固定化全细胞催化制备(3r,5r)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种固定化全细胞催化制备(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，所述方法包括如下步骤：将固定化共表达全细胞、(R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯、辅因子、葡萄糖和缓冲液按一定比例混合，在pH＝5～8、温度为20～45℃下反应，经后处理得到产物。与现有技术相比，本发明所采用的方法具有生物催化剂容易与反应液分离、操作方便、催化剂可回收利用、产物收率及光学纯度高等优点，具有良好的应用价值。
【专利说明】固定化全细胞催化制备（3R, 5R)-6-氰基-3, 5-二羟基己酸 叔丁酯
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药工业生物【技术领域】，具体涉及一种固定化全细胞催化制备 (3R，5R) -6-氰基-3, 5-二羟基己酸叔丁酯的方法。
【背景技术】
[0002] (3R，5R)-6_氰基-3, 5-二羟基己酸叔丁酯是降胆固醇他汀类药物阿托伐他汀 (Atorvastat iη)的关键手性中间体，该中间体的合成技术一直以来受到广泛的研究与关 注。目前文献报道的制备方法主要有化学法和生物法。
[0003] 化学法工艺生产（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羟基己酸叔丁酯是利用硼烷类衍生物 在-70°C下将（R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯不对称还原得到。该工艺需要极端低 温和无水无氧的反应条件，所用的还原剂硼烷易燃，能耗严重且产品的立体异构纯度仅为 98% (US2009/0216029A1)，不利于工业化生产。
[0004] 〇附03911403公开了生物法合成（31?，51〇-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯，该方 法以（R) -6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯为底物，重组大肠杆菌发酵液为催化剂，底物浓 度最高只有55g/L，且需添加助溶剂二甲亚砜。该方法采用发酵液直接作催化剂时发酵液中 含有的杂质会对反应带来不利影响，且助溶剂二甲亚砜对环境污染较大，底物浓度过低，这 些因素都不利于工业化生产。
[0005] 申请号为201410462724.8的专利申请中报道了 一种酶法制备（3R，5R)-6-氰 基-3, 5-二羟基己酸叔丁酯的方法，该方法所用生物催化剂不可回收套用，后处理时生物 催化剂的分离去除比较困难，无形中增加了生产时间和成本。
[0006] 此外，我们在申请号为201410546518. 5的申请文件中公开了一种（3R，5R)-6-氰 基-3, 5-二羟基己酸叔丁酯的生物制备方法，该方法利用固定化细胞组合物催化合成目标 化合物，但是需要使用两种细胞，操作过程略显繁琐。
【发明内容】
[0007] 为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明公开了一种固定化全细胞催化制备 (3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羟基己酸叔丁酯的方法。
[0008] 具体工艺路线如下所示：
[0009]
【权利要求】
1. 一种固定化全细胞催化制备（3R，5R)-6-氰基-3, 5-二羟基己酸叔丁酯的方法，其特 征在于：将固定化共表达全细胞、（R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯、辅因子、葡萄糖和 缓冲液按一定比例混合后反应得到产物。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固定化共表达全细胞为将表达酮还原 酶（KRED)的基因与葡萄糖脱氢酶（GDH)的基因通过生物技术重组到同一质粒并装载到基 因工程菌中经发酵、固定化处理得到。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述基因工程菌为大肠杆菌或酵母菌，其中 优选为大肠杆菌。
4. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：利用所述固定化共表达全细胞催化反 应。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固定化共表达全细胞的浓度为100? 400g/L、所述（R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代叔丁酯的浓度为100?400g/L、所述辅因子的 浓度为〇. 001?1. 〇g/L、所述葡萄糖的浓度为100?400g/L和所述缓冲液的浓度为10? 100mM/L〇
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应在pH = 5?8、温度为20?45°C 下进行。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述辅因子为NAD、NADH、NADP和NADPH的 任意一种或它们的组合，其中优选为NADP。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或三乙醇胺 缓冲液，其中优选为三乙醇胺缓冲液。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定化共表达全细胞的制备方法为：将 共表达全细胞按一定比例与固定剂混合、干燥成型，所述固定剂为聚乙二醇、聚丙烯酰胺、 聚乙烯醇或海藻酸钙的一种或它们的组合。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述共表达全细胞与所述固定剂的比例 为：1 :1 ?1 :2。
【文档编号】C12R1/19GK104388488SQ201410587382
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】竺伟, 包蕾, 张文明, 吴会 申请人:尚科生物医药（上海）有限公司