一种用于同时检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的双重荧光pcr的检测试剂盒及引 ...的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于同时检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的双重荧光PCR的检测试剂盒及引物和探针。所述检测用引物和探针为序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：3为检测嗜吞噬细胞无形体的荧光探针，序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5分别为检测查菲埃里克体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：6为检测查菲埃里克体的荧光探针。本发明还提供了嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的检测试剂盒。本发明所选引物和探针特异性非常强，且一次能检测两种病毒，提高效率。
【专利说明】-种用于同时检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的双 重荧光PCR的检测试剂盒及引物和探针
【技术领域】
[0001] 本发明涉及嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体检测用引物、探针及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体均是细胞内寄生菌。嗜吞噬细胞无形体侵染人 末梢血中性粒细胞引起人粒细胞无形体病（Human granulocytic anaplasmosis，HGA)，以 发热伴白细胞、血小板减少和多脏器功能损害为主要临床表现。查菲埃里克体侵染人单核 巨噬细胞，引起人单核细胞埃立克体病（(human monocytic ehrlichiosis,HME)，与人粒细 胞无形体病临床症状十分相似，以发热、淋巴结肿大和出现异型淋巴细胞为主要临床表现。 HGA和HME都是自然疫源性人畜共患病，呈世界性分布，主要经蜱叮咬传播。
[0003] 立克次体病临床表现一般缺乏特异性，如表现为不明原因的高热、头痛、全身酸 痛、食欲不振等，常常误诊为其它传染病，确诊主要依靠实验室检查，包括血清学检测和病 原的分离与鉴定。特异性抗体的检出一般在发病2周以后，所以血清学检测不能用于立克 次体感染的早期诊断。由于大多数立克次体不能在人工培养基上生长，需要靠动物接种、细 胞培养等对立克次体病原进行分离。立克次体病原分离操作复杂，费时费力且成功率很低。 因此立克次体的传统检测方法已逐渐被酶联免疫吸附技术、PCR技术、芯片技术等现代检测 方法所代替。如今，研究的趋势更是进一步转向了在一个检测平台上同时检测多种致病菌， 以此缩短检测周期、减少检测成本。因此，能同时快速有效检测多种病原微生物的高通量检 测技术已成为临床疾病检测，国境口岸卫生检疫，公共安全等领域研究的热点。
[0004] 本研究着重研究影响检测鼠源性立克次体病多重荧光PCR技术方法的关键因素， 提出解决方案，促使形成技术升级的同时，形成产业化。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一组特异性强、灵敏度高的同时检测嗜吞噬细胞无形体和查 菲埃里克体的核苷酸序列，包括引物和探针。
[0006] 本发明的另一目的是提供快速、准确、使用方便的检测嗜吞噬细胞无形体和查菲 埃里克体的检测试剂盒。
[0007] 为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 本发明提供了检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的引物和探针，具体如下：
[0009] 通过序列比较，根据嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum，AP)主要外 膜蛋白（msp2)基因的序列（GenBank :KC954740)，在其保守区169-245位置设计一对引物 及一条探针：
[0010] 1)AP 正义引物（AP-F)5, ATGGAAGGTAGTGTTGGTTATGGTATT 3'（SEQ ID NO :1);
[0011] 2)AP 反义引物（AP-R)5, TTGGTCTTGAAGCGCTCGTA 3'（SEQ ID NO :2);
[0012] 3)AP 探针（AP-probe)5,（J0E)TGGTGCCAGGGTTGAGCTTGAGATTG(TAMRA)3,（SEQ ID NO :3)，该探针的5'端标记报告荧光基团JOE，3'端标记淬灭荧光基团TAMRA ;
[0013] 扩增目的片段为77bp。
[0014] 通过序列比较，根据查菲埃里克体（Ehrlichia chaffeensis，EC) 16SrRNA基因的 序列（GenBank :KJ942243)，在其保守区17-97位置设计一对引物及一条探针：
[0015] 4)EC 正义引物（EC-F)5, GCGGCAAGCCTAACACATG 3'（SEQ ID NO :4);
[0016] 5)EC 反义引物（EC-R)5, CCCGTCTGCCACTAACAATTATT 3'（SEQ ID NO :5);
[0017] 6) EC 探针（EC-probe)
[0018] 5 '（FAM) AGTCGAACGGACAATTGCTTATAACCTTTTGGT (TAMRA) 3 '（SEQ ID NO :6)，该探针 的5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团TAMRA ;
[0019] 扩增目的基因大小为80bp。
[0020] 本发明还提供了一种嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的检测试剂盒，由以下组 分组成：
[0021] DDNA提取试剂；通常可以使用商业购买的DNA提取试剂盒或按照常规方法来提 取DNA，所述商业化的DNA提取试剂盒例如TIANamp Genomic DNA Kit, cat. no DP304 ;
[0022] 2)DNA标准品：为嗜吞噬细胞无形体主要外I旲蛋白（msp2)基因的DNA片段，如序 列表SEQ ID No :9 ;和查菲埃里克体16SrRNA基因的DNA片段，如序列表SEQ ID No : 12 ;
[0023] 3)实时定量PCR反应液，其包括：PCR反应混合液，荧光定量PCR参比染料，检测嗜 吞噬细胞无形体的正义引物、反义引物和荧光探针，检测查菲埃里克体的正义引物、反义引 物和荧光探针，
[0024] 优选为：2XPCR反应混合液，IX荧光定量PCR参比染料，检测嗜吞噬细胞无形体 的正义引物〇.2μΜ、反义引物0.2μΜ和荧光探针0. 4 μ M，检测查菲埃里克体的正义引物 0. 2 μ Μ、反义引物0. 2 μ M和荧光探针0. 4 μ M ;
[0025] 进一步地，所述PCR反应混合液（Premix Ex Taq?),购自大连宝生物公司 (Takra)，货号RR390A。所述引物和探针均委托大连宝生物公司合成。
[0026] 4)阴性对照：DEPC水；
[0027] 5)DEPC水；ImL x2管，自来水两次蒸馏，经过Millipore纯水仪纯化，电阻率大于 18. OMΩ. CM。
[0028] 其中，检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物为序列表SEQ ID No :1所示的核苷酸序 列，反义引物为序列表SEQ ID No :2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No :3所 示的核苷酸序列，其5'端标记报告荧光基团J0E，3'端标记淬灭荧光基团TAMRA ;检测查菲 埃里克体的正义引物为序列表SEQ ID No :4所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No :5所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No :6所示的核苷酸序列，其5'端标记 报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团TAMRA。
[0029] 本发明还提供了一种嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的检测试剂盒的使用方 法：
[0030] 1.样品采集、运送
[0031] 解剖鼠取其脾脏置于冻存管中，或将检获蝶虫置于冻存管中，将冻存管置于干冰 或液氮中运送回实验室。-70°c冻存备用。
[0032] 2. DNA 提取
[0033] 按照TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒提供的方法提取立克次体DNA，具体方法如 下：
[0034] ⑴动物组织（脾组织用量应少IOmg)应先打碎处理为细胞悬液，然后10, OOOrpm 离心lmin，倒尽上清，加200 μ L缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
[0035] (2)加入20 μ L Proteinase K溶液，混匀，在56°C放置，直至组织溶解，简短离心 以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。
[0036] (3)加入200 μ L缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置lOmin，溶液应变清亮，简短离 心以去除管盖内壁的水珠。
[0037] (4)加人200 μ L无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短 离心以去除管盖内壁的水珠。
[0038] (5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12, OOOrpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[0039] (6)向吸附柱CB3中加入500 μ L缓冲液⑶（使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12, OOOrpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0040] (7)向吸附柱CB3中加入600 μ L漂洗液PW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇 12, OOOrpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0041] (8)重复操作步骤7。
[0042] (9)将吸附柱CB3放回收集管中，12, OOOrpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0043] (10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50-200 μ 1洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12, OOOrpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
[0044] 3.实时定量PCR反应：
[0045] 96孔PCR板，第一排12孔作为标准曲线和阴性对照孔，其余为样品检测孔。
[0046] 反应体系为20 μ L，见表1 :
[0047] 表 1
[0048]
【权利要求】
1. 用于同时检测嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的引物和探针，其特征在于，所述 引物和探针如序列表SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:6所示，其中序列SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2分别为检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO :3为检测嗜吞 噬细胞无形体的荧光探针，序列SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5分别为检测查菲埃里克体的 正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO :6为检测查菲埃里克体的荧光探针。
2. 根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针SEQ ID NO :3的5'端标 记报告荧光基团J〇E，3'端标记淬灭荧光基团TAMRA。
3. 根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针SEQ ID NO :6的5'端标 记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团TAMRA。
4. 一种嗜吞噬细胞无形体和查菲埃里克体的检测试剂盒，其特征在于，由以下组分组 成： 1. DNA提取试剂； 2. DNA标准品：为嗜吞噬细胞无形体的DNA片段，如序列表SEQ ID No :9 ;和查菲埃里 克体的DNA片段，如序列表SEQ ID No :12 ; 3) 实时定量PCR反应液，其包括：PCR反应混合液，荧光定量PCR参比染料，检测嗜吞噬 细胞无形体的正义引物、反义引物和荧光探针，检测查菲埃里克体的正义引物、反义引物和 荧光探针； 4) 阴性对照； 5. DEPC 水； 其中，检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物为序列表SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，反 义引物为序列表SEQ ID No :2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No :3所示的 核苷酸序列，其5'端标记报告荧光基团J0E，3'端标记淬灭荧光基团TAMRA ;检测查菲埃里 克体的正义引物为序列表SEQ ID No :4所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No: 5所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No :6所示的核苷酸序列，其5'端标记报 告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团TAMRA。
5. 根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂为DNA提取试剂 盒。
6. 根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述实时定量PCR反应液包括： 2 XPCR反应混合液，检测嗜吞噬细胞无形体的正义引物0. 2 μ M、反义引物0. 2 μ Μ和荧光 探针0. 4 μ Μ，检测查菲埃里克体的正义引物0. 2 μ Μ、反义引物0. 2 μ Μ和荧光探针0. 4 μ Μ ; IX荧光定量PCR参比染料。
7. 根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应混合液为Premix Ex Taq?混合液，所述荧光定量PCR参比染料为ROX Reference Dye。
【文档编号】C12N15/11GK104293960SQ201410550362
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】郭惠琳, 田洁, 刘艳华, 田茵, 赵静 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局