 430纯合野生型扩增曲线。
[0042] 附图5是CYP2C9基因 430杂合型扩增曲线。
[0043] 附图6是CYP2C9基因 430纯合突变型扩增曲线。
[0044] 附图7是CYP2C9基因 1075纯合野生型扩增曲线。
[0045] 附图8是CYP2C9基因 1075杂合型扩增曲线。
[0046] 附图9是CYP2C9基因 1075纯合突变型扩增曲线。
[0047] 附图10是内标β -Actin基因扩增曲线。 具体实施方案
[0048] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。
[0049] 一种用于快速检测人类VKORCl和CYP2C9基因多态性的试剂盒，试剂盒中包括以 下多态性检测的3对引物，3条探针、6条PNA序列、1对β-Actin内标引物和1条内标探 针。
[0050] 用于VKORCl基因 -1639G位点检测的引物、探针和PNA序列：
[0051] 上游引物：AGCAAGAGAAGACCTGAAAAACAAC(SEQ ID NO. 1)
[0052] 下游引物：TGGATCACTTGAGGTCAGGAGTT(SEQ ID NO. 2)
[0053] PNA 序列：ATTGGCCAGGTGC(SEQ ID NO. 10)
[0054] 探针：FAM-CCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGGA-BHQ1 (SEQ ID NO. 7)
[0055] 用于VKORCl基因 -1639A位点检测的引物、探针和PNA序列：
[0056] 上游引物：AGCAAGAGAAGACCTGAAAAACAAC(SEQ ID NO. 1)
[0057] 下游引物：TGGATCACTTGAGGTCAGGAGTT(SEQ ID NO. 2)
[0058] PNA 序列：ATTGGCCGGGTGC(SEQ ID NO. 11)
[0059] 探针：FAM-CCTCGGCCTCCCAAAATGCTAGGA-BHQ1 (SEQ ID NO. 7)
[0060] 用于CYP2C9基因 430C位点检测的引物、探针和PNA序列：
[0061] 上游引物：GACGCTGCGGAATTTTGG(SEQ ID NO. 3)
[0062] 下游引物：CTACTCCATATCACTGACCTTAC(SEQ ID NO. 4)
[0063] PNA 序列：AGCATTGAGGACTGTG(SEQ ID NO. 12)
[0064] 探针：FAM-TCCACAAGGCAGCGGGCTTCC-BHQ1 (SEQ ID NO. 8)
[0065] 用于CYP2C9基因 430T位点检测的引物、探针和PNA序列：
[0066] 上游引物：GACGCTGCGGAATTTTGG(SEQ ID NO. 3)
[0067] 下游引物：CTACTCCATATCACTGACCTTAC(SEQ ID NO. 4)
[0068] PNA 序列：AGCATTGAGGACCGTG(SEQ ID NO. 13)
[0069] 探针：FAM-TCCACAAGGCAGCGGGCTTCC-BHQ1 (SEQ ID NO. 8)
[0070] 用于CYP2C9基因 1075A位点检测的引物、探针和PNA序列：
[0071] 上游引物：TGCAAGACAGGAGCCACATG(SEQ ID NO. 5)
[0072] 下游引物：CATGGAGTTGCAGTGTAGGAGAA(SEQ ID NO. 6)
[0073] PNA 序列：TCCAGAGATACCTTGAC(SEQ ID NO. 14)
[0074] 探针：FAM-CTGCCCCATGCAGTGACCTGTGAC-BHQ1 (SEQ ID NO. 9)
[0075] 用于CYP2C9基因 1075C检测的引物和PNA序列：
[0076] 上游引物：TGCAAGACAGGAGCCACATG(SEQ ID NO. 5)
[0077] 下游引物：CATGGAGTTGCAGTGTAGGAGAA(SEQ ID NO. 6)
[0078] PNA 序列：TCCAGAGATACATTGAC(SEQ ID NO. 15)
[0079] 探针：FAM-CTGCCCCATGCAGTGACCTGTGAC-BHQ1 (SEQ ID NO. 9)
[0080] 用于β-Actin内标扩增的引物和探针序列：
[0081] 上游引物：TTTTCGGGCCAGCTTTCAG(SEQ NO. ID 16)
[0082] 下游引物：TTTCACACGTGCAATCAAAGG(SEQ ID NO. 17)
[0083] 探针序列：AACCTGACTGAGTTAGATATGCGCTTT(SEQ ID NO. 18)
[0084] 所述人类VK0RC1和CYP2C9基因多态性检测剂盒还包括含Mg2+的PCR反应缓冲 液、dNTP混合物、Taq酶和CldH 2O。
[0085] 所述人类VK0RC1和CYP2C9基因多态性检测剂盒还包括6个阳性对照品和1个阴 性对照品，所述阳性对照品为包含有VK0RC1基因 -1639G、VK0RC1基因 1639A、CYP2C9基因 430C、CYP2C9基因 430T、CYP2C9基因 1075A或CYP2C9基因 1075C的重组质粒和包含有内 标基因的重组质粒的混合物，所述阴性对照品为不包含内标基因和目的基因位点的重组质 粒。
[0086] 所述的3条探针为Taqman探针，该探针5'端的荧光基团为FAM，3'端的淬灭基团 为 BHQl。
[0087] 所述的内标探针为Taqman探针，该探针5'端的突光基团为R0X，3'端的洋灭基团 为 BHQl。
[0088] 实施例1探针，引物和PNA合成
[0089] 本发明所述探针、引物和PNA均在上海生工工程股份有限公司合成。
[0090] 实施例2试剂盒组成
[0091] 试剂盒的配置采用PCR8联管形式配置，使用时仅需加入样本/对照品和CldH2O即 可完成实验配置，此种配置更为方便快捷，为优选配置。
[0092] 本实施例中试剂盒采用PCR8联管形式配置，试剂盒配置及PCR8联管的组成如下 表1、表2所不。
[0093] 表1试剂盒组成
[0094]
【权利要求】
1. 一种用于快速检测人类VK0RC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括 3对引物、3条探针、6条PNA序列，1对β -Actin内标引物及1条内标探针，所述3对引物 的序列如SEQ ID NO. 1?SEQ ID NO. 6所示，所述3条探针的序列如SEQ ID NO. 7?SEQ ID NO. 9所示，所述6条PNA序列如SEQ ID NO. 1(Γ?5所示，所述1对β-Actin内标引物的序 列如SEQ ID NO. 16?SEQ ID NO. 17所示，所述1条内标探针的序列如SEQ ID NO. 18所示。
2. 根据权利要求1所述的用于快速检测人类VK0RC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒， 其特征在于，还包括Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶和ddH20。
3. 根据权利要求1所述的用于快速检测人类VK0RC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒， 其特征在于，还包括6个不同的阳性对照品和1个阴性对照品，所述阳性对照品为包含有 VK0RC1 基因-1639G、VK0RC1 基因 1639A、CYP2C9 基因 430C、CYP2C9 基因 430T、CYP2C9 基因 1075A或CYP2C9基因1075C的重组质粒和包含有内标基因的重组质粒的混合物，所述阴性 对照品为不包含内标基因、VK0RC1和CYP2C9基因多态性位点的重组质粒。
4. 根据权利要求1所述的用于快速检测人类VK0RC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒， 其特征在于，所述3条探针为Taqman探针，探针5'端的突光基团为FAM，3'端的洋灭基团 为 BHQ1。
5. 根据权利要求1所述的用于快速检测人类VK0RC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒， 其特征在于，所述1条内标探针为Taqman探针，探针5'端的荧光基团为R0X，3'端的淬灭 基团为BHQ1。
6. 权利要求1所述的用于快速检测人类VK0RC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒的使用 方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 提取待测人的基因组DNA作为检测样品； (2) 取1个PCR8联管，在其中A~F 6个管中分别加入检测样品，另取一个PCR8联管， 在A~F 6个管中分别加入6个不同的阳性对照品，再取一个PCR8联管，在A~F 6个管中分 别加入阴性对照品； (3) 将PCR8联管置于荧光PCR仪器中进行荧光PCR扩增反应，采集FAM和R0X荧光信 号； (4) 结果判断：a.当阳性对照品均有FAM和R0X荧光信号起线，阴性对照品均无 FAM和 R0X荧光信号起线，检测样品均有R0X荧光信号起线时，判断试验成功；b.根据检测样品A 管和B管的FAM荧光信号是否起线判断VK0RC1基因-1639的分型，根据检测样品C管和D 管的FAM荧光信号是否起线判断CYP2C9基因430的分型，根据检测样品E管和F管的FAM 荧光信号是否起线判断CYP2C9基因1075的分型。
7. 根据权利要求6所述的用于快速检测人类VK0RC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒的 使用方法，其特征在于，所述PCR 8联管中A管和B管内含有与检测人类VK0RC1基因-1639 分型相关的PCR反应液，所述C管和D管内含有与检测人类CYP2C9基因430分型相关的 PCR反应液，所述E管和F管中含有与检测人类CYP2C9基因1075分型相关的PCR反应液， 所述PCR反应液包含与检测基因位点相对应的引物、探针、PNA序列、内标引物及内部探针、 Taq酶、dNTP混合液、Mg2+的PCR反应缓冲液和ddH20。
8. 根据权利要求6所述的用于快速检测人类VK0RC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒的 使用方法，其特征在于，所述阳性对照品为包含有VK0RC1基因-1639G、VK0RC1基因1639A、 CYP2C9 基因 430C、CYP2C9 基因 430T、CYP2C9 基因 1075A 或 CYP2C9 基因 1075C 的重组质 粒和包含有内标基因的重组质粒的混合物，所述阴性对照品为不包含内标基因、VK0RC1和 CYP2C9基因多态性位点的重组质粒。
【文档编号】C12Q1/68GK104293920SQ201410474967
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】叶伦, 王宁, 刘金水, 李雪梅, 李倩, 陈刚 申请人:武汉康录生物技术有限公司