一株腈降解生物膜形成基因工程菌及在含腈废水处理中的应用的制作方法
【专利摘要】一株腈降解生物膜形成基因工程菌及在含腈废水处理中的应用属于生物工程技术；该基因工程菌株Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr，已于2014年07月25日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.9484。该菌株是通过基因工程于段将Rhodococcus rhodochrous BX2中的腈水解酶基因插入到Bacillus subtilis N4中表达而得。该菌株能够产生生物膜并且降解乙腈，经过在合成废水中37℃，60r/min培养48h，生物膜形成量OD570nm值为1.45；在含有800mg/L乙腈的合成废水中，37℃，160rpm振荡培养48h后乙腈的残留浓度为23.56mg/L。该菌株抗乙腈冲击能力强，在移动床生物膜反应器运行35d后，可将合成废水中800mg/L的乙腈降至出水的0.32mg/L，合成废水的COD值由487mg/L降至出水的16.39mg/L。本发明的菌株为利用生物膜法处理含腈废水提供了新方法。
CGMCCNo.9484
2014.07.25
【专利说明】一株腈降解生物膜形成基因工程菌及在含腈废水处理中的 应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，主要涉及一株腈降解-生物膜形成双功能基因工 程菌及其在含腈废水处理中的应用。
【背景技术】
[0002] 乙腈是一种含氰基（R-CN)的有机化工原料，广泛用于制药、合成纤维、石油化工 等领域，是含腈废水中的主要成分之一。含腈废水中的乙腈进入自然水域后会引起鱼类等 水生生物大批死亡，对生态环境造成严重的破坏。乙腈可由吸入、食入及皮肤吸收而进入体 内，在生物体内转化为剧毒物质--氰化氢和乙醛，威胁人畜健康。腈水解酶（nitrilase) 是腈降解菌代谢腈类化合物的重要降解酶之一，通过一步反应即可将腈转化为相应的羧酸 和氨。
[0003] 生物膜（Biofilms)是指由附着于惰性或者活性实体表面的细菌细胞和包裹细菌 的水合性基质所组成的结构性细菌群落。形成生物膜是绝大多数微生物生长的最理想模 式，生物膜能够有效地阻止抗菌剂、杀虫剂、重金属、宿主防御机制等的伤害，提高细菌在环 境中的适应性。研究发现，细菌在生物膜中比浮游状态下的代谢活力更强，降解质粒发生转 移的频率更高，有利于废水的生物处理。然而在自然状态下，生物膜内微生物菌群往往不能 承受高浓度有毒物质，所以当在处理高浓度难降解废水时效率较低，甚至失效。因此，有针 对性的筛选降解某种污染物的微生物，将其与生物膜形成菌一起加入生物反应器中强化污 水治理是解决上述问题的一种行之有效的方法。但此方法也存在一定问题，主要包括：①污 染物降解菌与成膜菌之间有可能存在竞争生长；②污染物降解菌若无法很好地定殖于成膜 菌中，则降解菌容易流失，废水处理效果不佳。如果将对污染物具有降解能力的基因转入生 物膜形成菌中，就可以在一定程度上解决上述问题，从而降低处理成本、减少污染。因此利 用基因工程手段构建多功能工程菌株，开发出既具有降解腈类化合物能力，同时又具备生 物膜形成能力的双功能菌株，用于含腈废水的生物膜法处理中，将具有较高的经济效益、社 会效益和生态效益。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于构建一株高效表达腈水解酶同时可形成生物膜的基因工程菌 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr，并将该菌株应用于降解乙腈及含腈废 水的处理。
[0005] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
[0006] 本发明所提供的腈降解生物膜形成双功能基因工程菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr，已于2014年07月25日保藏于"中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心（简称CGMCC) "，其保藏号为CGMCCNo. 9484。地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
[0007] 本发明利用的原始菌株为乙腈高效降解菌Rhodococcus rhodochrous BX2和具有 强生物膜形成能力的Bacillus subtilis N4。本发明利用基因工程手段将Rhodococcus rhodochrous BX2中的腈水解酶基因（腈水解酶可降解乙腈）插入到Bacillus subtilis N4中表达，获得腈降解-生物膜形成双功能菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT0I-Nitr〇
[0008] 所述的基因工程菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-pHTOl-Nitr是通过如 下方法构建的：以Rhodococcus rhodochrous BX2的总DNA作为模板，根据腈水解酶基因的 基因序列和枯草芽孢杆菌表达载体PHTOl的多克隆酶切位点设计引物，通过PCR扩增出腈 水解酶基因DNA片段。将腈水解酶基因片段克隆到pMD18-T载体上，经PCR鉴定出的阳性克 隆进行测序，将测序成功的PCR产物腈水解酶基因片段通过酶切位点连接到原核表达载体 pHTOl上，转入大肠杆菌DH5 a中，经质粒PCR和Xbal/Aatll双酶切鉴定，筛选阳性重组子， 成功构建枯草芽孢杆菌原核表达载体pHTOl-Nitr，通过电转化法将表达载体pHTOl-Nitr 转入具有生物膜形成能力的野生型Bacillus subtilis M中。经过提取质粒PCR、双酶 切和测序筛选出阳性重组克隆，构建含腈水解酶基因的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr 双功能菌。
[0009] 所述的基因工程菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr能够产生 生物膜：枯草芽抱杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr在合成废水中 养48h内，生物膜形成量OD57tol值可达到1. 4以上。
[0010] 所述的基因工程菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis M-pHTOl-Nitr可以降解 乙腈：在含有800mg/L乙腈的合成废水中，接种双功能菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr后，乙腈浓度迅速下降，48h后乙腈的残留浓度为23. 56mg/L。
[0011] 所述的基因工程菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr在含腈废 水处理中的应用：合成废水中乙腈的添加浓度为800mg/L，在抗冲击能力实验中，枯草芽孢 杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr的抗乙腈冲击能力强，在连续六次更换合成废水 后，其最终在诱导8小时内对合成废水中乙腈的降解率达到49% ;在生物反应器处理含腈 废水试验中，投加活性污泥与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr的MBBR反 应器在运行35d乙腈浓度为0. 32mg/L，出水COD值为16. 39mg/L。
[0012] 所述的原始菌株Rhodococcus rhodochrous BX2和Bacillus subtilis N4均由本 实验室分离所得。（孙晶，熊明华，成小松，李悦，臧海莲，李春艳。Rhodococcus Sp.BX2菌对 乙腈的降解特性及其降解途径研究[J].环境科学学报，2012,32(5) :1041-1048. Chunyan Li, Yue Li, Xiaosong Cheng, Liping Feng, Chuanwu Xi, Ying Zhang. Immobilization of Rhodococcus rhodochrous BX2 (an acetonitriledegrading bacterium)with biofilm-forming bacteria for wastewater treatment, Bioresource Technology 131(2013)390-396.)
[0013] E. coli competent cells DH5a 购自 TransGen。
[0014] 质粒载体pMD18_T simple vector,购自大连宝生物科技有限公司。
[0015] 枯草杆菌表达载体pHTOl购自德国分子生物技术（Molecular Biotechnology)公 司。
[0016] 本发明提供的菌株，一方面充实了乙腈降解的微生物资源，另一方面，通过基因克 隆手段使成膜菌不仅具有成膜能力，同时还具有腈降解功能，进一步研究其用于移动床生 物膜反应器（MBBR)处理含腈废水的效果，为含腈废水处理新方法的开发奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1腈水解酶基因的琼脂糖凝胶电泳图。
[0018] 图2质粒pMD18-T-Nitr的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
[0019] 图3pHT01-Nitr载体双酶切结果图。
[0020] 图4枯草芽孢杆菌中重组质粒pHTOl-Nitr的双酶切结果图。
[0021] 图 5 枯草芽抱杆菌 Bacillus subtilis N4-pHT01_Nitr SDS-PAGE 电泳图。
[0022] 图6枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr的生物膜形成量变化曲 线。
[0023] 图7枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr对乙腈的耐受情况图。
[0024] 图8枯草芽抱杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr对乙臆的降解能力图。
[0025] 图9枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr的生物膜抗乙腈冲击能力 图。
[0026] 图IOMBBR生物膜反应器模拟含腈废水处理过程中，出水乙腈残留量变化曲线。
[0027] 图IIMBBR生物膜反应器模拟含腈废水处理过程中，出水COD变化曲线。
【具体实施方式】
[0028] 实例1、基因工程菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr的构建
[0029] (I) Rhodococcus rhodochrous BX2中臆水解酶基因的PCR扩增及亚克隆
[0030] 以Rhodococcus rhodochrous BX2的总DNA作为模板，根据臆水解酶基因的基因 序列和枯草芽孢杆菌表达载体PHTOl的多克隆酶切位点设计的引物5，GCGTCTAGAATGGTCGA ATACACAAACAAITTC3' 和 5' ATTGACGTCTCAGATGGAGGCTGTCGC3' (下划线处依次为 XbaI 酶切 位点和AatII酶切位点）为引物，通过PCR扩增出长为IlOlbp的腈水解酶基因DNA的基因 片段，该腈水解酶基因的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示，其中1，2为腈水解酶基因的PCR产 物，M为IOOOObp的DNA Marker，与预期目的片段大小一致。将腈水解酶基因加A尾完成后 与 PMD18-T simple vector 进行连接，连接成功后将 pMD18-T-Nitr 转化 E. coli DH5a，筛 选阳性重组子pMD18-T-Nitr，得到纯化的质粒pMD18-T-Nitr (如图2)。
[0031] (2)pHT01-Nitr表达载体的构建
[0032] 将含有pMD18-T_Nitr和pHTOl质粒的E. coli DH5 a分别在含1〇〇 y g/mL氨苄青 霉素和50 ii g/mL氨苄青霉素LB培养基中35°C，160rpm过夜培养。提取pMD18-T-Nitr和 pHTOl质粒，所提质粒分别用限制性内切酶XbaI和AatII进行双酶切，酶切结束后，立即进 行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，然后用OMEGA试剂盒回收酶切成功的目的片段并进行连接，连 接结束后，转化E. coli DH5a化学感受态细胞。扩增培养后得到重组子PHT01-Nitr，以该 重组子为模板进行PCR扩增，得到大小为IlOlbp的片段，与腈水解酶基因片段大小相符。重 组子经限制性内切酶Xba I和Aat II双酶切得到IlOlbp和7955bp两条片段，分别对应于 腈水解酶基因和PHTOl的大小，证实了腈水解酶基因与pHTOl载体成功重组，如图3所示， 其中1，2为pHTOl-Nitr载体双酶切结果；M为15000bp DNA Marker。
[0033] (3)电转化表达载体 pHTOl-Nitr 转入 Bacillus subtilis M 中
[0034] 制备B. subtilis M电转化感受态细胞，将构建好的表达载体pHTOl-Nitr通过电 击转化法转入B. subtilis M，在含有氯霉素（5 ii g/mL)的LB固体培养基中培养，挑取单菌 落培养并提取质粒，进行质粒PCR和双酶切鉴定，双酶切结果如图4所示，得到2条分别与 腈水解酶基因和pHTOl载体大小相符的条带，证明质粒已成功转入B. subtilis M中，重组 的双功能菌命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr。
[0035] (4)重组质粒pHTOl-Nitr的遗传稳定性及在蛋白水平的表达
[0036] 质粒在子代细胞中的不均匀分配是质粒丢失的主要原因，常使部分子代细胞不含 质粒。为了证明重组质粒能否在B. subtilis M中进行稳定遗传，将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr在指数期以1 %的接种量连续转接25代后分别在选择性LB培养 基（含5 y g/mL氯霉素）和非选择性LB培养基（不含氯霉素）上涂布培养，计算两平板上 的菌落数，按下述公式计算质粒丢失率。
【权利要求】
1. 一株腈降解生物膜形成双功能基因工程菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr，该菌株已于2014年07月25日保藏于"中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心（简称CGMCC) "，保藏号为CGMCCNo. 9484。
2. 如权利要求1所述的一株腈降解生物膜形成双功能基因工程菌枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr 产生生物膜。
3. 如权利要求1所述的一株腈降解生物膜形成双功能基因工程菌枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr 用于降解乙臆。
4. 如权利要求3所述的一株腈降解生物膜形成双功能基因工程菌枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis N4-pHT01-Nitr在含腈废水处理中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK104293725SQ201410519862
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月23日 优先权日:2014年9月23日
【发明者】李春艳, 成毅, 杨亚丽, 岳振雷, 冯凤兆, 徐春红, 黄馨凝, 侯宁, 安雪姣, 成小松 申请人:东北农业大学