专利名称：新脂酶和其产生方法以及产生这种脂酶的微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种脂酶、产生该脂酶的方法以及产生该脂酶的微生物，更具体地说，本发明涉及一种在高温下显示出高活性的由属于青枯伯克氏菌(Pseudomonas solanacearum)的细菌产生的新耐热脂酶、产生该酯酶的微生物以及产生该脂酶的方法。
背景技术：
脂酶是一种酶的普通种类，它水解甘油三酯，以前曾通过动物内部器官的提取，或者是用微生物来产生。
脂酶作为一种酶，广泛地用于食品加工调味奶制品产物、用作助消化的药物、用于血脂测定诊断，同时在工业上也用于脂肪和油脂的水解和改进。要求脂酶具有适于这些应用的各种性质，并且在各种领域应用耐热脂酶，并要求其有多种使用。
在食品加工中，从食品卫生的观点看，要求在高温下进行酶反应，其具有低的细菌污染。在脂肪和油脂的分解中，已考虑到应用脂酶。脂肪和油脂水解是产生脂肪酸的和甘油的方法，脂肪酸和甘油是石化产品诸如除垢剂、化妆品和表面活性剂的原料。目前，主要应用Colgate-emery法，这种方法使脂肪和油脂在250-260℃和50-55大气压与蒸汽接触，然而，这种方法需要大型设备，并不适合中、小规模肥皂生产。因此，研究了脂酶对脂肪和油脂的分解。
然而，组成各种脂肪和油脂的硬酯酸(熔点为67-70℃)和棕榈酸(熔点为63-64℃)在常温下为固体。因此，脂肪和油脂的反应必须在熔点以上的温度才能发生。所以，用于脂肪和油脂分解的脂酶必须有高的耐热性，同时在高温下具有高反应性。
而且，在最近几年，脂酶已用于解决造纸工业树脂问题(日本审查过的专利出版物平4-29794)。常规上适合解决树脂问题的酶反应最适温度是35-55℃。由于常规酶在70℃以上失活，造纸过程中酶反应的温度受到限制，因此使用脂酶的整个造纸过程中必须控制温度。而且，酶不耐热，这是限制酶在研磨处理部分用于解决树脂问题的原因之一。
目前，市场上大多数的公知的用于作为耐热脂酶之酶的热稳定性不够，也很不实用。因此日本一个未审查的专利出版物昭62-79782提出了一种耐热脂酶。然而，酶的最适温度是60-70℃，而且它的耐热性也不够，因为在70℃处理15分钟后剩余活性低于10％。此外，由于这种酶很难作用于三醋精和丁酸甘油酯，它的用途限于食品加工。已经公开了一种来源于根霉属的耐热脂酶(日本未检查专利出版物昭59-156282)，但是这种酶的最适温度是60℃，在高温下的反应性不够。而且，有一些关于由臭味假单胞菌lipolytica变种产生的脂酶的报道，其最适温度为70℃，在60℃热处理4小时后失活(日本审查过的专利出版物昭50-25553)；而由莓实假单胞菌产生的脂酶，最适温度为75-80℃，经过70℃20分钟的热处理以后，仍保持95％的活性(农业生物化学41，1353-1358(1977))。然而，这些酶最适温度不超过80℃。考虑到耐热性，在经过80℃热处理1小时后，其活性在一定程度上减少。因此，它们在耐热性方面不是十分令人满意的。
发明目的如上所述，公知的脂酶在高温时的耐热性和反应性是不够的，那么，在实践上用脂酶的机会在一些领域(例如在食品加工、工业、造纸工艺)中就会很少，同时在应用脂酶的过程中还存在受限制的温度条件问题。
因而，本发明的目的是提供中具有高的耐热性的脂酶。同时，另一个目的是提供所述脂酶的产生方法、具有极好耐热性的脂酶和产生这种耐热脂酶的细菌。
附图简要描述
图1是显示反应pH值和由SD709产生的脂酶的相对活性之间的关系的图。
图2是显示由SD709产生的脂酶在变化的pH值、37℃保持1小时后的剩余活性的图。
图3是显示反应温度和由SD709产生的脂酶的相对活性之间的关系的图。
图4是显示由SD709产生的脂酶在pH值为7的条件下经过在各种温度处理1小时之后的剩余活性的图。
图5是显示由SD709产生的脂酶在存在和不存在EDTA时反应的温度和脂酶的相对活度之间的关系的图。
发明描述本发明发明人分离、培养、筛选大量微生物获得了一种具有高耐热性和在高温下具有高的反应性的脂酶，同时发现由青枯伯克氏菌SD709(FERMP-14786)代表的菌株(其是在日本的Chiba县土壤中分离出来的)产生新的耐热脂酶。迄今为止，人们熟知由大量菌株产生的脂酶，但是仍还不了解来源于青枯伯克氏菌的耐热脂酶。本发明人确认新的耐热脂酶在高温下对脂类的水解特别有效，因而完成了本发明。也就是说，本发明提供了如下所给出的脂酶、其产生方法和产生这种脂酶的微生物。
1)一种脂酶，在30℃至100℃的温度范围内以甘油三油酸酯乳液为底物测定时，其具有从30℃到100℃的活性温度，从85℃到100℃的最适温度。优选的脂酶具有以下特性(1)活性pH值和最适pH值在pH值4-12范围内用甘油三油酸酯乳液作为底物测定时，活性pH值为4-12，最适pH值为6.5-9.5。
(2)分子量用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定时分子量为32,000±2,000。
2)一种脂酶，在30℃至100℃的温度范围内在5mM EDTA存在下以甘油三油酸酯乳液为底物测定时，其具有从30℃到100℃的活性温度，从85℃到90℃的最适温度。优选的脂酶具有以下特性(1)活性pH值和最适pH值在pH值4-12的范围内用甘油三油酸酯乳液作为底物测定时，活性pH值为4-12，最适pH值为6.5-9.5。
(2)分子量用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定时分子量为32,000±2,000。
3)在1〕或2〕中描述的脂酶，其是从属于假单胞杆菌属(Pseudomonas)的细菌培养物中获得的，优选地是，所说的属于假单胞杆菌属的细菌是青枯伯克氏菌(Pseudomonas solanacearum)。
4)在1〕或2〕中描述的脂酶，其是从属于青枯伯克氏菌SD709(FERMP-14786)的培养物获得的。
5)在1〕或2〕中描述的属于假单胞杆菌属的细菌，其产生了一种脂酶，优选的所述细菌是青枯伯克氏菌，更优选的是青枯伯克氏菌SD709(FERMP-14786)，或者是其菌学(mycologically)上的等价物或者是它们的突变体。
6)一种产生脂酶的方法，其中包括培养5〕中所描述的细菌和从培养基获得1〕或2〕中所描述的脂酶。[产生菌株]按照本发明，用于产生这种脂酶的微生物不是特别地受限制，只要这些细菌能产生具有如下描述的性质的脂酶。这样一种细菌可以从保存的菌株或者从自然界新近分离的微生物中选择得到，优选的细菌是一种属于假单胞杆菌属的细菌，一种更优选的细菌属于青枯伯克氏菌的细菌，进一步优选的是青枯伯克氏菌SD709和其菌学上的等价物。在本申请中，菌学上的等价物意味着具有几乎相同的菌学性质的菌株。等价物包括自然的或者是人工突变体，只要它们具有如下描述的性质。
产生本发明新的脂酶菌株的例子是SD709，本发明发明人是在日本的Chiba县土壤中分离出来的。
SD709菌株有如下性质。
(1)形态学 杆状(2)革兰氏染色剂阴性(3)孢子(-)(4)游动性 (+)(5)鞭毛极性多鞭毛(6)氧化酶 阳性(7)过氧化氢酶 阳性(8)OF检验 0(9)荧光染色产物(-)(10)水溶性染色产物 (-)
(11)原儿茶酸裂解 正(12)精氨酸二水合酶 阴性(13)41℃生长 不可能(14)反硝化作用 阳性(15)明胶液化 阳性(16)淀粉分解 阴性(17)PHB积累 (+)(18)同化葡萄糖 +D-木糖 -D-核糖 +L-鼠李糖-乙酰丙酸+柠檬酸盐+中康酸盐-福寿草醇-2，3-丁烯乙二醇 -间羟基苯甲酸-色胺-蔗糖+辛酸盐 +L-(+)-酒石酸+(19)醌 Q-8将上述具有菌学分类性质的细菌与Bergey细菌分类学手册(1984)的其它菌株相比较，结果，该菌株被确定为青枯伯克氏菌。该菌株于1995年2月23日以P-14786保存在工业科学和技术机构国立生命科学和人体技术研究所(1-1-3，Higashi，Tsuduba，Ibaragi，Japan)，并且依据布达佩斯条约，自1995年12月28 作为青枯伯克氏菌((Pseudomonas sp.)SD709(FERMBP-5358)转为国际保藏。
具有以下描述特性的产生脂酶的突变体可以自发获得或通过以上面的菌株作为亲本菌株诱变获得，并且这种突变体可用作产生脂酶的细菌，制备这种突变体的常规方法是，例如，一种包括用人工的方法(如紫外照射、用N-甲基-N-硝基-N-nitro soguanidine(NTG)处理等等)进行诱变的方法。将亲本菌株接种在含有油脂如橄榄油等的琼脂培养基上，选择在菌落周围形成较大、界限清晰的菌落，用脂酶产生培养基来培养，选择产率高的菌株。[脂酶的产生]按照本发明的脂酶，主要是在培养产生脂酶的细菌之培养物中获得的。培养基的营养成份是广泛使用的。碳源可以使用可同化的碳化合物或含有它们的物质，如葡萄糖、脂肪和油脂、玉米浸提物、Tween表面活性物质等。氮源可以用可同化氮化合物或含有它们的物质，如铵盐、硝酸盐、大豆粉、肉膏、玉米浸提物、pharmamedia。无机盐如磷酸盐、镁盐、钙盐、锰盐适合使用。
培养条件因培养基成份不同而有所变化，但是选择了用于生产所需脂酶的合适条件。通常，培养温度是10-35℃，优选的在20-30℃，培养时间大约是8-100小时，当脂酶含量达到最大时，终止培养。用于生产这种脂酶的培养基优选pH值是7-10。通过这样的培养，脂酶在细胞外产生了所需的脂酶(在培养物中)。[分离和纯化方法]回收培养基中以上述方式所得到的脂酶，可以用常规方法经分离和纯化回收脂酶。
也就是说，通过用公知的合适方法(如过滤、离心)从培养物分离细菌细胞和固体培养基获得上清液或滤过物，用一种或数种分离和纯化方法处理浓缩或非浓缩的该分离液，从而得到脂酶。所述的分离活和纯化方法例如盐析法(通过加入可溶性盐沉淀酶)、有机溶剂沉淀法(通过加入亲水性有机溶剂沉淀酶或杂质)、吸附/解吸附法(使用离子交换树脂、凝胶过滤)、加或不加脂酶的喷雾干燥、冷冻干燥。[酶活性测定法]以多聚甘油三油酸酯乳剂为底物(聚乙烯乙醇)(PVA)测定脂酶活性。活性测定实施方案如下。
将含有0.1ml酶溶液、0.4ml 200mM Tris缓冲液和甘油三油酸酯乳液的混合溶液放入具有密闭塞子的试管中加热至37℃反应10分钟，加入0.2ml盐酸使反应停止。制备甘油三油酸酯乳液，将2.5g甘油三油酸酯加入到10ml 2％PVA水溶液中(Poval PVA117(商标，Kuraray Co. Ltd.)PovalPVA205(商标，Kuraray Co. Ltd.)＝9∶1)，18000rpm低温离心10分钟使其均匀混合；反应停止后加入2ml N-己烷，2ml异丙醇和1ml蒸馏水，用力震荡后静置，用TLC-FID方法(Minagawa et al.，Lipids，18，732，1983)测定己烷层中样品的油酸含量。活性单位(U)为每分钟产生1毫摩尔油酸的脂酶量。[酶特性]作为本发明这种脂酶的一个例子，由以上所述的青枯伯克氏菌SD709产生的脂酶其特性如下。(1)作用其作用于甘油酯并水解其酯。(2)底物特异性它广泛地水解各种甘油酯、酯等。相对活性以每一种甘油酯-PVA乳液作为甘油酯底物由上述的酶活性测定方法来测定。对甘油酯的分解能力为100，将所得的值与之比较得到其相对活性。丁酸甘油酯的相对活性为180，橄榄油为75，豆油为90，棉籽油为74。
酯的分解能力是通过以对硝基苯酚脂肪酸酯为底物在pH值为8.0，温度30℃时水解产生的对硝基苯酚(0D405)的比色法测定。
而相对活性则是以对硝基苯酚棕榈酸盐(pNPP)的分解能力为100，与之相比较对硝基苯酚戊酸盐(PNPL)为170，对硝基苯酚月桂酸盐(pNPV)为60。(3)活性pH值和最适pH值用甘油三油酸酯乳液作为底物以上述的脂酶活性测定方法确定pH值。在4-12范围内确定了反应pH值，混合缓冲液由100mMe-氨基己酸、100mM双(2-羟乙基)亚氨基三(羟乙基)甲烷(bistris)、100mM N-三(羟乙基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)组成，在使用前用盐酸或氢氧化钠调节其pH值。反应的pH值与相对活性的关系如图1所示。在4-12范围内测定活性pH值为4-12，最适宜的pH值为6.5-9.5。(4)pH稳定性用上述的酶活性测定方法测定在pH值4-12范围内以变化的pH值、37℃处理1小时后的剩余活性，pH值与剩余活性的关系如图2所示。在pH值4-11范围内，其剩余活性不低于50％。测定所用的缓冲液由以下溶液组成；pH4-5醋酸/醋酸钠、pH6-7磷酸、pH8-9tris/盐酸、pH10-12甘氨酸/氢氧化钠。(5)活性温度和最适温度用同样方法测定，所不同的是以甘油三油酸酯乳液为底物，反应温度在30-100℃范围内变化。反应温度与反应活性的关系如图3所示。在30-100℃内确定的活性温度为30-100℃，最适温度为85-100℃。
用上述同样的酶活性分析法测定活性温度和最适温度，所不同的是以甘油三油酸酸乳液为底物，在5mM乙二胺四乙酸(EDTA)以及反应温度在30-100℃范围内变化。反应温度与相对活性的关系如图5所示。在30-100℃温度范围内确定的活性温度为30-100℃，最适温度为80-90℃。(6)温度稳定性用上述酶活性测定方法测定pH7时，温度变化范围为30-100℃处理1小时后的剩余活性。处理温度与剩余活性的关系如图4所示。处理温度为80℃时，其剩余活性为100％。(7)分子量由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法得到的分子量为32,000±2,000。(8)等电点由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法得到等电点是8.8±0.5。
实施本发明的最好方式现在，举出下列例子说明本发明，但这些例子不是用来限制本发明的范围。除非有其它说明，下列实施例中的％均为重量百分比。
实例1培养产生脂酶的细菌(SD709)将包含豆粉(2％)、葡萄糖(1％)、磷酸氢二铵(0.1％)、磷酸氢二钾(0.5％)、硫酸镁七水合物(0.1％)和碳酸钠(0.3％)液体培养基(2ml)放入直径18mm试管中，用高压灭菌器121℃下灭菌20分钟，接种一铂环量的青枯伯克氏菌SD709，并于30℃、130rpm培养24小时。然后离心分离去掉细菌细胞，获得脂酶溶液。该溶液脂酶活性为5U/ml。
实例2培养产生脂酶细菌(SD709)和回收脂酶将包含豆剂(2％)、磷酸氢二铵(0.1％)、磷酸氢二钾(0.5％)、硫酸镁heptahydrate(0.1％)和碳酸钠(0.3％)和Tween85(1％)液体培养基(2升)放入5升的培养罐中，120℃在高压灭菌器中灭菌20分钟，接种青枯伯克氏菌SD709，并于30℃、1000rpm换气振荡培养24小时。然后离心分离去掉细菌细胞，获得脂酶溶液。该溶液脂酶活性为20U/ml。
上述脂酶溶液用硫酸铵沉淀得到20％-30％的沉淀组分，沉淀用常规方法脱盐和冷结干燥得到粗脂酶粉剂。
实例3纯化脂酶将实例2中获得的脂酶粗粉剂溶解在10mM Tris/盐酸缓冲液(pH7)中，在含有10％饱和硫酸铵的10mM Tris/盐酸缓冲液(pH7)中进行透析，然后用Butyl-Toyopearl 650M(商标，Tosoh公司)疏水性色谱法得到活性组分。活性组分经过含有0.3mM次氯酸钙的10mM Tris/盐酸缓冲液(pH8)透析和DEAE-Cellulofine 800(商标，Seikagaku Corporation)吸附(离子交换层析树脂)，用同样的缓冲液平衡，最后用氯化钠溶液洗脱得到活性组分。活性组分经脱盐和冷结干燥得到纯化的酶。
该冻结干燥产物的纯度由聚丙烯酰胺凝胶电泳来确定。
实例4在乙二胺四乙酸存在时的高温活性在实例2中所获得的酯酶的粗粉剂的活性在30-100℃范围变化的温度下、以甘油三油酸乳液为底物、在含有或不含乙二胺四乙酸(EDTA)情况下测定。以上面描述的相同的酶活性分析方法完成不含EDTA的测定，除了反应温度在在30-100℃范围变化。除了加入EDTA外，以不含EDTA的相同的测定方法进行存在EDTA时的测定。相对活性(与80℃、无EDTA时的100活性比较)与反应温度的关系如图5所示。由图5可见，本发明脂酶活性温度范围为30-100℃，即使有EDTA(无钙离子)存在时其最适温度为80-90℃。这表明，该脂酶在高温下有足够的活性。
工业实用性本发明的脂酶有很高的耐热性，并且这种活性表现在可在高温下水解脂类，因此这种脂酶可以广泛地用于各个领域如医药，食品加工，化装品制备、洗涤剂，废水处理，脂肪和油的分解，树脂控制。
本发明的青枯伯克氏菌SD709(FERMP-14786)或其菌学上的等价菌株，或它们的变体在有效地产生这种脂酶的本发明的制备方法中是有用的。
权利要求
1.一种脂酶，在30℃至100℃的温度范围内以甘油三油酸酯乳液为底物测定时，其具有从30℃到100℃的活性温度，从85℃到100℃的最适温度。
2.一种脂酶，在30℃至100℃的温度范围内在5mM EDTA存在下以甘油三油酸酯乳液为底物测定时，其具有从30℃到100℃的活性温度，从85℃到90℃的最适温度。
3.一种权利要求1所要求的脂酶，其具有以下特性(1)活性pH值和最适pH值在pH值4-12范围内用甘油三油酸酯乳液作为底物测定时，活性pH值为4-12，最适pH值为6.5-9.5。(2)分子量用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定时分子量为32,000±2,000。
4.一种权利要求2所要求的脂酶，其具有以下特性(1)活性pH值和最适pH值在pH值4-12的范围内用甘油三油酸酯乳液作为底物测定时，活性pH值为4-12，最适pH值为6.5-9.5。(2)分子量用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定时分子量为32,000±2,000。
5.一种权利要求1-4之任一所要求的脂酶，其是从属于假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌培养物获得的。
6.一种权利要求5所要求的脂酶，其中所说的属于假单胞菌属的细菌是青枯伯克氏菌(Pseudomonas solanacearum)。
7.一种权利要求1-4之任一所要求的脂酶，其是从青枯伯克氏菌SD709(FERM-14786)的培养物获得的。
8.一种属于假单胞菌属的细菌，其产生权利要求第1-4之任一所要求的脂酶。
9.一种权利要求8所要求的细菌，其中所说的属于假单胞菌属的细菌是青枯伯克氏菌。
10.一种权利要求8所要求的细菌，其中所说的属于假单胞菌属的细菌是青枯伯克氏菌SD709(FERMP-14786)或者其菌学上的等价菌株，或者是它们的突变体。
11.一种产生脂酶的方法，该方法包括培养权利要求8-10之任一所要求的细菌，并从培养基中回收权利要求1-4之任一所要求的脂酶。
全文摘要
一种在高温下显示出高活性而不依赖于EDTA的存在的新脂酶。它具有在高温下水解脂质的足够活性,因此可广泛应用于医药、食品加工、化妆品制造、洗涤剂、污水处理、脂肪分解等工业领域。
文档编号C12N9/20GK1177979SQ96192388
公开日1998年4月1日 申请日期1996年2月27日 优先权日1996年2月27日 公开号96192388.发明者小隆司, 田中计实, 崎元和范 申请人:诺沃挪第克公司