一种判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法
【专利摘要】本发明公开了一种判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，取蓝藻水华区域的水样和室内培养微囊藻，进行RNA提取纯化，然后反转录得到cDNA，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增。以引物 gvpC 扩增微囊藻伪空胞基因，以引物 Micr 特异性扩增微囊藻 16srRNA 内参基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，两者差值为校正后的细胞拷贝数，野外样品与室内样品的细胞拷贝数差值为野外目的基因相对循环数，记作ΔΔCt，采用2-ΔΔCt计算相对表达量，以时间为横坐标，2-ΔΔCt的值为纵坐标绘制曲线，根据曲线确定越冬蓝藻越冬复苏期界限。本方法可以同时对多个样品进行分析，其重复性好且准确，检测时间短。
【专利说明】一种判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，属于水环境治理技术领 域。
【背景技术】
[0002] 近几十年来，我国湖泊富营养化的发展趋势很快，大型浅水湖泊（如太湖）随着富 营养化加重，常常发生以铜绿微囊藻?is aerwgiflosa )为优势种群的水华。水华 多发生在夏季，有明显季节性特点。有研究者根据生态学的基本理论和野外对水华形成过 程的原位检测，将蓝藻水华的形成分为相互区别而又连续的4个过程：下沉和越冬、复苏、 生物量增加、上浮聚集形成水华。这一假设为治理蓝藻水华提供了一条"分阶段"治理的新 思路。蓝藻越冬休眠或者春季复苏是这些藻类生命过程中最薄弱的环节，越冬复苏策略不 仅会影响水体中蓝藻的种群变动，而且可能有助于其越过环境恶劣的冬季，为随后的浮游 生长提供潜在的"种源"。要有效控制夏季蓝藻水华，就要在藻类大量繁殖形成水华之前，采 取更加有针对性的措施抑制蓝藻的生长，在藻类大量复苏生长前对其进行消减，就有可能 达到事半功倍的效果。在越冬期对蓝藻开展底泥翻耕类工程可以在蓝藻进入水体前阻断蓝 藻复苏期的开始，而在蓝藻复苏期开展生物抑制(如水稻、大麦秸杆）措施将极大降低蓝藻 的复苏率。因此建立一种判别越冬蓝藻的越冬复苏期的检测方法将有助于区分蓝藻越冬期 和复苏期的界限，为有针对性的开展蓝藻的种源清除提供依据。
[0003] 越冬期蓝藻休眠体成为水华种源必须同时满足两个条件：保持活性和上浮。越 冬期底泥中具有活性的蓝藻数量决定来年蓝藻的复苏量，是水华暴发的直接因素之一。而 在水华暴发这一过程中，蓝藻能调节自身浮力进行垂直迁移的特性也起到了关键的作用， 这种特性使蓝藻群体的空间位置发生改变，使越冬期底泥中具有活性的蓝藻上浮到水体表 层，并受风力作用在湖岸局部地区大量聚集。蓝藻之所以能够形成水华与它胞内伪空胞所 产生的漂浮能力是密不可分的。蓝藻的伪空胞是由含有12个基因的8. 7Kb的基因簇组成 的，但是长期以来伪空胞编码基因和结构蛋白的研究主要集中在和GvpA、GvpC 上。几乎在所有产伪空胞的蓝藻中出现，在大多数具有伪空胞的藻细胞检测到基 因具有多拷贝，不同的藻细胞中，拷贝数有所不同，但基因拷贝数的多少影响伪空胞 的哪个表型特征并不清楚。而基因决定着伪空胞的直径，失去GvpC蛋白结构的伪空 胞更容易坍塌。
[0004] 随着分子生物学技术的发展，从环境样品中提取和处理核酸的技术逐渐被应用到 微生物形态学中。可是在一般情况下，通常是从环境样品中提取DNA，并以DNA为模板通过 PCR技术来扩增目的基因序列。由于DNA存在于垂死和已经死亡的生物中，而且DNA还可能 存在于细胞外，所以这些生物的生态意义就很难判断。因此，通过提取环境中RNA，运用实时 荧光定量PCR技术，在转录水平上研究野外蓝藻伪空胞基因的表达，从而确定有活 性蓝藻的上浮能力，就能清楚的将蓝藻复苏期和越冬期划清界限，为种源的清除提供依据。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种判别越冬蓝藻越冬复苏期界限 的方法，该方法采用在转录水平上的实时荧光定量PCR技术，能够快速准确的定量检测出 蓝藻伪空胞基因的表达，通过结果分析出蓝藻伪空胞基因是在哪个时间段 开始表达并在哪个时间段表达下降，从而将蓝藻复苏期和越冬期划清界限，为种源的清除 提供依据。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 一种判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，包括如下步骤： 1) 取发生蓝藻水华区域的水样，进行总RNA提取纯化，得到RNA样本a ; 2) 室内培养微囊藻，在对数生长期离心收集藻细胞，进行总RNA提取纯化，得到RNA样 本b ; 3) 分别以RNA样本a和RNA样本b进行反转录得到cDNA-a和cDNA-b ; 4) 以步骤3)得到的cDNA-a作为荧光定量PCR的模板，以引物扩增微囊藻伪空胞 基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为;以引物#icr特异性扩增微 囊藻财内参基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct 16s ;两者差 值Ct野外目的翻_Ct野外同一样本16s为校正后的细胞拷贝数，记作Δ Ct野外目的基因； 5) 以步骤3)得到的cDNA-b作为荧光定量PCR的模板，以引物扩增微囊藻伪空胞 基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Cts__H ;以引物#icr特异性扩增微 囊藻财内参基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Cts_n 16s ;两者差 值Ct室内目腿因_ Ct室内同一样本16s为校正后的细胞拷贝数，记作ACt室内目腿因； 6) 与ACt室肖_基_差值为里了外目的基因相对循环数，记作Δ ACt，米用 计算相对表达量； 7) 取不同时间的水样重复上述步骤1)?6)，以时间为横坐标，步骤6) 2^ 的值为 纵坐标绘制曲线，根据曲线确定越冬蓝藻越冬复苏期界限。
[0007] 步骤2)中微囊藻为微囊藻aerwgifliosa 7汾形。
[0008] 步骤2)中室内培养微囊藻的培养基为BG-11，培养温度为28?35 °C，光照强度 为 20 ?60 μ E · (m2 · s) S光照周期为 9 h:15 h ?12 h:12 h。
[0009] 引物 序列为5' -TGCTTTGCGTCAGTCTTTCC-3'， gvpC-R^ -TCCTTCACCTGTTTGGCTCT-3, 〇
[0010] 引物 #icr 引物序列为:#icr7财F 5、GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3\ Micr431R^ -AATCCAAARACCTTCCTCCC-3, 〇
[0011] 荧光定量PCR的反应程序为：95°C 3 min，紧接着40个循环，每个循环包括95°C 15s、55°C 30s 和 72°C 45s。
[0012] 阈值循环数值！Threshold cycle value,简写Ct值，定义为突光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数，目的基因的拷贝数与Ct值呈负相关。荧光阈值的设定：一般将PCR 反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值是PCR 3-15个循环荧光信号标 准差的10倍，荧光阈值设定在PCR扩增的指数期。以16srRNA为阳性内对照基因来校正 PCR模板的细胞拷贝数Ct 从而消除组间加样量的影响。
[0013] 为了保证目的基因（仍€)和内参基因（16S)的扩增效率一致，将室内样品的cDNA 模板稀释成一系列梯度，利用内参基因16S和目的基因引物扩增，通过cDNA浓度梯 度的log值对ACt值（Z 0=^_細7-0_颜）作图，所得直线为y=-0. 0931X+10. 109,所 得直线斜率绝对值接近于〇，说明扩增效率相同。
[0014] 具体步骤如下： 1.利用室内培养的微囊藻始'^/-〇<^75^'5· aerwgifliosa 7汾形为对照，培养基为BG-11， 培养温度为28?35 °C，光照强度为20?60 μ E · (m2 · s)-1，光照周期为9 h: 15 h?12 h: 12 h，离心收集处于对数生长期的藻细胞，进行总RNA提取纯化，得到RNA样本b。
[0015] 2.取发生蓝藻水华的湖泊水样，经GF/C膜过滤后，将滤物进行总RNA提取纯化，得 到RNA样本a。
[0016] 3.反转录：米用 QIAGEN 公司的 QuantiTect Reverse Transcription Kit 试剂 盒。根据RNA浓度计算IygRNA所需的体积。按照试剂盒进行反转录：加入2μ L gDNA Wipeout Buffer，1 μ gRNA，和 RNase-free H2O，总体积 14 μ L，混勻后至于 PCR 仪中 42°C温 浴 2min〇 然后向其中力口入 IuL Reverse-transcription master mix,4 μ L Quantiscript RT Buffer及IyL RT Primer Mix,混合后至于PCR仪中42°C温浴15min，然后95°C灭活 3min。反转录后的cDNA-a和cDNA-b稀释10倍作为荧光定量PCR模板。
[0017] 4.实时荧光定量PCR的反应体系为：采用SYBR Green I嵌合荧光法进行 实时荧光定量PCR，其 PCR混合液包括 12.5 yL 2XQuantiFast SYBR Green PCR Master Mix，2 μ M 引物，1 μ L 模板，无 RNA 酶的水 10. 5 μ L。引物仍^ -丁0(：1'176〇61^六61'(：1'17〇：-3'）与^^^-7?(5,-了〇：1'1^六〇^61'1766(：1'(：1'-3'）特异性扩 增微囊藻伪空胞基因，引物 #icr7财F (5 'GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3 J 与 (5^ -AATCCAAARACCTTCCTCCC-3J特异性扩增微囊藻财内参基因。
[0018] 5.实时荧光定量PCR的反应程序为：95°C 3 min，紧接着40个循环，每个循环包 括 95°C 15s、55°C 30s 和 72°C 45s。
[0019] 6.分别取步骤3中得到的cDNA-a和cDNA-b作为模板，按步骤4和步骤5实时荧 光定量PCR的反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。PCR完成后，导出相 应的阈值循环数值（Threshold cycle value，简写Ct值，定义为荧光信号到达设定的阈值 时所经历的循环数，目的基因的拷贝数与Ct值呈负相关。荧光阈值的设定：一般将PCR反 应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值是PCR 3-15个循环荧光信号标准 差的10倍，荧光阈值设定在PCR扩增的指数期)。基因的相对表达量用表示，Λ ACt @的基因= ACt野外目的基因 -ACt室内目的基因）。以时间为横坐标，2 Gt的值为纵坐标绘制曲线，根 据曲线确定越冬蓝藻越冬复苏期界限。
[0020] 有益效果：传统的测定藻类现存量的方法以及基于DNA的实时荧光定量PCR方法 难以区分死活细胞，不能真正反映具有活性的越冬藻类的状态。而且绝对定量的实时荧光 定量PCR方法，需要通过标准曲线计算起始模板的拷贝数。而采用本发明的方法，通过对室 内微囊藻以及野外样品RNA的提取，运用相对定量实时荧光定量PCR方法，比较野外不同时 间段内样品和室内微囊藻基因之间的表达差异，检测出水体蓝藻在时间上和空间上的动态 变化。这种方法可以同时对多个样品进行分析，而且不受环境样品悬浮颗粒物和藻类群体 状态等影响，体现出其重复性好且准确。对样品的定量检测能在短时间内完成（3个小时左 右，多个样品可同时进行)，其它研究伪空胞形态和特性的压力毛细管法等需要将伪空胞从 细胞中分离纯化，耗时费力。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1是太湖流域取样位点分布图； 图2是2012年11月至2013年7月太湖梅梁湾水体蓝藻基因相对表达量； 图3是2012年11月至2013年7月太湖湖心水体蓝藻基因相对表达量。
【具体实施方式】
[0022] 以下结合实施例对本发明的技术方案进一步描述。
[0023] 以下实施例中所采用的的微囊藻为微囊藻#/<^〇<^75^5· aerwgifliosa ，该藻 种由中科院典型培养物种保藏委员会淡水藻种库（FACHB)提供。
[0024] 实施例1 1.样品采集和RNA提取 2012年11月至2013年7月每月采集太湖梅梁湾（N2)水样，在采样点立即用GF/C滤 膜过滤IOOml水样，迅速放入液氮中保存，带回实验室放在-70°C中保存直到RNA提取。取 40mL室内培养的处于对数生长期的微囊藻(室内培养微囊藻的培养基为BG-11，培养温度 为30 °C，光照强度为30 μΕ^Οι^^Γ1，光照周期为12 h:12 h)，，进行离心收集藻细胞，然 后提取RNA。野外样本和室内样本的RNA的提取均采用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit试剂盒。野外样品和室内样本分别转移到相对应编号的裂解管B (Lysing MatrixB， 直径0. I mm)中，然后每个裂解管B中加入500 μ L Buffer RLT，将裂解管B放置于Fast Pr印-24样品处理仪器中。设置Fast Pr印-24样品处理仪器参数，速度6 m/s，时间35 s。 击打破碎之后，立即取出裂解管B并放入冰上。然后将裂解管B在4 °C，12000 rpm条件下 离心10 s，紧接着将上清液转移至无 RNase 2 mL离心管中。按试剂盒说明提取RNAdfi 清液转移至于淡紫色的QIA shredder spin柱中，12000rmp离心2分钟，取上清转移至新 的无 RNase的2mL离心管内，加入0. 5倍体积的无水乙醇，迅速吹打混勻。然后转移至2mL 粉色1?他387 8口;[11柱中，120001'115)离心158，将滤出物丢弃。加入700以1^1?￥1，120001'115)离 心15s清洗柱子上的滤膜，丢弃滤出物。再用RPE清洗两次柱子。再用30 μ L无 RNA酶的 dd H2O洗脱RNA。测定RNA浓度和纯度，记作RNA样本a和RNA样本b。
[0025] 2.分别对RNA样本a和RNA样本b进行反转录：采用QIAGEN公司的QuantiTect Reverse Transcription Kit试剂盒。根据RNA浓度计算IygRNA所需的体积。按照试 剂盒进行反转录：加入 2 μ L gDNA Wipeout Buffer，1 μ gRNA，和 RNase-free H2O，总体积 14 μ L，混勻后至于PCR仪中42°C温浴2min。然后向其中加入1 μ L Reverse-transcription master mix，4 μ L Quantiscript RT Buffer 及 1μ L RT Primer Mix，混合后至于 PCR 仪 中42°C温浴15min，然后95°C灭活3min。反转录得到cDNA-a和cDNA-b稀释10倍作为荧 光定量PCR模板。
[0026] 3.实时荧光定量PCR的反应体系为：采用SYBR Green I嵌合荧光法进行 实时荧光定量PCR，其 PCR混合液包括 12.5 yL 2XQuantiFast SYBR Green PCR Master Mix，2 μ M 引物，1 μ L 模板，无 RNA 酶的水 10. 5 μ L。引物仍^ -TGCTTTGCGTCAGTCTTTCC-31 )与 -TCCTTCACCTGTTTGGCTCT-31 )特异性扩增微 囊藻伪空胞基因，引物 #icr7财F (5 ^ -GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3 J 与 #icr^?77? (5 ^ -AATCCAAARACCTTCCTCCC-3 J特异性扩增微囊藻16srRNA内参基因。
[0027] 4.实时荧光定量PCR的反应程序为：95°C 3 min，紧接着40个循环，每个循环包 括 95°C 15s、55°C 30s 和 72°C 45s。
[0028] 5.分别以步骤2得到的9个水样的反转录得到的cDNA-a和cDNA-b样本为模板， 按上述实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。以 引物扩增微囊藻伪空胞基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct a^hgws 因、Ct室内目的基因，以引物#化，特异性扩增微囊藻财内参基因，PCR完成后，导出相应的 阈值循环数值，记为Cts外肖-样本16s、Ct室肖样本16s ;两者差值（Cts外目_g_Ct|j外肖-样本16s)、 (Ct室内目的基因-Ct室内同一样本16s)为校正后的细胞拷贝数，记作Δ Ct野外目的基因、Δ Ct室内目的基因；以 16srRNA为阳性内对照基因来校正PCR模板的细胞拷贝数从而消除组间加样量差异。ACt 野外目的基因与Mt室細猫因差值为野外目的基因相对循环数，记作AACt，采用计算相 对表达量。以时间为横坐标，以的值为纵坐标绘制曲线见图2,由图2可以看出太湖 梅梁湾水体蓝藻基因相对表达量在2012年11月到2013年2月处于较低水平阶段， 到2013年3月^基因相对表达量急剧升高并持续到5月，但到6月份时又急剧下降，说 明2013年3月到2013年5月是蓝藻的复苏期，而3月份是蓝藻越冬期与复苏期的分界线。 所以在2013年3月份即蓝藻复苏之前对太湖梅梁湾蓝藻开展底泥翻耕类工程，之后在2013 年7月到2013年9月连续三个月时间采集太湖梅梁湾水样检测蓝藻生物量(通常根据蓝藻 体内参与光合作用的藻蓝蛋白浓度表征蓝藻生物量)。与2012年7月到2012年9月同一 时间段但未采取措施处理之前相比，蓝藻藻蓝蛋白浓度大大下降，结果间表1。
[0029] 表1 :处理前与处理后太湖梅梁湾水体藻蓝蛋白浓度对比 实施例2
【权利要求】
1. 一种判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，其特征在于包括如下步骤： 1) 取发生蓝藻水华区域的水样，进行总RNA提取纯化，得到RNA样本a ; 2) 室内培养微囊藻，在对数生长期离心收集藻细胞，进行总RNA提取纯化，得到RNA样 本b ; 3) 分别以RNA样本a和RNA样本b进行反转录得到cDNA-a和cDNA-b ; 4) 以步骤3)得到的cDNA-a作为荧光定量PCR的模板，以引物^扩增微囊藻伪空胞 基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为;以引物#icr特异性扩增微 囊藻MsrTS财内参基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct 16s ;两者差 值Ct野外目的翻-Ct野外同一样本16s为校正后的细胞拷贝数，记作ACt野外目的基因； 5) 以步骤3)得到的cDNA-b作为荧光定量PCR的模板，以引物^扩增微囊藻伪空胞 基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Cts__H ;以引物#icr特异性扩增微 囊藻MsrTS财内参基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Cts_n16s ;两者差 值Ct室内目腿因_ Ct室内同一样本16s为校正后的细胞拷贝数，记作ACt室内目腿因； 6) 八(]1:野外_基_与ACt室肖_基_差值为里了外目的基因相对循环数，记作A ACt，米用 fAAet计算相对表达量； 7) 取不同时间的水样重复上述步骤1)?6)，以时间为横坐标，步骤6) Aet的值为 纵坐标绘制曲线，根据曲线确定越冬蓝藻越冬复苏期界限。
2. 根据权利要求1所述的判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，其特征在于：步骤2) 中微囊藻为微囊藻 (is aerygifliosa 。
3. 根据权利要求1所述的判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，其特征在于：步骤 2)中室内培养微囊藻的培养基为BG-11，培养温度为28?35 °C，光照强度为20?60 ii E ? (m2 ? s) \光照周期为 9 h:15 h ?12 h:12 h。
4. 根据权利要求1所述的判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，其特征在于：引物 序列为：g^7d5' -TGCTTTGCGTCAGTCTTTCC-3'， gvpC-R^ -TCCTTCACCTGTTTGGCTCT-3, 〇
5. 根据权利要求1所述的判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，其特征在于：引物 #icr 引物序列为 -GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3、 Micr431R^ -AATCCAAARACCTTCCTCCC-3, 〇
6. 根据权利要求1所述的判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，其特征在于：荧光定 量PCR的反应程序为：95°C 3min，紧接着40个循环，每个循环包括95°C 15s、55°C 30s和 72°C 45s〇
【文档编号】C12R1/89GK104388544SQ201410587421
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】虞龙, 张金丽, 李玉燕, 于洋, 杜明勇 申请人:南京工业大学