一种伯克氏菌及其在防治三七土传病害中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种伯克氏菌菌株(Burkholderia arboris)YIM AF 1514，于2014年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.9733，同时公开了使用本发明提供的菌株制备的菌悬液。本发明提供的伯克氏菌菌株及菌悬液能有效防止三七种植中的土传病害，降低三七根腐病发病率，并提高三七出苗率。
CGMCC NO9733
20140924
【专利说明】一种伯克氏菌及其在防治三七土传病害中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种菌株，具体涉及一种伯克氏菌株及其在防治三七土传病害中的应 用。
【背景技术】
[0002] 三七是云南文山地区主要的经济作物，性喜温暖阴湿，其独特的生长环境容易诱 发多种土传病害。由于三七神奇的药用功效，全球对三七及其相关产品的需求日益增加，而 可供种植三七的区域并不多，因此大多数地区采取三七连作的种植方式。随着三七种植年 限的增加，土传病害的种类、发病面积及严重程度逐年增加，严重损害三七的产量和质量， 其中最主要的病害为根腐病。
[0003] 根腐病是由于土壤中微生物失调，大量病原性和真菌侵染三七植株根部导致的， 土壤中微生物失调是导致三七连作障碍的一个重要因素，目前常用的治理方法主要是施用 杀菌剂，但是效果越来越不理想，而采用高效熏蒸剂进行土壤灭生处理，然后再补充益生菌 剂调整微生物区系使土壤活化和健化的方法则成本较高，效果也不理想。
[0004] 伯克氏菌是一种假单胞菌，广泛分布于自然环境中，不同的菌株表型相同，但是基 因型不同，有些类型的伯克氏菌在农业上可用作生物降解、生物控制及促进植物生长之根 圈微生物，但还有一些是植物致病菌甚至是人体条件致病菌，而且由于伯克氏菌具有较强 的抗生素抗药性及较高的运动性，因此，在农业上应用伯克氏菌具有一定的潜在风险，在菌 株的选择上需得非常谨慎。中国专利201010290583. 8公开了一种水稻根围伯克氏菌，这个 菌株在防治水稻纹枯病方面有非常好的效果，但是用这个菌株的菌悬液接种烟叶时，会在 24小时内导致典型的过敏反应，因此，如果要利用伯克氏菌解决不同作物的土传病害，如何 分离纯化出最合适的伯克氏菌株就很重要。
[0005] 目前对于三七连作障碍已有较多的研究，但是利用三七根际土壤中的益生菌，尤 其是伯克氏菌来抑制三七土传病害的发生，从而在一定程度上解决三七连作障碍的研究尚 未见诸报道。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明提供了一种伯克氏菌株及其在防治三七土传病害中的应 用方法。
[0007] 本发明所提供的一种伯克氏菌菌株（Burkholderia arboris)?Μ AF 1514,于 2014年9月24日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO. 9733。
[0008] 本发明提供伯克氏菌菌株?Μ AF 1514,是从云南省文山红壤三七种植区的三七 根际土壤中分离得到的，具体步骤为：
[0009] (1) 土样处理：准备灭菌Ih后的三角瓶，纯水，以及玻璃珠。将玻璃珠放入装有 20ml无菌水的三角瓶中，并取2. Og新鲜土样加入三角瓶中，混勻，室温下150r/min摇勻 45min〇
[0010] (2)涂布：取ImL(I)中的混悬液加入9. OmL无菌水，连续稀释3次获得稀释度为 1〇_4的样品液，接着取120 μ L样品液均匀涂布在分离培养基（牛肉膏蛋白胨）上，并做三 个重复。
[0011] (3)培养与纯化：涂布好的平板于28°C培养3天，之后挑取在牛肉膏蛋白胨培养基 上的单个菌落在ISP2琼脂培养基上画线纯化培养，纯化培养后得到的菌株作为供试菌株， 并用牛奶管将菌株进行暂时保藏。
[0012] (4)分类地位的确定：提取供试菌株的DNA，进行16SrRNA测序确定菌株的分类地 位。
[0013] (5)活性筛选：采用水琼脂扩散法进行活性筛选，将其菌株发酵3天，取其发酵液 作用于混有病原菌的培养基（培养基成分：0.8%的多聚蛋白胨，0.4%的酵母提取物）中， 观察其透明圈的大小。
[0014] (6)活性验证：将其新鲜菌体接种于混有病原菌的培养基（培养基成分：0. 8 %的 多聚蛋白胨，0.4%的酵母提取物）上，观察其抑菌圈的大小。
[0015] 通过以上实验筛选出抗菌效果最好的一株菌株（YM AF 1514)，并扩大培养，提取 其DNA，通过16SrNA克隆测序确定其分类地位，并于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心保藏。
[0016] 本发明所提供的伯克氏菌菌株（Burkholderia arborisRlM AF 1514的主要表 型及生物学特征如下：该菌为革兰氏阴性细菌，需氧型，在培养基（含0. 8%的多聚蛋白胨 +0. 4%的酵母提取物）上生长的菌落为圆形，呈密黄色，表面及边缘光滑、潮湿，电镜下观 察呈棒状。该菌最适合生长温度为28-30°C，pH为5. 5-6。
[0017] 本发明还提供了一种采用上述保藏编号为CGMCC NO. 9733的伯克氏菌菌株?Μ AF 1514制备的菌悬液，所述菌悬液浓度为0D600 = 1. 62,可直接应用于防治三七土传病害。
[0018] 制备上述菌悬液时所用培养基含有0. 8%的多聚蛋白胨和0. 4%的酵母提取物。
[0019] 本发明的有益效果如下：
[0020] 此外，本发明提供的伯克氏菌?Μ AF 1514被鉴定为属于Burkholderia arboris， 该菌型已被确定为是益生菌，具有较高的安全性。
[0021] 本发明首次在种植三七的土壤里面发现这种菌，并成功分离出抗菌效果最好的菌 株，在抗困实验中能有效地诘抗多种植物致病困。
[0022] 利用该菌株制备的菌悬液在盆栽实验和田间试验中，能有效地提高三七出苗率及 降低三七根腐病发病率，验证了该菌株适宜用作防治三七土传病害的生防菌。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为伯克氏菌?Μ AF 1514在培养基（含0.8%的多聚蛋白胨+0.4%的酵母提 取物）上生长的菌落形态；
[0024] 图2为伯克氏菌?Μ AF 1514的抗尖端镰孢菌（三七病原菌）实验效果图；
[0025] 图3为伯克氏菌?Μ AF 1514的抗香蕉枯萎病菌实验效果图；
[0026] 图4为伯克氏菌?Μ AF 1514的抗番茄灰毒病菌实验效果图；
[0027] 图5为伯克氏菌?Μ AF 1514的抗烟草赤星病菌实验效果图；
[0028] 图6为伯克氏菌?Μ AF 1514的抗白菜黑斑病菌实验效果图。
【具体实施方式】
[0029] 为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结 合具体图示，进一步阐述本发明。
[0030] 实施例1 :
[0031] 采集云南省文山地区一块三七田中的三七根际土壤进行相关的试验，其具体步骤 为：
[0032] (1) 土样处理：准备灭菌Ih后的三角瓶，纯水，以及玻璃珠。将玻璃珠放入装有 20ml无菌水的三角瓶中，并取2. Og新鲜土样加入三角瓶中，混勻，室温下150r/min摇勻 45min〇
[0033] (2)涂布：取ImL(I)中的混悬液加入9. OmL无菌水，连续稀释3次获得稀释度为 1〇_4的样品液，接着取120 μ L样品液均匀涂布在分离培养基（牛肉膏蛋白胨）上，并做三 个重复。
[0034] (3)培养与纯化：涂布好的平板于28°C培养3天，之后挑取在牛肉膏蛋白胨培养基 上的单个菌落在ISP2琼脂培养基上画线纯化培养，纯化培养后得到的菌株作为供试菌株， 并用牛奶管将菌株进行保藏。
[0035] (4)分类地位的确定：提取供试菌株的DNA，进行16SrRNA测序确定菌株的分类地 位。
[0036] (5)活性筛选：采用水琼脂扩散法进行活性筛选，将其菌株发酵3天，取其发酵液 作用于混有病原菌的培养基（培养基成分：0.8%的多聚蛋白胨，0.4%的酵母提取物）中， 观察其透明圈的大小。
[0037] (6)活性验证：将其新鲜菌体接种于混有病原菌的培养基（培养基成分：0. 8%的 多聚蛋白胨，0.4%的酵母提取物）上，观察其抑菌圈的大小。
[0038] 通过以上实验筛选出抗菌效果最好的一株菌株（YM AF 1514)，并扩大培养，提取 其DNA，通过16SrNA克隆测序确定了分类地位，其登录号为：KM487703,该菌株隶属于变形 菌门-变形菌纲-伯克氏菌目-伯克氏科-伯克氏菌属。并于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO. 9733,保藏日期为2014年9月24日。
[0039] 保藏号为：CGMCC NO. 9733的菌株的生物学特征为：该菌为革兰氏阴性细菌，需氧 型，在培养基（含0.8%的多聚蛋白胨+0.4%的酵母提取物）上生长的菌落为圆形，呈密 黄色，表面及边缘光滑、潮湿，电镜下观察呈棒状。该菌最适合生长温度为28-30°C，pH为 5. 5-6〇
[0040] 实施例2 :
[0041] 利用保藏编号为CGMCC NO. 9733的菌株进行抗菌实验：先将这株菌在含0. 8%多 聚蛋白胨和〇. 4%酵母提取物的培养基上培养2天，继而挑取单菌落转接到摇瓶里面培养3 天；再用水琼脂扩散法将其代谢产物与植物致病菌：尖端镰孢菌（三七病原菌）、香蕉枯萎 病菌、番茄灰毒病菌、烟草赤星病菌、白菜黑斑病菌进行作用，如图2-图6,发现其代谢产物 对植物致病菌具有很好的拮抗作用。
[0042] 实施例3 :
[0043] 将保藏编号为CGMCC NO. 9733的菌株在含0. 8%多聚蛋白胨和0. 4%酵母提取物 的培养基上培养2天，并准备好装有无菌水的玻璃试管；将菌体制成菌悬液，所述菌悬液浓 度为0D600 = 1. 62,然后将已制备的菌悬液分别按1:100倍稀释应用。准备3个重复以及空 白对照，将其作用于同样条件下正常生长的三七盆中，分别在1个月、3个月、6个月、12个月 这几个时间段观察和记录三七的生长状况，结果发现：在1个月后，对照组的植株与试验组 的植株相比，没有其显著的差异；3个月后，对照组与试验组的植株间则出现了差异，表现 为：对照组的植株有17. 96%的出现了叶子变黄，边缘萎缩的症状，而试验组的仅有4. 23% 的植株出现了这样的情况；6个月后则变为对照组的有29, 56%的植株出现了枯黄，而试验 组的仅有11. 26%的植株出现了枯黄；12个月后，对照组的植株有40. 67%的植株出现了枯 死的症状，而试验组的有17. 3%的植株有此现象，说明这株菌在盆栽试验中能对三七的土 传病害起到很好的作用。
[0044] 实施例5 :
[0045] 将保藏编号为CGMCC NO. 9733的菌株转为三七田间试验，在田间自然栽培环境下 验证该菌株对三七根腐病害的抑制效果，具体如下：
[0046] (1)供试土壤基本情况：试验安排于砚山三七种植区的连作障碍土壤，试验区常 年根腐发病率在30% - 60%，并随连作年限延长发病率不断攀升，有的片区土壤已不能耕 种，发病率高达80%以上，甚至全棚绝收。本试验选用了区域已连作三七3年的大棚土壤供 试研究，在6个棚内分别设置6组对比试验，每个棚栽设置一组对比试验，同一个棚内，除试 验处理差异外，保持试验区土壤环境及栽培管理技术相统一。
[0047] (2)试验处理与方法：在6个棚栽内施用菌悬液处理分别标记为V A2、A3、A4、A5、 A6，未施用菌悬液的对照处理分别标记为CKp CK2、CK3、CK4、CK5、CK6，试验各处理小区面积均 为5X2 = 10m2,把已制备0D600 = L 62的菌悬液分别按1:100倍稀释应用，A1至A6的各 处理施入的稀释菌悬液均为lOOml/m 2,移栽盖土后均匀喷施于表土，覆盖6-8cm松茅后各处 理墒面均匀喷施清水50kg KK1至CK2的各对照处理移栽盖土后均匀喷施清水IOOmVm2于 表土，覆盖6-8cm松茅后各处理墒面均匀喷施清水50kg。
[0048] (3)试验结果：如表1所示，从不同的田间对比试验看出，施用本发明提供的菌悬 液处理的A 1至A6，其出苗率在69. 7 - 89. 3 %，而同地对照的CK1至CK6，其出苗率在46. 5 - 74. 5%，说明使用本发明提供的菌悬液能显著提高同地块的三七出苗率；全年发病率平均 值来看，A1至怂各处理组分别比CK 1至CK6同地块对照组降低30-40%，说明使用本发明提供 的菌悬液能显著降低同地块的三七全年发病率。因此，本发明的保藏编号为CGMCCN0. 9733 的菌株对抑制三七根腐病害的发生及蔓延具有较好的作用功效，针对三七连作障碍情况宜 开发成土壤生物修复产品推广应用。
[0049] 表1 :三七种植土壤生物修复对比试验日/月
[0050]
【权利要求】
1. 一种伯克氏菌菌株（Burkholderia arboris) YIM AF 1514,于 2014 年 9 月 24 日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO. 9733。
2. -种采用权利要求1所述保藏编号为CGMCC NO. 9733的伯克氏菌菌株HM AF 1514 制备的菌悬液，其特征在于，所述菌悬液浓度为0D600 = 1. 62。
3. 根据权利要求2所述菌悬液，其特征在于，制备菌悬液时所用培养基含有0. 8%的多 聚蛋白胨和〇. 4%的酵母提取物。
4. 权利要求1所述伯克氏菌HMAF 1514在防治三七土传病害中的应用。
5. 权利要求2所述菌悬液在防治三七土传病害中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK104371952SQ201410519966
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】官会林, 陆晓菊, 唐蜀昆 申请人:云南师范大学