利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及制备方法与应用。该菌株含有如下核苷酸序列：木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖激酶基因；其中，木酮糖激酶基因过表达。本发明通过同源重组，将组成型强启动子整合到酿酒酵母出发菌株基因组上木酮糖激酶基因上游，得到木酮糖激酶过表达的菌株；再转化入从萄牙假丝酵母获得木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因，得到利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌。该酿酒酵母工程菌能够以木糖为唯一碳源生长，为后续构建木糖和葡萄糖共发酵产乙醇的菌株奠定了基础；并可以该工程菌株为基础进一步筛选和改造，使其以木质纤维素为原料生产乙醇，从而大大降低乙醇的生产成本。
CCTCC NO：M 2014385
2014.08.20
【专利说明】利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及制备方法与应 用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程【技术领域】，特别涉及一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母 工程菌及制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 木质纤维素是一类丰富而廉价的可再生资源，是生产燃料乙醇的主要材料，经水 解后，可得到以葡萄糖和木糖为主的发酵性糖。木糖的有效利用是木质纤维素生物转化生 产乙醇的关键环节之一。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae从人类有记载以来就一直 是生产乙醇的首选，是目前在工业规模上发酵玉米淀粉和其他糖类化合物产乙醇的菌株， 耗糖迅速快、乙醇耐受能力强，在生物质转化中潜力具大。但酿酒酵母不能利用木糖，鉴于 自然界缺少能高效转化木糖生产乙醇的酿酒菌种，近年来通过基因工程技术获得了多种不 同类型的木糖发酵工程菌株，其中酿酒酵母是主要研究对象。但仍存在许多技术难题，具有 进一步提升的空间。
[0003] 酿酒酵母工程菌株中普遍存在的问题可总结为：碳源代谢抑制、胞内戊糖代谢通 路中的氧化还原失衡、以及底物摄取能力低下，在整个木质纤维素的发酵过程中，作为发酵 菌株的酿酒酵母还面临着来自环境和物料、遗传途径、胞内调节几方面的压力。然而目前对 这些问题尚未有有效的解决办法，将新型外源基因用于构建酿酒酵母木糖代谢途径，可进 一步了解其它菌株的代谢机制，是一种提高木糖发酵能力的有效策略，对丰富微生物代谢 工程的认识有重要价值。
[0004] 根据代谢工程理论，构建能利用木糖产乙醇的酿酒酵母工程菌株的重要途径 之一是克隆天然利用木糖的酵母菌的两个关键酶基因，木糖还原酶基因XYL1 (xylose reductase，XR)和木糖醇脱氧酶基因XYL2 (xylitol dehydrogenase, XDH)，并使其在酿酒酵 母细胞中表达。代谢通路中紧接着XYL1和XYL2的木酮糖激酶基因XKS (xylulokinase，XK) 也往往是酵母菌代谢木糖的瓶颈。引入外源XYL1、XYL2,过表达宿主菌的XKS，有望得到高 效发酵木糖产乙醇的工程菌株。
【发明内容】
[0005] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用木糖进行乙醇 发酵的酿酒酵母工程菌。该酿酒酵母工程菌可以以木糖为唯一碳源，发酵生产乙醇。
[0006] 本发明的另一目的在于提供所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制 备方法。
[0007] 本发明的再一目的在于提供所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的应 用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工 程菌，含有如下核苷酸序列：如SEQ ID NO. 1所示的木糖还原酶基因、如SEQ ID N0. 2所示 的木糖醇脱氢酶基因和如SEQ ID NO. 3所示的木酮糖激酶基因；
[0009] 所述的木糖还原酶基因来自葡萄牙假丝酵母；尚未有利用该基因的报道；
[0010] 所述的木糖醇脱氢酶基因来自葡萄牙假丝酵母；尚未有利用该基因的报道；
[0011] 所述的木酮糖激酶基因在所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌中过 表达；
[0012] 所述的过表达优选为使用强启动子启动木酮糖激酶基因的转录；
[0013] 所述的强启动子优选为磷酸甘油激酶启动子；
[0014] 所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，优选含有如下核苷酸序列：启动 子1+如SEQ ID NO. 1所示的木糖还原酶基因+终止子1、启动子2+如SEQ ID N0. 2所示 的木糖醇脱氢酶基因+终止子2和启动子3+SEQ ID NO. 3所示的木酮糖激酶基因+终止子 3 ；
[0015] 所述的启动子1优选为组成型启动子，特别优选为磷酸丙糖异构酶启动子 (pTPIl)，其来自酿酒酵母；
[0016]所述的终止子1优选为磷酸丙糖异构酶终止子（tTPIl)，其来自酿酒酵母；
[0017] 所述的启动子2优选为组成型启动子，特别优选为己糖转运蛋白HXI7的启动子 (PHXI7)，其来自酿酒酵母；
[0018] 所述的终止子2优选为CYC1终止子，其来自载体PYES2 ;
[0019]所述的启动子3优选为组成型强启动子，保证了木酮糖激酶基因过表达；特别优 选为磷酸甘油激酶启动子（PPGK1);
[0020] 所述的终止子3优选为木酮糖激酶终止子；
[0021] 所述的核苷酸序列优选为整合到所述酿酒酵母工程菌的染色体上；
[0022] 所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的出发菌株优选为酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae CICC 1917 ；
[0023] 所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，优选名称为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)004_PGK的菌株，其于2014年8月20日保藏在位于中国武汉 武汉大学内的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO :M 2014385 ;
[0024] 所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制备方法，包含如下步骤：
[0025] (1)设计如下引物（5'-3'）
[0026]表1
[0027]
【权利要求】
1. 一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于含有如下核苷酸序列： 如SEQ ID NO. 1所示的木糖还原酶基因、如SEQ ID NO. 2所示的木糖醇脱氢酶基因和如SEQ ID NO. 3所示的木酮糖激酶基因。
2. 根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述 的木酮糖激酶基因在所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌中过表达。
3. 根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于含有如 下核苷酸序列：启动子1+如SEQ ID NO. 1所示的木糖还原酶基因+终止子1、启动子2+如 SEQ ID NO. 2所示的木糖醇脱氢酶基因+终止子2和启动子3+SEQ ID NO. 3所示的木酮糖 激酶基因+终止子3。
4. 根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述 的启动子1为磷酸丙糖异构酶启动子； 所述的终止子1为磷酸丙糖异构酶终止子； 所述的启动子2为己糖转运蛋白HXI7的启动子； 所述的终止子2为CYC1终止子； 所述的启动子3为磷酸甘油激酶启动子； 所述的终止子3为木酮糖激酶终止子。
5. 根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述 的核苷酸序列为整合到所述酿酒酵母工程菌的染色体上。
6. 根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所 述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的出发菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CICC 1917。
7. 根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌为名称为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)004-PGK的菌株，其于2014年8月20日保藏在位于中国武汉武汉大学内的中 国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO :M 2014385。
8. 权利要求1?7任一项所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制备方法， 其特征在于包含如下步骤： ⑴设计如下引物，引物方向均为5'-3' ： 3sites oligo dT ：GAGCGGATAACAATTTCACACAGGTTTTTTTTTTTTTTTT ； XYL1-DEG-F ：ATGCTATTAAAGTAGGTTATAGATTATTYGAYGGNGC ； XYL1-DEG-R ：ATTAAATGTGGTTGTTGTAAATATGGRTGRTGYTC ； XYL2-DEG-F ：GTTATAGTTGAAGTTAAGAAAACTGGNATHTGYGG ； XYL2-DEG-R ：CAGCTAATAAACCAACTGGACCNGCNCCRAA ； xyll 3sites F ：CTTGAACCTCGAGTACCTTG ； xyl2 3sites F ：CCACATCCAAAGAAGGCGAAC ； 3sites Adaptor ：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG ； 5sites Tri-G ：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG ； xyll 5sites R ：AAGTCGCTCAATGTCTTGTCC ； xyl2 5sites R：TGGTCTGGCAACTTAACCAA ； 5sites Adaptor ：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC ； xyll-cDNA-F ：GCTTTCCCGATGACACGTTTGCGAAAAT ； xyll-cDNA-R ：AATATGACTAATAGAAGGTAATTTT ； xyl2-cDNA-F ：CCACCTCAAGGTATGAGCCTAT ； xyl2-cDNA-R ：AACGGAGAAGAAAACCATTAGCTTT ； pXKSl-F ：GGGCCCGAATTCAGCCCGACGGATATACCACTTATGT ； pXKSl-R ：GGGCCCGGTACCTAAAGTACTAATCTCATCCTCCTTT ； pPGKl-F ：GGGCCCGGTACCAAGAAATTACCGTCGCTCGTG ； pPGKl-R ：GGGCCCGGATCCTGTTTTATATTTGTTGTAAA ； XKS1 ORF-F ：GGGCCCGGATCCATGTTGTGTTCAGTAATTCA ； XKS1 ORF-R ：GGGCCCGTCGACTTAGATGAGAGTCTTTTCCA ； XKSl-ext-R ：GCGCTAATTTGATTTGTCT ； pTPIl-F ：GGGCCCACTAGTCTACGTATGGTCATTTCTTC ； pTPIl-R ：GGGCCCGAATTCCTGTATGTGTTTTTTGTAGT ； xyll-F ：GGGCCCGAATTCATGGCCACTATTAAGTTGAA ； xyll-R ：TTTATATAATTATATTAATCGGTACCCTAGTGGAAGATTGGGATTT ； tTPIl-F ：AAATCCCAATCTTCCACTAGGGTACCGATTAATATAATTATATAAA ； tTPIl-R ：CATACCCCTCATTTCCACGGGAGCTCGCTCTTCTATATAACAGTTG ； PHXT7-F ：CAACTGTTATATAGAAGAGCGAGCTCCCGTGGAAATGAGGGGTATG ； PHXT7-R ：TGTCTGGCAATGCGCCCCACGGATCCTTTTTGATTAAAATTAAAAA ； xyl2-F ：TTTTTAATTTTAATCAAAAAGGATCCATGTCCAACCCATCTTTGGT ； xyl2-R ：GGGCCCTCTAGATTACTCAGGACCGTCAATAA ； (2) 获得木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因 ① 提取葡萄牙假丝酵母的总RNA，使用引物3sites oligo dT进行反转录，得到cDNA; ② 以得到的cDNA作为模板，使用引物对XYL1-DEG-F+XYL1-DEG-R以及引物对 XYL2-DEG-F+XYL2-DEG-R分别进行PCR，PCR产物经过纯化后与T载体连接，测序后证明是 木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的部分序列； ③ 3' RACE :以步骤①得到的cDNA为模板，分别使用特异引物xyll 3sites F和xyl2 3sites F结合3sites Adaptor引物进行PCR反应，PCR产物纯化后连接T载体后测序； @5'狀0￡:提取葡萄牙假丝酵母的总1?隱，使用引物38^68〇11§〇(11'和58^68 Tri-G进行反转录，得到cDNA ;以该cDNA为模板，分别使用特异引物xyll 5sites R和xyl2 5sites R结合5sites Adaptor引物进行PCR反应，PCR产物纯化后连接T载体后测序； ⑤再以步骤①得到的cDNA为模板，使用xyl 1-cDNA-F和xyl 1-cDNA-R为引物对，PCR得 到木糖还原酶基因；使用xyl2-cDNA-F和xyl2-cDNA-R为引物对，PCR得到木糖醇脱氢酶基 因； (3) 获得木酮糖激酶启动子片段、磷酸甘油激酶启动子片段、木酮糖激酶基因片段、磷 酸丙糖异构酶启动子片段、磷酸丙糖异构酶终止子片段、葡萄糖转运蛋白HXI7启动子片段 以酿酒酵母基因组DNA为模板，以pXKSl-F和pXKSl-R为引物对，PCR得到木酮糖激酶 启动子片段；以PPGK1-F和pPGKl-R为引物对，PCR得到磷酸甘油激酶启动子片段；以XKS1 ORF-F和XKS1 ORF-R为引物对，PCR得到木酮糖激酶基因片段；以pTPIl-F和pTPIl-R为引 物对，PCR得到磷酸丙糖异构酶启动子片段；以tTPIl-F和tTPIl-R为引物对，PCR得到磷 酸丙糖异构酶终止子片段；以PHXI7-F和pHXI7-R为引物对，PCR得到葡萄糖转运蛋白HXI7 的启动子片段； (4) 重组载体的构建 I、 酿酒酵母整合型表达载体nplac211-dpXKS的构建 用BamHI-Kpnl酶切磷酸甘油激酶启动子片段，连入Hplac211的BamHI-Kpnl切口，得 到质粒nplac211-Pp ;接着用KpnI-EcoRI酶切木酮糖激酶启动子片段，连入nplac211-Pp 的KpnI-EcoRI切口，得到质粒nplac211-dp ;用Sall-BamHI酶切木酮糖激酶基因片段，连 入 nplac211-dp 的 Sall-BamHI 切口，得到质粒 nplac211-dpXKS ; II、 质粒P0J04的构建 以步骤⑵①得到的cDNA为模板，以xyll-F和xyll-R为引物对，扩增得到xyll基 因；以步骤⑵①得到的cDNA为模板，以xyl2_F和xyl2_R为引物对，扩增得到xyl2基因； 用Spel-EcoRI酶切上一步骤得到的磷酸丙糖异构酶启动子片段，连入pYES2的Spel-EcoRI 切口，得到质粒P〇J〇l ;将xyll基因和上一步骤得到的磷酸丙糖异构酶终止子片段等摩 尔比混合后作为模板，使用引物对xyll-F+tTPIl-R扩增得到XYLl-tTPIl ;将xyl2基因 和上一步骤得到的葡萄糖转运蛋白HXI7启动子片段等摩尔比混合后作为模板，使用引物 对 pHXI7-F+xyl2-R 扩增得到 pHXI7-XYL2 ;XYLl-tTPIl 和 pHXI7-XYL2 经纯化后，以之作为 模板再次进行融合PCR，使用引物对xyll-F+Xyl2-R，得到4片段的融合产物XYLl-t-p-2 ; XYLl-t-p-2 用 EcoRI-Xbal 酶切，连入 pOJOl 的 EcoRI-Xbal 切口，得到质粒 p0J04 ; (5) 木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌的制备 将线性化的nplac211-dpXKS转化入酿酒酵母感受态细胞，涂布于含有1M山梨醇溶液 的尿嘧啶省却培养基选择性平板，30°C倒置培养；使用引物pPGKl-F和XKSl-ext-R通过菌 落PCR筛选得到阳性克隆；将阳性克隆涂布于含有5-F0A的筛选平板上，使用引物pPGKl-F 和XKSl-ext-R再次筛选pPGKl正确插入到XKS 0RF之前的转化子，得到木酮糖激酶过表达 的酿酒酵母菌； (6) 表达木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的酿酒酵母重组菌株的获得 将木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌处理成感受态细胞；接着将线性化的P0J04转化入 木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌感受态细胞中，涂布于含有1M山梨醇溶液的尿嘧啶省却 培养基选择性平板，30°C倒置培养，使用引物xyl 1-F和xyl 1-R进行菌落PCR，筛选出表达木 糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的酿酒酵母重组菌株。
9.根据权利要求8所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制备方法，其特征 在于： 步骤（2)中所述的葡萄牙假丝酵母为萄萄牙假丝酵母Candida lusitaniae CICC 1461 ； 步骤（2)②和⑤中所述的PCR的体系为：Premix LA Taq 25 iiL、浓度为10mM的上游引 物4 ii L、浓度为10mM的下游引物4 ii L、模板2 ii L，ddH20补足至50 ii L ; 步骤⑵③中所述的PCR的体系为：Premix LA Taq 25 iiL、浓度为lOmM的特异引物 2 u L、浓度为 lOmM 的 3sites Adaptor 2 u L、模板 2 u L，ddH20 补足至 50 u L ; 步骤（2)④中所述的反转录的具体步骤如下： A、 将浓度 ly g/y L 的总 RNA2. 75ii L 和浓度为 lOOiiM 的 3sites oligo dT 引物 lii L 混合均匀，离心后在PCR仪上72°C温育3min，然后冷却至42°C处理2min，离心后冰浴； B、 往步骤A得到的反应液中加入浓度为20 ii M的5sites Tri-G引物1 ii L，混合均匀； 接着加入Master Mixture溶液，混合均勻；42°C温育90min进行逆转录；70°C处理lOmin 终止反应；加入l〇〇y L Tris-EDTA缓冲液，得到cDNA ;Master Mixture溶液的组成如下： ddH200. 75 ii l、5XBuffer 1、浓度为 10mM 的 dNTP mixture 1 y 1、浓度为 20 U/ii 1 的 RNase InhibitorO. 5 u 1、浓度为 100U 的 SMARTScribe Reverse Transcriptase In 1 ; 步骤⑵④中所述的PCR的体系为：Premix LA Taq 25 iiL、浓度为lOmM的特异引物 2 u L、浓度为 lOmM 的 5sites Adaptor 2 u L、模板 2 u L，ddH20 补足至 50 u L ; 步骤（2)中所述？0?的条件为：941：1111111;941：3〇8,551：3〇8,721：延伸11*/111111， 30cycles ；72°C lOmin ； 步骤（3)和步骤（5)中所述的酿酒酵母为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CICC 1917 ； 步骤⑶中所述的PCR的反应体系为：Premix LA Taq 25iiL、浓度为10mM的上游引物 2 U L、浓度为10mM的下游引物2 ii L、模板2 ii L，ddH20补足至50 ii L。
10.权利要求1?7任一项所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的应用，其特 征在于：所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌用于以木糖为原料生产乙醇。
【文档编号】C12N15/81GK104328061SQ201410588693
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】朱明军, 区健发, 谢文化 申请人:华南理工大学