一种抗h7亚型禽流感病毒单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种抗H7亚型禽流感病毒单克隆抗体及其应用，属于生物【技术领域】。本发明筛选出一株杂交瘤细胞株5D2，用其制备的鼠腹水抗体对H7-AIV的血凝抑制（HI）效价为11log2，ELISA效价为2×105。本发明的杂交瘤细胞株分泌的抗H7-AIV单克隆抗体，HI和ELISA效价高，用其组装成的胶体金免疫层析检测试纸条特异性强，除H7-AIV显示阳性结果外，禽的其它病毒均为阴性结果，可用于家禽或哺乳动物等感染H7-AIV的现场诊断，10分钟内出结果，结果直观，肉眼即可容易做出判断。本发明的杂交瘤细胞株分泌抗体组装成的诊断试剂盒，保存一年后敏感性未降低，稳定性好。
CGMCC No.9589
2014.09.05
【专利说明】一种抗H7亚型禽流感病毒单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗H7亚型禽流感病毒单克隆抗体及其应用，属于生物【技术领域】，涉及抗体工程技术。具体为抗H7-AIV高效价单克隆抗体，对禽源和哺乳动物源的H7-AI毒株均具有高效价，可以用于H7-AI发病禽和哺乳动物的现场快速诊断。
【背景技术】
[0002]人感染H7N9禽流感疫情是由H7N9禽流感病毒引起的急性呼吸道感染性疾病，其中重症肺炎病例常可合并急性呼吸窘迫综合征、感染性休克，甚至多器官功能衰竭。
[0003]H7N9亚型禽流感(H7-AI)是由H7亚型禽流感病毒(H7-AIV)引起的禽和哺乳动物的一种呼吸道传染病。人感染H7N9禽流感疫情是由H7N9禽流感病毒引起的急性呼吸道感染性疾病，该病2013年2月在我国发生，H7-AIV对家禽无致病力或低致病力，家禽能感染但不发病。但该病毒存在变异成高致病性毒株的可能性，将对家禽产业发展带来更大风险。传染源可能为携带H7N9亚型AIV的禽类。H7N9禽流感可经呼吸道传播，或密切接触感染禽类的分泌物或排泄物而获得感染；或通过接触病毒污染的环境传播至人。目前阳性样品主要来自活禽交易场点，但不排除少数养禽场存在污染。在发病前I周内接触过禽类或者到过活禽市场者，特别是老年人，属于高危人群。
[0004]人感染H7N9禽流感潜伏期一般为3?4天。感染率现在还没有确切的流行病学调查数据，病死率为31.66%。患者一般表现为流感样症状(如发热、咳嗽、少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛、腹泻等全身症状)。重症患者病情发展迅速，多在发病3-7天出现重症肺炎，体温大多持续在39°C以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰。常快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、感染性休克，甚至多器官功能障碍，部分患者可出现胸腔积液等表现。患者白细胞总数一般不高或降低。重症患者多有白细胞总数及淋巴细胞减少，可有血小板降低。
[0005]到2013年8月10日，上海、安徽、江苏、浙江、北京、河南、山东、江西、湖南、福建、河北、广东和台湾等13省(市)共报告确诊病例135例，其中死亡45例。2013年10月中旬开始，浙江、广东、广西、台湾、上海、江苏、福建、北京、安徽、湖南、贵州、吉林等12省(市、自治区)和香港特别行政区、台湾等又开始发生H7N9疫情，截至2014年3月20日已累计报告病例379例，死亡120例。病例以老年人居多，男性多于女性(男:女=2.034:1)。大部分人感染H7N9禽流感确诊者为散发病例，有个别家庭聚集发病现象，但尚无持续人际间传播的证据；不排除有限的非持续的人传人。人感染H7N9禽流感疫情对我国家禽产业带来了严重冲击。据中国畜牧业协会统计，2013年上半年家禽产业直接损失600亿元，2014年以来已损失200亿元。
[0006]早发现、早报告、早诊断、早治疗，加强重症病例救治，注意中西医并重，是有效防控、提高治愈率、降低病死率的关键。《人感染H7N9禽流感诊疗方案》(2014版)明确“在病例早期识别中宜首选核酸检测”，但核酸检测需时长。只有在建立该病快速诊断方法的基础上，才能做到早发现、早报告、早诊断、早治疗，实现提高治愈率、降低病死率的目标。
[0007]H7N9禽流感为2013年2月开始在中国发生的一种新的疫情，可感染人和家禽，人感染后出现严重的流感样临床症状，导致高病死率。家禽感染后一般不表现临床症状，成为人感染H7N9禽流感疫情的传染源，因此建立一种快速直观的病原检测方法，对于及时发现、剔除家禽中的H7N9流感病毒，切实保障养禽业生产安全、动物产品质量安全和公共卫生安全也必将发挥重要作用。
[0008]本发明从鸽肛拭子检测分离到I株H7N9禽流感病毒，以灭活的该病毒为免疫原和检测抗原，运用杂交瘤技术建立了分泌抗H7-AIV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞库，通过ELISA试验和HI试验筛选出了分泌高效价(腹水HI效价为11 log2，ELISA效价为2 X 15)单克隆抗体杂交瘤细胞5D2株，利用该抗体研制的胶体金免疫层析检测试纸条检测方法具有特异性强、敏感性高，检测临床样品10分钟内出结果，结果直观易于判断，肉眼即可做出判断。
【发明内容】
[0009]技术问题
本发明的目的是提供一种抗H7亚型禽流感病毒单克隆抗体，及用该单克隆抗体组装的胶体金试剂盒在H7-AI快速诊断上的应用。杂交瘤细胞株的建立是用灭活的H7-AIV为抗原，免疫BALB/c鼠，利用杂交瘤技术建立抗H7-AIV特异单克隆抗体杂交瘤细胞库获得的。用该杂交瘤细胞制备的BALB/c鼠腹水，建立胶体金免疫层析试纸条检测方法，组装成试剂盒，用于家禽和哺乳动物等感染H7-AIV (包括H7N9)的临床快速诊断。
[0010]技术方案
一种分泌抗H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株5D2于2014年09月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC N0.9589，分类命名:抗H7亚型禽流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0011]用所述杂交瘤细胞株5D2制备的抗H7-AIV单克隆抗体，可在制备H7-AI诊断试纸条中得到应用。所述单克隆抗体对H7-AIV的HI效价为11 log2, ELISA效价为2X 105。所述单克隆抗体诊断试纸条用于禽或哺乳动物H7-AI的快速诊断，加样后10分钟内出现结果O
[0012]有益效果本发明的特点和优点如下:
1.本发明使用的H7免疫原是将分离自感染鸽的H7-AIV灭活所得。
[0013]2.本发明从建立的6株分泌抗H7-AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞库中筛选出一株杂交瘤细胞，用其制备的鼠腹水抗体对H7-AIV的血凝抑制HI效价为11 log2, ELISA效价闻达2 X 150
[0014]3.本发明杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体组装成的胶体金免疫层析检测试纸条试剂盒，用于临床快速诊断家禽和哺乳动物等是否感染了 H7亚型禽流感病毒(包括H7N9)，10分钟内出现结果，结果直观，肉眼即可容易做出判断。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1胶体金免疫层析试纸条结构组装图图2特异性试验结果图3敏感性检测结果。
【具体实施方式】
[0016](一)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
I H7抗原的制备利用江苏省疾病预防控制中心实验室，将从无锡朝阳家禽批发市场采集、RT-PCR检测为H7-AIV阳性鸽咽拭子，无菌处理后接种于10日龄SPF鸡胚，观察鸡胚死亡情况。剔除24 h内死亡胚，96 h仍未死的鸡胚放入一 20°C冷冻，冷冻2 h后收集鸡胚尿囊液。将尿囊液在4°C条件下、8，000 rpm离心30 min,取上清置于超速离心管中，4°C条件下、36，000 rpm离心2 h，弃上清，沉淀用生理盐水重悬，并用分光光度计测定病毒浓度，灭活后保存备用。
[0017]动物免疫用纯化病毒液灭活后作为免疫原，背部皮下注射免疫6?8周龄雌性BALB/c鼠，0.5 ml/只。首免用等体积弗氏完全佐剂乳化抗原，再用弗氏不完全佐剂乳化抗原免疫两次，各次免疫之间间隔14天。三免后第10天眼眶采血，测定血清抗体效价。选取血清效价> 12800的鼠，融合前3天用不加佐剂的同等剂量的抗原腹腔加强免疫。
[0018]饲养细胞的制备摘除未免疫BALB/c鼠眼球采血，分离血清作为检测抗体时的阴性对照血清。通过拉颈脱位致死鼠，于75%酒精中浸泡10 min，腹部向上固定，无菌剪开腹部皮肤，镊子剥离皮肤，暴露腹膜；注射器注射10 mL DMEM基础培养基至腹腔，注意避免穿入肠管，右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部I min，随后抽出注入的培养液，用一定量的含I % HAT培养基将沉淀细胞悬浮，将上述细胞悬液加入96孔板，每孔2滴(约100 uL)，置37°C、5% CO2培养箱中培养。
[0019]细胞融合采用PEG细胞融合方法。按1: 5?1: 10的比例取SP2/0骨髓瘤细胞与免疫的BALB/c鼠脾细胞，于50 mL离心管中充分混匀，1,000 rpm离心10 min，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置40°C水浴预热，用I mL吸管在45 s内加完预热至40°C的50% PEG-4000 I mL，边加边轻轻振荡，加完作用I min，继而在5 min内加入15 mL预热至37°C的无小牛血清Hyclone-DMEM培养基，速度由慢到快。37°C静置10 min, I, 000rpm离心10 min，弃上清，加入含20% FCS和含1% HAT的Hyclone-DMEM培养基，将沉淀细胞悬浮起来，分装到已有饲养细胞的96孔板，每孔2滴，在含5 % CO2培养箱中培养。5d后补加含1% HAT和20% FCS的Hyclone-DMEM培养基，1d后改用含1% HT和20 %FCS的Hyclone-DMEM培养基，观察杂交瘤细胞的生长情况，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测。
[0020]杂交瘤细胞的筛选按方阵法确定纯化灭活抗原的包被浓度，用包被液为0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液对纯化的H7抗原进行倍比稀释，用1: 1600稀释的抗原液包被ELISA板，100 yL/孔，置37°C孵育I h后，4 1:包被过夜(不少于12 h)，PBST洗涤3次，每次3 min,最后一次拍干；以含1% BSA的PBST进行封闭，200 μ L/孔，37 °C放置40min, PBST洗涤5次，每次3 min，最后一次拍干；将融合后12 d的细胞上清、I: 400稀释的免疫鼠阳性血清和1: 400稀释的鼠阴性血清加入相应孔内，100 μ L/孔，37 °C作用Ih，PBST洗涤3次，每次3 min，最后一次拍干；加入1: 10000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG，100 yL/孔，37 °C放置2 h，PBST洗涤5次，每次3 min，最后一次拍干；加入显色液TMB，100 μ L/孔，室温避光显色15 min ;每孔加入50 μ L 2 mol/L硫酸溶液终止反应。经酶标仪测定OD45tlnm值，以空白对照调零，P为各检测孔的OD45tlnm值，N为阴性参考血清的OD45tlnm值，当阴性参考血清的OD45tlnm值彡0.1，阳性参考血清的OD45tlnm值与阴性参考血清的OD45tlnm值的比值彡2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，P/N彡2.1的检测孔判为阳性，1.5彡P/N < 2.1的检测孔判为可疑，P/N < 1.5的检测孔判为阴性。隔2?3 d后再检测一次，选择两次检测结果均为阳性孔的杂交瘤细胞株进行克隆。
[0021]杂交瘤细胞的克隆化首先将阳性孔细胞用含I %HT和20 %FCS的Hyclone-DMEM培养基吹下，在铺有饲养细胞的96孔板中，先在第一行各列中进行2倍倍比稀释，然后按行进行2倍倍比稀释，最后每孔再补加一滴含I %HT和20%FCS的Hyc1ne-DMEM培养基，在含5% CO2培养箱中37 °C培养。4?5 d后，每孔补加两滴含I %HT和20 %FCS的Hyclone-DMEM培养基。7 d后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，对只有单个克隆生长的孔进行标记，8?9 d时取细胞上清，及时进行ELISA检测。选择阳性孔的单克隆细胞按上述方法再克隆3次，直至克隆后所有细胞孔上清均为阳性、且各孔检测OD值较接近。将克隆化的单克隆杂交瘤细胞株扩大培养，冻存，建立了 6株能稳定分泌抗H7-AIV特异单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0022]腹水的制备将灭菌的液体石蜡腹腔注射8?10周龄的BALB/c鼠，0.5 mL/只，7天后，将杂交瘤细胞株5D2注射到BALB/c鼠腹腔，每只0.5 mL(含2X 16?5X 16个杂交瘤细胞)，7?10 d后采集腹部明显鼓起鼠的腹水，3，OOOXg离心10 min，收集上清，分装后于一 20°C保存备用。
[0023]腹水的纯化采用辛酸-硫酸铵法进行纯化:(I)将腹水在4°C条件下12，000rpm离心30 min，去除细胞碎片和一些杂蛋白析出物。(2)吸取腹水上清，加入3倍体积的60 mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0)稀释后，用0.1 M NaOH调pH至4.5 (—般pH刚好在4.5左右，可不用调)。(3)室温条件下，逐滴加入辛酸并搅拌(每毫升腹水加33μ L辛酸)，加入时，待前一滴溶解后再加另一滴。加入辛酸后，搅拌30 min, 4 °C静置2 h以上，使其充分沉淀。
(4)在4 °C条件下，12，000 rpm离心30 min,收集上清。(5)上清液用普通滤纸进行过滤，滤液收集到锥形瓶中，加入1/10体积的10XPBS (0.1 M pH 7.4)，并用2 M NaOH调至pH7.4，冰浴至4°C放置。(6)上述混合液加入固体硫酸铵至0.277 g/mL ((TC条件下，45 %饱合硫酸铵为0.291 g/mL)，冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵，搅拌30 min。(7)4°C静置过夜，在4°C条件下13,000 rpm离心30 min，弃上清，再短暂离心，将沉淀溶解于137 mMNaCl,2.6 mM KCl、0.2 mM EDTA 的 pH 7.4 PBS 中(浓缩至原腹水体积的 1/5)，于 50 ?100倍体积的上述PBS中4 °C透析过夜。(8)取少量透析样品经适当稀释后，在核酸蛋白定量仪上测定蛋白含量，进行SDS-PAGE电泳，分析纯化效果。一 70°C冻存纯化的腹水。
[0024]杂交瘤细胞株的生物学特性
9.1杂交瘤细胞株染色体分析用姬姆萨染色法对杂交瘤细胞进行染色体计数。分别取SP2/0骨髓瘤细胞、鼠脾细胞和阳性杂交瘤细胞5D2进行培养，生长到对数期，向细胞瓶中加入秋水仙素，使其终浓度为0.1 μ g/ml，然后放入细胞培养箱中继续培养4?5 h。用5 mL 37°C预温的0.075 mol/L KCl低渗溶液将细胞吹起混匀，置37°C温箱作用30 min,向其中加入新配制的固定液(甲醇:冰醋酸为3: I) I mL，边滴加边混匀，1000 rpm离心10 min。弃上清留细胞沉淀,用5 mL固定液将细胞吹起,37°C作用30 min, 1000 rpm离心10 min,重复上述操作一次。细胞沉淀用I mL固定液悬起混匀,用滴管吸取悬液I滴,滴在预先冰冻的载玻片上，平铺于载玻片上，自然干燥。用新配制的姬姆萨染液染色10 min,自来水冲洗后晾干，置于显微镜下进行观察。此杂交瘤细胞株的染色体数量为98条，而骨髓瘤细胞的染色体数量为65条，鼠脾细胞染色体数量为40条,证明所获得的杂交瘤细胞株5D2是两种细胞融合的结果。
[0025]分泌抗体稳定性测定将获得的杂交瘤细胞株5D2进行连续培养传代30次以上、液氮冻存与复苏试验，用间接ELISA连续检测杂交瘤细胞培养上清液中的抗体效价均为6400，证明此杂交瘤细胞株5D2仍能稳定地分泌单克隆抗体。
[0026]单克隆抗体的效价测定用间接ELISA测定杂交瘤细胞培养上清和小鼠腹水的效价，结果显示，杂交瘤细胞5D2培养上清ELISA效价为6400，HI效价为6 log2，腹水ELISA效价 204800，HI 效价为 11 log2。
[0027]单克隆抗体的特异性取5D2杂交瘤细胞上清，采用间接ELISA方法和HI试验，对禽流感病毒H7亚型血凝抑制试验抗原(H7-AIAg)、禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原(H5-AIAg)、H9N2亚型禽流感病毒(H9-AIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸭肝炎病毒(DHV)、小鹅瘟病毒(GPV)和坦布苏病毒(TMUV)(均为公知公用毒株，前两者为哈尔滨维科生物技术开发公司产品，公司网址:http://www.hvriwk.com ;李银,刘宇卓，张敬峰，等.一株鸭源H9亚型禽流感病毒在鸡胚上传代及繁殖规律的研究[J].江苏农业科学，2006，4:94-96 ;魏雪涛，李银，刘宇卓，等.一株新城疫病毒分离株全基因组序列的克隆与分析[J].江苏农业学报，2008，24 (2):159-163 ;凌雯，钱建飞，李银，等.鸡腺胃型传染性支气管炎病毒金坛分离株核蛋白基因分析及与标准强毒株同源性比较[J].中国兽医学报，2002, 22 (2):111-113 ;魏雪涛,于敏，张敬峰,等.一株安徽株雏鸭肝炎病毒的分离及鉴定[J].江西农业学报，2007，19 (9):94-96 ;刘宇卓，李银，魏雪涛，等.鹅细小病毒LH株的分离鉴定[J],江苏农业学报，2009，25 (5): 1091-1094 ;黄欣梅，李银，赵冬敏，等.新型鹅黄病毒JS804毒株的分离与鉴定[J].江苏农业学报，2011，27 (2):354-360.)进行试验，结果无论是采用ELISA方法还是HI试验，5D2上清只与H7_AIAg有反应，表明5D2单抗针对H7-AIAg具有特异性。
[0028]二)H7亚型禽流感病毒单克隆抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制及检验 I 5D2单抗腹水的纯化
采用辛酸-硫酸铵法进行纯化。取5D2腹水单抗5 mL, 12000 rpm，4°C离心30 min,除去表层脂质；加入60 mM的醋酸钠-醋酸缓冲液1: 4稀释，并用0.1 M NaOH调pH至4.5 ;缓慢向样品中加入165 PL辛酸，最好逐滴加入，混匀，置4°C作用2 h，离心，取上清；力口入1/10体积的10 XPBS,充分混匀，用2M NaOH调pH至7.4，4°C冰浴放置；加入等体积硫酸铵，4°C冰浴下搅拌30 min，4°C静置过夜；次日，13000 rpm 4°C离心30 min，弃去上清液；用PBS或生理盐水重悬沉淀，将重悬物吸出，移入透析袋内，放入装有1000 mL PBS的烧杯中，透析12?24 h，每6 h换液一次；透析充分后，取出透析袋，小心吸出重悬物，离心，取上清，即为纯化的蛋白，经SDS-PAGE分析纯化效果，并测定其含量，分装后置一 20°C保存备用。
[0029]兔抗H7亚型禽流感病毒多克隆抗体的制备与纯化
用纯化后灭活的H7-AIV作为免疫抗原，与弗氏完全佐剂1:1混合，充分乳化后，免疫2?3 Kg新西兰大耳兔3只，2 mL/只，尽量采取背部皮内多点注射。再用弗氏不完全佐剂乳化抗原免疫两次，每两次之间间隔14 d。四免时，背部皮下多点注射抗原液，I mL/只。10d后耳缘静脉采血，测定血清抗体效价。选取血清效价> 12800的大耳兔，采血制备多克隆血清抗体。采用辛酸-硫酸铵法纯化兔抗H7-AIV多克隆血清抗体，纯化后经SDS-PAGE分析纯化效果，并测定其含量，一 20°C保存备用。
[0030]免疫胶体金的制备
3.1确定胶体金标记抗体的最适pH值取8支试管,按I?8号顺序进行标记,在8支试管中各加入I mL胶体金溶液；调节胶体金溶液的pH值，使各管之间差值为0.5，即I?8号试管分别从pH 6.0调节至pH9.5 ;向8支试管中各加入已标记的抗体I mL,混勻；静置5 min后，各加入10% NaCl溶液100 μ L，混勻，I?2h内，随时观察试管内颜色变化，2?7管中免疫胶体金溶液颜色始终鲜红，较为稳定，综合得出胶体金标记抗体的最佳PH值为第5管即pH值为8.0。
[0031]3.2确定胶体金标记抗体的最适蛋白浓度取10支试管，按I?10号顺序进行标记，在10支试管中各加入I mL胶体金溶液；用0.0lM pH8.0 (3.1中确定的)的PB溶液稀释纯化的5D2腹水单抗,按照最高50 μ g/mL,最低5 μ g/mL的蛋白浓度标准,按逐次递减5 μ g/mL的10个浓度梯度稀释，分别取I mL加入I?10号试管中，混匀；静置5 min,分别加入10% NaCl溶液100 μ L，混匀，I?2 h内，随时观察试管内颜色变化，I?8管中均为蛋白含量达到足以稳定胶体金溶液的红色不变，第9管因蛋白含量不足呈现一定的蓝色沉淀，取颜色变化交界处的试管(第8管)，因此确定第8管内所含胶体金标记抗体蛋白浓度为临界值，其中的蛋白含量即是蛋白最低稳定含量，从而确定稳定I mL胶体金的最小蛋白浓度为15 μ g/mL,因为父体金标记蛋白的最佳浓度，即为在蛋白最低稳定含量的基础上加10%的浓度，即胶体金标记抗体最佳浓度20 μ g/mL (15 + 5 = 20 μ g/mL)。
[0032]3.3胶体金标记蛋白的制备吸取20 mL 20 nm颗粒胶体金液，置于高压灭菌后的烧杯中，用0.1M 1(20)3溶液调节pH为8.0 ;室温下，缓慢加入适量纯化后的腹水单抗，使其最终浓度为20 μ g/mL,即为上述试验中已确定的最佳浓度,作用30 min ;加入0.8 mL10% BSA，室温作用5 min;最后加入0.4 mL 10% PEG20000，室温搅拌5 min ;4°C静置过夜。
[0033]3.4胶体金-抗体复合物的纯化取标记好的胶体金-抗体复合物在4°C条件下，离心60 min ;小心仔细地慢慢吸出上清液,切记不可倾倒。尽量吸净上清液,然后加入2 mL配制好的胶体金-抗体保存液重悬沉淀，悬浮液即为胶体金标记的单克隆抗体。
[0034]胶体金免疫层析检测试纸条的初步组装与应用
4.1胶体金-抗体结合物最佳稀释度的确定用工作液将制备的胶体金标记的单克隆抗体液分别稀释4倍、6倍、8倍、10倍，制备不同稀释度的金标垫；用纯化的兔抗禽流感病毒多抗和羊抗鼠IgG固相硝酸纤维素膜(NC)，组装成试纸条，检测H7亚型禽流感病毒，根据条带的清晰程度确定达到试纸条敏感度要求的胶体金-抗体结合物最佳稀释度为1: 4。
[0035]4.2胶体金-抗体结合物玻璃纤维素膜的制备取胶体金-抗体结合物最佳稀释液0.5 mL，均匀地加在玻璃纤维素膜上，置于平坦处，37°C条件下作用3 h，待烤干后，置4°C备用。
[0036]4.3包被抗体固相硝酸纤维素膜(NC膜)的制备用10 μ L移液器吸取纯化的兔抗Η7亚型禽流感病毒IgG抗体，包被硝酸纤维素膜T线，作为检测线；用10 μ L移液器取羊抗鼠HRP-1gG，包被硝酸纤维素膜C线，作为质控线；将固相抗体硝酸纤维素膜置于37°C10 min ;晾干后,置4°C保存备用。
[0037]4.4胶体金免疫层析检测试纸条的组装取PVC胶板，揭开上面的光纸，露出粘面；将NC膜、吸水垫、胶体金-抗体结合物玻璃纤维素膜及样品垫按一定顺序相互连接固定好；用剪刀将粘贴好的PVC板剪成相等大小的条带，边角尽量平整完好,这样,胶体金免疫层析试纸条即制作完毕。试纸条结构组装图如图1所示。
[0038]4.5胶体金免疫层析试纸条的特异性试验用组装好的胶体金免疫层析试纸条检测 H7-AIAg、H5-AIAg、H9-AIV、IBV、TMUV, DHV、GPV 和 NDV 8 种病毒，同时设立生理盐水和PBS作为阴性对照，结果如图2所示，除H7-AIAg样品检测为阳性外，其它抗原、病毒液、生理盐水和PBS均为阴性，表明该胶体金免疫层析检测试纸条特异性良好。
[0039]4.6胶体金免疫层析试纸条的敏感性试验将禽流感病毒H7亚型血凝抑制试验抗原(H7-AIAg)用生理盐水进行2倍倍比稀释，用胶体金免疫层析试纸条检测其敏感性。结果如图3所不，HA ^ 4 log2检测结果为阳性。
[0040]4.7胶体金免疫层析试纸条的重复性试验用不同批次的试纸条对H7_AIAg、H5-AIAg, H9-AIV、IBV、DHV、GPV, NDV、TMUV等进行重复检测，检测结果表明该胶体金免疫层析试纸条重复性良好。
[0041]4.8胶体金免疫层析试纸条的稳定性试验将同一批次的试纸条装于密封袋内，封好口，内置干燥剂，以防吸水潮湿，影响效果。装好后分别保存于4°C和一 20°C。每隔一个月各取出2条，与最新制备的试纸条进行平行检测，结果表明:在4°C和一 20°C保存I?12个月的试纸条，与新制备的试纸条对样品进行平行检测，检测结果均一致，表明该试纸条无论在4°C还是在一 20°C条件下保存，保存期至少为12个月，至于其最终保存期有待继续测定。
[0042](三)胶体金免疫层析试纸条的临床应用
取临床内脏研磨病料和肛拭子，采用RT-PCR方法和胶体金免疫层析试纸条进行检测，结果显示:在150份临床样品中，两种方法检测均为阳性的4份，均为阴性的146份，两种方法检测结果完全相符，而且采用胶体金免疫层析试纸条检测，10分钟内出结果，肉眼即可判断。
【权利要求】
1.一种分泌抗H7亚型禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞5D2于2014年09月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC N0.9589，分类命名:抗H7亚型禽流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株。
2.用权利要求1所述杂交瘤细胞株5D2制备的抗H7-AIV单克隆抗体。
3.权利要求2所述的抗H7-AIV单克隆抗体的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，是指在制备禽类动物H7-AI的诊断试纸条中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，是指在制备哺乳动物H7-AI的诊断试纸条中的应用。
【文档编号】C12N5/20GK104312979SQ201410519544
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】李银, 刘晓燕, 赵冬敏, 黄欣梅, 杨婧, 刘宇卓, 韩凯凯, 刘岳龙, 戴建君, 祁贤, 刘青涛, 谢星星 申请人:江苏省农业科学院, 江苏立华牧业有限公司