一种重组腺相关病毒rAAV载体的分离纯化方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组腺相关病毒载体(rAAV)的分离纯化方法，通过添加磷灰石色谱中的钙离子，有效地改善磷灰石色谱对rAAV载体的结合与分离能力，通过所述方法获得的病毒载体，其纯度与二次氯化铯离心方法相当，并具有体内外生物活性，该方法纯化的重组腺相关病毒载体有望用于基因治疗。
【专利说明】-种重组腺相关病毒rAAV载体的分离纯化方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及用于基因治疗的重组腺相关病毒载体rAAV的分离纯化。
【背景技术】：
[0002] 将目的基因导入靶细胞，纠正先天基因缺陷或者合成具有治疗作用的蛋白， 从而达到预防或治疗疾病的目的，是基因治疗的重要手段。病毒载体因能介导外源基 因长期表达而广受关注。目前较为常用病毒载体有逆转录病毒（Retrovirus)、慢病毒 (Lentivirus)、腺病毒（Adenovirus)和腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV)等[许 瑞安等，《分子基因药物学》，北京大学出版社&北京大学医学出版社，2008,北京]。
[0003] AAV是无包膜单链DNA病毒，属于细小病毒家族，包含4. 7kb的单链DNA基因，是复 制依赖型病毒，要在与辅助病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒与其同时存在时才能在宿主细胞 中复制、包装，产生新的病毒颗粒。AAV具有广泛的宿主范围，在人类和其他动物体的感染是 无症状的，并且没有致病性，可以转染分裂或者非分裂细胞的广泛哺乳动物细胞。AAV在体 内具有特定的组织分布，并且在体内可以长期表达。目前，已发现其有13种亚型及120多种 变型。不同的亚型在人体内具有不同的器官靶向性，不同亚型的AAV在不同器官中表达蛋 白的效率是不同的，这就为基因治疗的器官或组织特异性表达提供了可能。研究表明，AAV1 可以高效转导骨骼肌和其他组织，AAV2可以广泛转导脑、视网膜，AAV4可以特异性地转导 中枢神经系统的室管膜细胞，AAV7、8和9型病毒在肝脏中都能高效表达蛋白，同时AAV9在 肺部和肌肉组织中表达蛋白的效率最高[Dirk Kuck等，J Virol Meth，2007, 140:17-24。 Neal S等，N Engl J Med，2004, 350:586-97]。因此，就有了特定的血清型治疗特定疾病的 临床研究。
[0004] 重组腺相关病毒（rAAV)载体的生产，需要质粒DNA、宿主细胞和培养基等作为原 材料，因此，采用合适的分离、纯化方法，除去rAAV的细胞裂解液中可能存在的质粒DNA，宿 主细胞蛋白，培养基成分，牛血清蛋白以及酶等杂质，得到纯度较高的病毒载体，才能用于 基因治疗的试验研究。
[0005] 目前，色谱方法纯化rAAV载体是保证临床用载体纯化的重要方法，已有不少的 研究报道，主要包括阴、阳离子交换色谱、疏水色谱以及亲和色谱等。为了提高产品纯度， 通常采取几种色谱联合应用或者色谱与密度梯度离心方式相互结合。如碘克沙醇梯度离 心与肝素 P0R0S HE，或者与阳离子交换色谱UN0-S1联合分离rAAV2[Zolotukhin，S等， Methods, 2002, 28 (2) :158-167]，阳离子色谱 P0R0S HS 与阴离子色谱 Q S印harose xl 或者 P0R0S HQ联合分离 rAAV2[US 2007/0243615A1]。阳离子色谱P0R0S HS 分离 rAAV2，rAAV6， 阴离子树脂P〇R〇S HQ分离rAAVl，rAAV8,阴离子P0R0S PI分离rAAV5等。
[0006] 陶瓷轻磷灰石（ceramic hydroxyapatite, CHT)是一种由磷酸|丐构成的无机盐色 谱，以良好的流速、高结合能力，价格低廉等优点，广泛用于蛋白质的工业分离。CHT主要通 过基质中的磷酸根基团或者钙离子的亲和性，与蛋白质相互作用，分离蛋白质[HJerten et al.，1956]。目前有研究报道，CHT色谱可以用于分离rAAV9[Jingmin Zhou，2011]以及rAAV 载体[CN 102803478A]。以上报道分离的rAAV载体，均系通过溶液中添加 PEG作为辅助成 分，从而增加 CHT色谱对rAAV的结合能力和纯度。但是，实验研究发现，加入PEG组成之后， 溶液、管路会变得黏滑，树脂不容易进一步再生，操作不当，极易对进一步纯化造成困难，因 而需要寻找更加合适的附加剂，辅助CHT色谱纯化rAAV载体。
[0007] 在保持载体活性情况下，最大限度地兼顾载体的纯度及得率，是rAAV载体纯化工 艺的巨大挑战。
[0008] 为了更好地解决上述问题，本实验室探讨了利用钙离子替代PEG用于rAAV载体的 纯化，发现在钙离子存在的条件下，磷灰石CHT色谱能够在含有AAV的细胞裂解液中捕获 rAAV颗粒，实现rAAV从CHT色谱中的分离纯化。
[0009] 本发明所述将rAAV载体细胞裂解液或细胞培养上清液，经Bezonase核酸内切酶 处理、在金属钙离子存在的情况下，采用磷灰石色谱（CHT)，或陶瓷氟磷灰石（CHF)色谱，结 合细胞裂解液或者上清液中的rAAV载体，再经含钙离子的洗涤液洗涤和不含钙离子的洗 脱液洗脱，然后经阴离子色谱进一步分离纯化rAAV的方法，迄今尚未见有国内外的相关报 道。
【发明内容】
：
[0010] 本发明提供从细胞裂解液或细胞培养上清液中分离纯化rAAV载体的方法，包括 以下步骤：
[0011] ⑴将要分离的细胞裂解液，经过核酸内切酶Bczonasc?处理，离心后的上清液用 调节成不同钙离子浓度的结合缓冲液溶液，初步除去部分杂蛋白；
[0012] (2)经过钙离子处理澄清的细胞裂解液部分，流经CHT色遒时，rAAV与CHT色谱结 合；
[0013] (3)rAAV与CHT色谱结合后，再经含钙离子的洗涤缓冲溶液和不含钙离子的洗脱 缓冲溶液洗脱；
[0014] (4)然后经阴离子色谱如 ANX-sepherose，P0R0S HQ，DEAE-sepherose 或者 Q-sepherose等进一步分离纯化rAAV。
[0015] 其中：
[0016] 与CHT结合及洗漆缓冲溶液所用的|丐离子浓度选自lppm到500ppm的任意一个； 与CHT结合溶液、洗涤缓冲溶液、洗脱缓冲溶液的pH值可在pH6. 5到pH10. 0的范围，优选中 性值PH7.0;所用的结合、洗涤、洗脱缓冲溶液，可以选用磷酸盐、硼酸盐、三羟甲基氨基甲 烷（Tris)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes)或者相互组合的缓冲溶液；所用结合溶液、洗涤、 洗脱缓冲溶液还包含l_2000mM的NaCl。
[0017] 本发明所述rAAV载体的分离方法可适用于rAAVl，rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5， rAAV6, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAVIO, rAAVll, rAAV12, rAAV13, rAAV14, rAAV15, rAAV16, rAAV17, rAAV18, rAAV19, rAAV20 等载体的纯化。
【专利附图】
【附图说明】：
[0018] 图1.不同浓度钙离子作用下的CHT色谱分离rAAV9
[0019] 其中：A-rAAV2基因组滴度回收率的百分比（η = 3, X土 s.)
[0020] B_rAAV2蛋白量回收率的百分比（η = 3, x土 s.)
[0021] **Ρ〈0· 05-无钙组vs钙离子组
[0022] 图2. rAAV9与CHT色谱的结合能力
[0023] 其中：A-CHT分离rAAV9色谱图
[0024] B-基因组拷贝数测定（η = 3，x土 s.)
[0025] 图3. SDS/PAGE银染鉴别rAAV9纯度
[0026] 其中：A-CHT色谱方法纯化
[0027] B-CsCl方法纯化
[0028] 图4.纯化rAAV9_kal的活性测定
[0029] 其中：A-体外转染rAAV9-kal NCI-H446细胞的kallistatin蛋白表达
[0030] (η = 3, X 土 s.)
[0031] Β-小鼠体内转染rAAV9_kal裸鼠2周后血清中的kallistatin蛋白表达
[0032] (η = 3, X 土 s.)
[0033] 实施方案：
[0034] 以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本 发明。
[0035] 《实施例1》腺相关病毒载体的制备
[0036] 根据[Wright, J. F.等，Mol. Ther. 12, 171 - 178.]方法，ΗΕΚ293 细胞（ATCC)培 养于含有青霉素（10(^/1111)、链霉素（10(^8/1111)(6丨1^(3〇)、10%胎牛血清$85,81)的 DMEM(Gibico)培养基中，37°C，5%的C02培养，当细胞汇合度达到60% -70%时，胰酶消化， 按照2.0E7-3.0E7的细胞数量，接种于转瓶（roller bottle)中，转瓶培养箱，37°C，5%的 C02培养，当细胞汇合度达到60% -70%的时候，包装质粒pH29,腺病毒复制功能质粒pfd6 以及目的基因载体质粒，三种质粒按1:1:1的量，磷酸钙转染]到HEK293细胞[许瑞安、陈 凌、肖卫东主编《分子基因药物学》北京大学出版社&北京大学医学出版社2008,北京]，次 日细胞换液，换成不含血清的DMEM培养基，培养72小时，收获细胞。
[0037] 收获的细胞，采用4000rpm/min，20°C，离心lOmin，得到细胞沉淀部分以及上清液 部分，分别处理。细胞沉淀部分加入30ml/ruller的200mM NaCl超声破碎（NBRANS0N)，力口 入 benzonase (Sigma)至终浓度为 50U/ml，37°C水浴 60min，8000rpm/min，4°C离心 30min，得 到细胞裂解液。
[0038] 《实施例2》重组腺相关病毒载体的氯化铯超速离心法分离纯化
[0039] 采用优化的氯化铯（CsCl)超速离心法[E.Ayuso,2010]，将澄清的细胞裂解液 加入 40 % PEG 8000/2. 5M NaCl 至终浓度为 8 % PEG 8000/U 5MNaCl，4 °C 放置 2 小时， 4, 000rpm/min离心30分钟，保留沉淀，细胞沉淀部分，按照100ml细胞裂解液加入20ml CsCl轻液（1. 37g/cm3)溶解，然后覆盖到CsCl重液（1. 5g/cm3)上层，采用Beckman超速离心 机的T70i转子，20°C，18, 000rpm/min超速离心24h。离心结束，收集载体条带部分，再进行 第二次CsCl超速离心，米用Beckman超速离心机的NTI65转子，20°C，50, 000rpm/min超速 离心20h，注射器吸取载体部分，放入透析袋，PBS透析3次，最后一次透析液为含有0. 01% 的F-68[CN 101018858A]的PBS。滴度测定之后，制成1X1013V. G./ml，0. 2um过滤，无菌分 装-80°C保存备用。
[0040] 《实施例3》不同浓度钙离子对CHT与rAAV结合的影响
[0041] 细胞裂解溶液，采用1M CaCl2调整终浓度至1200, 960,720, 480, 240, 120ppm，室温 放置2小时，8000rpm/min，4°C离心30分钟，上清溶液部分用去离子水稀释4倍，0. 2um滤膜 过滤后用于色谱纯化。将50mM NaCl，5mM NaP04，pH7. 0的平衡缓冲溶液加入1M CaCl2调整 终浓度为 300、240、180、120、60、3(^口111平衡(：!11'色谱10个柱体积（(3〇11111111￥〇1111116,0〇，之 后，30ml澄清的细胞裂解液上样，结束之后采用平衡缓冲溶液洗涤10CV，然后180mM NaCl 的20mM NaP04(pH7.0)洗脱3CV，分别收集穿透、洗涤及洗脱峰，测定穿透、洗涤及洗脱峰中 不同浓度钙离子条件下rAAV基因组滴度及蛋白质的回收率（图1)，结果发现，加入钙离子 的病毒滴度收率均在90%以上，不同浓度的钙离子对载体的产率没有显著性差异，但是与 不加入钙离子的溶液相比，则有显著性差异。实验结果还表明，高浓度的钙离子可能与溶液 中存在的磷酸根离子结合，生成磷酸钙沉淀，可能会导致仪器管路的堵塞，因此30ppm的钙 离子浓度足够用于载体与树脂的结合。
[0042] 《实施例4》不同pH值细胞裂解液对CHT与rAAV结合的影响
[0043] 细胞裂解溶液，采用1M CaCl2调整终浓度至Ca2120ppm，室温放置2小时，8000rpm/ min，4°C离心30分钟，上清溶液部分用去离子水稀释4倍，0. 2um滤膜过滤后用于色谱纯化。 将50mM NaCl，30ppm Ca2+的5mM NaP04的平衡缓冲溶液以及稀释的细胞裂解液调整至pH为 6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0,平衡缓冲溶液至 10 个柱体积（column volume, CV)，之后，30ml 澄清的细胞裂解液A泵上样，上样结束之后采用平衡缓冲溶液洗涤10CV，然后180mM NaCl 的20mM NaP04(pH7. 0)洗脱3CV，收集洗脱峰。测定不同pH条件下洗脱液rAAV9载体滴度 及蛋白得率（表1)，结果表明，不同pH值对载体的产率没有显著性差异，但是，过高pH值同 样有生成磷酸钙沉淀的风险。因此，本发明确定选择平衡细胞裂解液pH值为中性的7. 0作 为CHT分离rAAV的条件。
[0044] 表.1.不同pH条件下rAAV9洗脱液得率（η = 3, x±s.)
[0045]
【权利要求】
1. 一种重组腺相关病毒载体rAAV的分离纯化方法，其特征是，所述方法是将rAAV载 体细胞裂解液或细胞培养上清液经Bezormse?核酸内切酶处理，在钙离子存在下，采用磷 灰石色谱与经缓冲液处理的细胞裂解液或者上清液中的rAAV载体结合，再经含钙离子的 洗涤缓冲溶液洗涤和不含钙离子的洗脱缓冲溶液洗脱，然后经阴离子色谱进一步分离纯化 rAAV 〇
2. 权利要求1所述的rAAV分离纯化方法，其中的磷灰石色谱，包含陶瓷羟基磷灰石 CHT和陶瓷氟磷灰石CHF色谱。
3. 权利要求1所述的rAAV分离纯化方法，其中的结合缓冲溶液和洗涤缓冲溶液均包含 钙离子。
4. 权利要求1所述的rAAV分离纯化方法，其中的结合缓冲溶液和洗涤缓冲溶液的钙离 子浓度选自Ippm至500ppm。
5. 权利要求1所述rAAV的分离纯化方法，其中的结合、洗涤、洗脱缓冲溶液pH值可以 在6. 5-10. 0范围，优选中性ρΗ7· 0。
6. 权利要求1所述rAAV的分离纯化方法，其中的结合、洗涤、洗脱缓冲溶液选自磷酸 盐、硼酸盐、三羟甲基氨基甲烷Tris和羟乙基哌嗪乙硫磺酸H印es缓冲溶液，或者相互组合 的缓冲溶液。
7. 权利要求1所述rAAV的分离纯化方法，其中的阴离子色谱可以是ANX-sepherose、 POROS HQ、DEAE_sepherose 或者 Q-sepherose。
8. 权利要求1所述rAAV的分离纯化方法，其中可适用的rAAV载体包括：rAAVl、rAAV2、 rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12、rAAV13、rAAV14、 rAAV 15、rAAV 16、rAAV 17、rAAV 18、rAAV 19、rAAV20 等载体的纯化。
【文档编号】C12N15/864GK104232687SQ201410474564
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】许瑞安, 曲伟红 申请人:许瑞安