悬浮培养细胞生产金线莲多糖的方法
【专利摘要】悬浮培养细胞生产金线莲多糖的方法，是一种利用细胞培养反应器培养金线莲细胞来生产金线莲多糖的方法。本方法首先对金线莲种子无菌播种萌发形成的原球茎，利用酶解法分离出高活力原球茎中未分化的单细胞，进一步培养成单细胞系，最后进行细胞群放大培养，在放大培养中，添加植物生长调节剂和生物酶制剂到培养基中，能激活细胞分裂生长，并防止细胞聚集结块生长，同时选择适合的光照强度和色温调控目的产物表达。本发明能够大幅度缩短细胞培养周期，提高金线莲多糖产品收率，且工艺简单、稳定，适合工业化生产。
【专利说明】悬浮培养细胞生产金线莲多糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及糖类生产技术，尤其涉及植物多糖的生产技术，具体为一种采用细胞培养法生产金线莲多糖的方法。
【背景技术】
[0002]金线莲多糖类化合物是金线莲的主要成分之一，金线莲对支气管炎、肾炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、风湿性关节炎、急慢性肝病、高血压、动脉硬化、脑血栓等均有辅助功效。金线莲多糖的药理作用主要表现在营养、抗衰老、调节人体机体免疫的作用。随着社会发展，人们对健康的关注越来越高，其需求量也会越来越大，但传统金线莲多糖的提取方法是用金线莲属植物的根、茎、叶等植物体提取所得，这种工艺所得的产品已经不能满足未来市场对金线莲精深加工的需求。
[0003]随着植物细胞工程技术的发展，用细胞进行人工培养扩增提取植物的代谢产物，可以不受土地面积、气候环境、地域、病虫害等限制影响，适于工业化生产。利用细胞工程技术生产金线莲多糖的技术，在国内外早有研究，也取得了诸多成果，但在生产过程中存在很多难题问题，如生物量增速低、目标产物收率低、生产周期长等。关于利用气升搅拌罐悬浮培养金线莲细胞生产金线莲多糖的研究还没有报道，因此开发一种高效生产金线莲多糖类天然产物的方法是十分有意义的。
【发明内容】
[0004]本发明所解决的技术问题在于提供一种利用气升搅拌罐悬浮培养细胞生产金线莲多糖的方法，以解决上述【背景技术】中的研究空白。
[0005]悬浮培养细胞生产金线莲多糖的方法，是一种利用细胞培养反应器培养金线莲单细胞系群来生产金线莲多糖的方法，培养基中添加植物生长调节剂和生物酶制剂来激活细胞生长并缩短细胞培养周期，同时选择适合的光照强度和色温调控目的产物表达。具体工艺步骤见如下阐述:
(O单细胞制备
取金线莲蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为改良的1/2MS固体培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用50-80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；
(2)单细胞系培养
将收集到的单细胞接种到含有改良的1/2MS液体培养基的挡板摇瓶中，鲜细胞接种量为25±2g/L，光强度为1000-30001ux，色温为4000-6000K，震荡培养，调pH值为5.6±2，温度22±2°C，当细胞密度达到10000-20000个/mL，即可放大培养；
(3)细胞群放大培养将培养好的单细胞系接种于含有改良的1/2MS液体培养基的气升式搅拌发酵耀中，培养基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)0.l-2mg/L,6_BA(6-Benzylaminopurine, 6_节氛基嘿呤)0.l_2mg/L,中性果胶酶50-100mg/L,中性纤维素酶10-50mg/L，鲜细胞接种量为30±2g/L，光强度为1000-30001ux，色温为4000-6000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%，调节补料液和NaOH溶液流加量保持PH在5.6±4;
(4)当细胞密度达到60000-80000个/ml即可停止培养，时间为15-18天，采用低速离心或过滤法收集金线莲细胞，再常规方法提取金线莲多糖。
[0006]本发明工艺技术优点:
本发明中，首先对金线莲种子无菌播种萌发形成的原球茎，利用酶解法分离出高活力原球茎中的单细胞，进一步培养成单细胞系，最后进行细胞群放大培养，在放大培养中，添加植物生长调节剂和生物酶制剂到培养基中，能激活细胞分裂生长，并防止细胞聚集结块，保证营养和溶氧供应均匀、充分，同时选择适合的光照强度和色温调控目的产物表达。本发明能够大幅度缩短细胞培养周期，提高产品收率，且工艺简单、稳定，适合工业化生产。
【具体实施方式】
[0007]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。实施例所描述的具体的工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制本发明的权利要求，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
[0008]具体实施例1
1、培养阶段
(1)单细胞制备
取金线莲蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为改良的1/2MS固体培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；
(2)单细胞系培养
将收集到的单细胞接种到含有改良的1/2MS液体培养基的挡板摇瓶中，鲜细胞接种量为25土2g/L，光强度为30001ux，色温为5000K，震荡培养，调pH值为5.6±2，温度22±2°C，当细胞密度达到10000个/mL，即可放大培养；
(3)细胞群放大培养
将培养好的单细胞系接种于含有改良的1/2MS液体培养基的气升式搅拌发酵耀中，培养基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)0.5mg/L,6_BA(6-Benzylaminopurine, 6-节氨基嘌呤)0.5mg/L,中性果胶酶50mg/L,中性纤维素酶10mg/L,鲜细胞接种量为30±2g/L，光强度为30001ux，色温为5000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%，调节补料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6 + 4 ；
(4)当细胞密度达到60000个/ml即停止培养,时间15天,采用100rpm低速离心收集金线莲细胞，将收集到的金线莲细胞杀青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常温封闭保存备用;
2、提取阶段
1)醇沉
称取过20目筛的干燥的金线莲粉末50g加入4倍质量的75% (V/V)乙醇水溶液冷浸搅拌提取48小时，再利用45微米微孔滤膜对所得金线莲浸提液进行抽滤，对滤液进行8000rpm高速离心30分钟，获得上清液和沉淀；
2)去杂
将所述沉淀中加入3倍量蒸馏水溶解，于100°C煮沸10分钟，冷却后SOOOrpm高速离心30分钟，获得上清液和沉淀；进一步对上清液进行旋转蒸发浓缩，再干燥至恒重，获得可溶性金线莲多糖粉。称量得到的金线莲多糖的重量为4.22g，收率为8.45%。
[0009] 具体实施例2
1、培养阶段
(O单细胞制备
取金线莲蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为改良的1/2MS固体培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用60微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；
(2)单细胞系培养
将收集到的单细胞接种到含有改良的1/2MS液体培养基的挡板摇瓶中，鲜细胞接种量为25土2g/L，光强度为20001ux，色温为6000K，震荡培养，调pH值为5.6±2，温度22±2°C，当细胞密度达到20000个/mL，即可放大培养；
(3)细胞群放大培养
将培养好的单细胞系接种于含有改良的1/2MS液体培养基的气升式搅拌发酵耀中，培养基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)L0mg/L,6-BA(6-Benzylaminopurine,6_节氨基嘌呤)1.0mg/L,中性果胶酶80mg/L,中性纤维素酶20mg/L,鲜细胞接种量为30±2g/L，光强度为40001ux，色温为6000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%，调节补料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6 + 4 ；
(4)当细胞密度达到80000个/ml即停止培养，时间18天，采用过滤收集金线莲细胞，将收集到的金线莲细胞杀青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常温封闭保存备用；
2、提取阶段
1)醇沉
称取过20目筛的干燥的金线莲粉末50g加入4倍质量的75% (V/V)乙醇水溶液冷浸搅拌提取48小时，再利用45微米微孔滤膜对所得金线莲浸提液进行抽滤，对滤液进行8000rpm高速离心30分钟，获得上清液和沉淀；
2)去杂
将所述沉淀中加入3倍量蒸馏水溶解，于100°C煮沸10分钟，冷却后SOOOrpm高速离心30分钟，获得上清液和沉淀；进一步对上清液进行旋转蒸发浓缩，再干燥至恒重，获得可溶性金线莲多糖粉。称量得到的金线莲多糖的重量为5.06g，收率为10.12%。
[0010]对比例I
选取播种生长8个月的金线莲组培苗，将组培苗洗净浙干后杀青，再70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常温封闭保存备用；
1、醇沉
称取过20目筛的干燥的金线莲粉末50g加入4倍质量的75% (V/V)乙醇水溶液冷浸搅拌提取48小时，再利用45微米微孔滤膜对所得金线莲浸提液进行抽滤，对滤液进行8000rpm高速离心30分钟，获得上清液和沉淀；
2、去杂
将所述沉淀中加入3倍量蒸馏水溶解，于100°C煮沸10分钟，冷却后SOOOrpm高速离心30分钟，获得上清液和沉淀；进一步对上清液进行旋转蒸发浓缩，再干燥至恒重，获得可溶性金线莲多糖粉。称量得到的金线莲多糖的重量为4.83g，收率为9.66%。
[0011]实验例I总多糖含量的检测
1、制作标准曲线:准确称取105°C烘干至恒重的葡萄糖50mg于500ml容量瓶中配成0.1 mg/ml 的标准溶液,用蒸懼水分别配成 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/ml。I ml 标准液分别加入5%苯酚溶液I ml，并迅速加入浓硫酸5 ml，静置10 min。摇匀，30°C放置30 min后于490nm测定OD值，以葡萄糖含量为横坐标，OD值为纵坐标，制作得到标准曲线。得回归方程为 A=0.0383C + 0.0464，r=0.9993，线性范围 4.07 ?22.5 μ g / mL ；
2、样品的测定:精密称取本实验制得的金线莲多糖样品50mg，适当稀释后，按上述方法操作后进行测定。并代入标准曲线计算样品的总多糖含量。
[0012]结论:
通过上述的培养和提取，可以很清楚的判定本发明所述的细胞培养法在细胞培养15-18天后生产的金线莲多糖在收率上可以接近甚至超过同期播种生长8个月的组培苗生产的金线莲多糖。
【权利要求】
1.悬浮培养细胞生产金线莲多糖的方法，其特征在于，是一种利用细胞培养反应器对金线莲细胞培养，添加植物生长调节剂和生物酶制剂激活细胞生长并缩短细胞培养周期，来生产金线莲多糖的方法，具体步骤为: (1)单细胞制备 取金线莲蒴果消毒后进行无菌播种，播种培养基为改良的1/2MS固体培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞,并离心过滤除杂,收集单细胞； (2)单细胞系培养 将收集到的单细胞接种到含有改良的1/2MS液体培养基的挡板摇瓶中，鲜细胞接种量为25±2g/L，光强度为1000-30001ux，色温为4000-6000K，震荡培养，调pH值为5.6±2，温度22±2°C，当细胞密度达到10000-20000个/mL，即可放大培养； (3)细胞群放大培养 将培养好的单细胞系接种于含有改良的1/2MS液体培养基的气升式搅拌发酵罐中，培养基中加入:NAA 0.l-2mg/L,6-BA 0.l_2mg/L，果胶酶 50_100mg/L，纤维素酶 10_50mg/L，鲜细胞接种量为30±2g/L，光强度为1000-30001ux，色温为4000-6000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%，调节补料液和NaOH溶液流加量保持pH在.5.6 + 4 ； (4)当细胞密度达到60000-80000个/ml即可停止培养，时间为15-18天，采用低速离心或过滤法收集金线莲细胞，再用常规方法提取金线莲多糖。
【文档编号】C12P19/04GK104404100SQ201410536999
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年10月13日 优先权日:2014年10月13日
【发明者】邓辉, 陈乃富, 刘文中, 陈存武, 韩邦兴 申请人:皖西学院