作为昆虫控制剂的dsrna的制作方法

作为昆虫控制剂的dsrna的制作方法
【专利摘要】本发明涉及使用双链RNA分子来控制有害生物侵袭的方法。本发明提供了制备表达所述双链RNA分子的转基因植物的方法，以及通过本发明植物生产的杀虫剂和商品产品。
【专利说明】作为屋虫控制剂的DSRNA
[000。 本申请为2006年9月18日提交的、发明名称为"作为昆虫控制剂的DSRNA"的PCT 申请PCT/IB2006/004003的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2008年5 月16日，申请号为200680042821. 5。 发明领域
[0002] -般而言，本发明涉及对有害生物（pest)侵袭的遗传学控制。更具体地，本发明 涉及双链RNA重组技术，用于阻遏或抑制有害生物中祀编码序列的表达。
[0003] 导论
[0004] 环境中充满有害生物，人们已经试图使用多种方法来控制有害生物对植物的侵 袭。用于控制显微有害生物侵袭的组合物已经W抗生素、抗病毒和抗真菌组合物的形式提 供。通常，用于控制较大有害生物（例如，线虫）侵袭的方法是化学组合物的形式，其被应 用于有害生物驻留的表面，或者W小丸、散剂、片剂、糊剂或胶囊剂的形式施用给受侵袭的 动物。
[0005] 商业作物通常是昆虫攻击的目标。过去数十年来已经做出了相当的进展，开发出 了更高效的方法和组合物用于控制植物中的昆虫侵袭。化学杀虫剂对于根除有害生物侵袭 非常有用。然而，使用化学杀虫剂有若干种缺点。化学杀虫剂有可能对于环境有害，而且， 化学杀虫剂还不是选择性的，其对于多种作物和非祀标动物群体同样有害。化学杀虫剂持 续存在于环境中，通常代谢得很慢（如果有代谢）。它们在食物链中积累，特别是高等食肉 动物物种中。该些化学杀虫物质的积累导致对该些物质抗性的发展，并且可能在进化梯中 高等的物种中，成为诱变剂和/或致癌物，导致不可逆的和有害的遗传修饰。
[0006] 因为与化学杀虫剂相关的该些危险，已经开发了分子手段来控制植物上的有害生 物侵袭。例如，苏云金芽抱杆菌炬acillus thuringiensis)炬.t.)细菌已经可商业获得， 其在超过H十年来用作为环境安全的、可接受的杀昆虫剂。化学杀虫物质应用的减少已经 产生了更干净的±壤，W及从从±壤流入周围溪流、河流、池塘和湖泊的更干净的水。除了 该些环境益处之外，由于化学杀昆虫物质使用的减少，在生长转基因昆虫抗性作物的作物 田间，有益昆虫数量也显著增加了。
[0007] RNA干扰（RNAi)提供了用于控制基因表达的潜在的强大工具，因为其能特异 性祀向选择，并且W显著高的效率进行祀向mRNA遏制。RNAi指通过短干扰RNA(SiRNA) 介导的序列特异性转录后基因沉默狂amore，P.等人，Cell 101:25-33(2000) ;Fire，A. 等人，化1:脚6 391:806(1998);化 milton 等人，Science 286, 950-951(1999) ;Lin 等 人，化化re 402:128-129(1999))。虽然RNAi的机制还没有获得完全表征，但是人们认为， 细胞中dsRNA的存在通过激活核糖核酸酶III切酶来触发RNAi Gamore, P.等人，（2000); Hammond等人，化化re 404,293(2000))。切酶将的dsRNA加工为短片段，其被称为短干 扰RNA(SiRNA)，其为大约21至大约23个核巧酸长，包含约19个碱基对双链体狂amore等 人，（2000) ;E化ashir 等人，Genes Dev. ,15, 188 (2001))。递送进细胞后，SiRNA 分子与内 切核酸酶复合物相关联，该复合体通常被称为RNA诱导性沉默复合物巧ISC)，其将SiRNA的 反义链和细胞mRNA基因祀带到一起。RISC切割mRNA，然后所述mRNA释放并被降解。重要 地，然后RISC能降解祀mRNA的额外拷贝。
[0008] 因此，本发明提供了通过阻遏、延迟或降低特定有害生物中的基因表达来控制有 害生物侵袭的方法和组合物。


【发明内容】

[0009] 在一个方面，本发明提供了经分离的核巧酸序列，其包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、 11、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、 215、220、225、230、240-247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、 498、503、508-513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、 609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、 878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066-1071、1073、 1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、1101'1103、 1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、 1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、 1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、 2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、 2120 - 2338、2339、2344、2：349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、 2466、2471、2476和2481中示出的核酸序列。在一种实施方案中，本发明提供了双链核糖 核巧酸序列，其是多核巧酸序列的表达产生的，其中，植物的有害生物摄入所述核糖核巧酸 序列能抑制所述有害生物的生长。在又一实施方案中，摄入所述序列抑制与所述序列充分 互补的核巧酸序列的表达。在另一实施方案中，用该多核巧酸转化细胞。在还一实施方案 中，用该多核巧酸转化植物或植物细胞。在又一实施方案中，从经转化的植物产生种子或产 品。在再一实施方案中，产品选自食品、饲料、纤维、纸、餐食、蛋白质、淀粉、面粉、青胆饲料、 咖啡、茶和油构成的组。
[0010] 在另一实施方案中，本发明提供了与 SEQ ID N0s:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、 21、23、49 - 158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、 230、240-247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、 508-513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621" 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、 890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066-1071、1073、1075、1077、 1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101'1103、1105、1107、 1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、 1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、 1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、 2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、 2339、2：344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、 2476和2481中的任何序列示出的核酸序列具有至少70%序列同一性的核巧酸序列。在 一种实施方案中，本发明提供了双链核糖核巧酸序列，其是多核巧酸序列的表达产生的，其 中，植物的有害生物摄入所述核糖核巧酸序列能抑制所述有害生物的生长。在又一实施方 案中，摄入所述序列抑制与所述序列充分互补的核巧酸序列的表达。在另一实施方案中，用 该多核巧酸转化细胞。在还一实施方案中，用该多核巧酸转化植物或植物细胞。在又一实施 方案中，从经转化的植物产生种子或产品。在再一实施方案中，产品选自食品、饲料、纤维、 纸、餐食、蛋白质、淀粉、面粉、青胆饲料、咖啡、茶和油。
[0011] 在另一方面，本发明提供了包含 SEQ ID N0s:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、 23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、 247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、 519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、 783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046'1051'1056、1061'1071'1073'1075'1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中任 何序列或其互补序列的至少17个连续核巧酸的基因的直向同源物。在一种实施方案中，本 发明提供了双链核糖核巧酸序列，其是多核巧酸序列的表达产生的，其中，植物的有害生物 摄入所述核糖核巧酸序列能抑制所述有害生物的生长。在又一实施方案中，摄入所述序列 抑制与所述序列充分互补的核巧酸序列的表达。在另一实施方案中，用该多核巧酸转化细 胞。在还一实施方案中，用该多核巧酸转化植物或植物细胞。在又一实施方案中，从经转化 的植物产生种子或产品。在再一实施方案中，产品选自食品、饲料、纤维、纸、餐食、蛋白质、 淀粉、面粉、青胆饲料、咖啡、茶和油。
[0012] 在另一个方面，本发明提供了包含源自有害生物物种的双链核糖核酸序列的植 物。在一种实施方案中，有害生物选自昆虫、蜘蛛类、甲壳类、真菌、细菌、病毒、线虫、扁形动 物、蝴虫、烧虫、钩虫、缘虫、锥虫、血吸虫、狂禍、跳圣、壁風、峨和風。在另一实施方案中，植 物是胞质雄性不育的。在另一实施方案中，序列能抑制有害生物的生物学活性。在另一实 施方案中，序列能抑制祀序列的表达。在又一实施方案中，祀序列是昆虫、线虫、细菌或真菌 序列。
[0013] 在另一个方面，本发明提供了控制有害生物侵袭的方法，所述方法包括；向有害 生物提供植物材料，所述植物材料包含能抑制有害生物生物学活性的多核巧酸序列。在一 种实施方案中，所述多核巧酸序列是569 10^:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160-163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240-247、 249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-513、515、517、 519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、 783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、 908-1040、1041'1046、1051'1056、1061'1066-1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 I161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：M9、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中的 任何序列或其互补序列示出的。
[0014] 在另一个方面，本发明提供了包含表达祀多核巧酸序列的植物的杀虫剂。
[0015] 在另一个方面，本发明提供了一种方法，用于控制有害生物侵袭，所述方法包括： (a)鉴定出有害生物中的祀序列；化）将所述序列引入植物；W及（C)向所述有害生物提供 所述植物或其部分。
[0016] 在另一个方面，本发明提供了一种方法，用于控制有害生物侵袭，所述方法包括： (a)鉴定出第一有害生物物种中的祀序列；化）搜索出第二有害生物物种中的直向同源祀 序列；(C)将所述直向同源序列引入植物；W及（d)向所述第二有害生物提供所述植物或其 部分。在另一实施方案中，所述祀是来自马铃墓叶甲（Ldecemlineata)的基因，所述植物 选自金合欢、首荐、苹果、杏、朝鲜葫、白蜡树、天口冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜化eet)、 禅木、山毛棒、黑霉、蓝霉、挪菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜（canola)、甜瓜、胡萝K木墓、 花挪菜、雪松、谷类、芹菜、栗、禮、大白菜、巧橘、克莱口氏小巧橘、H叶草、咖啡、棉、班豆、黄 瓜、柏木、茄子、偷、宦卖菜（endive)、按树、茵香、无花果、冷杉、老鹤草、葡萄、葡萄抽、落花 生、酸浆、橡胶铁杉（gum hemlock)、山核桃、羽衣甘蓝、縣猴桃、孽蓝、落叶松、窝宦、韭葱、 巧樣、来樣、洋槐、松、铁线藤、玉米、芒果、械树、瓜、泰、磨茹、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、 葱、枯、观赏植物或花或树、番木瓜、踪搁、欧芹、欧洲防风草、魏豆、桃、花生、梨、沼泽植物 (peat)、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石恼、马铃墓、西葫芦、菊宦（radicchio)、萝 K油菜（rapeseed)、息钩子、稻、黑麦、高梁、柳树、玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖萝K甘藏、向 日葵、甘墓、甜玉米、红枯（tangerine)、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、宪青、蔓生植物、 核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、墓葫、红豆杉和夏南瓜。
[0017] 在另一个方面，本发明提供了一种方法，用于提高作物产量，所述方法包括（a)向 植物中引入多核巧酸；W及化）种植所述植物，W令多核巧酸表达，其中，所述表达抑制有 害生物进食（feeding) W及由于有害生物侵袭导致的产量损失。在一种实施方案中，所述 有害生物选自昆虫、线虫和真菌。在另一实施方案中，多核巧酸表达产生下述RNA分子，其 能在摄入了所述作物植物的一部分的昆虫有害生物中遏制下述祀基因，其中，所述祀基因 执行选自W下的至少一种重要功能：有害生物进食、有害生物生存能力（Vi油ility)、有害 生物细胞调亡、有害生物或任何有害生物细胞的分化和发育、有害生物的有性繁殖、肌肉形 成、肌肉颤摇、肌肉收缩、保幼激素形成和/或降低、保幼激素调节、离子调节和转运、细胞 膜电位保持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、信息素合成、信息素感知、触角形成、 翅膀形成、腿形成、卵形成、幼虫成熟、消化酶形成、血淋己合成、血淋己保持、神经传递、幼 虫期转换、蛹化、从蛹化出现、细胞分裂、能量代谢、呼吸、细胞骨架结构合成和保持、核巧酸 代谢、氮代谢、水的使用、水驻留和感知。
[0018] 在另一个方面，本发明提供了一种方法，用于生产商品产品，所述方法包括；(a) 鉴定出有害生物中的祀序列；(b)将所述序列引入植物细胞；（C)在适于产生植物的条件下 培养所述植物细胞；W及（d)从所述植物或其部分来生产商品产品。在另一实施方案中，所 述祀是来自马铃墓叶甲的基因，所述植物选自金合欢、首荐、苹果、杏、朝鲜葫、白蜡树、天口 冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜化eet)、禅木、山毛棒、黑霉、蓝霉、挪菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡 诺拉油菜（canola)、甜瓜、胡萝K木墓、花挪菜、雪松、谷类、芹菜、栗、禮、大白菜、巧橘、克 莱口氏小枯橘、立叶草、咖啡、棉、班豆、黄瓜、柏木、茄子、偷、宦卖菜（endive)、按树、茵香、 无花果、冷杉、老鹤草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸浆、橡胶铁杉（gum hemlock)、山核桃、羽衣 甘蓝、縣猴桃、孽蓝、落叶松、窝宦、韭葱、巧樣、来樣、洋槐、松、铁线藤、玉米、芒果、械树、瓜、 泰、磨茹、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、枯、观赏植物或花或树、番木瓜、踪搁、欧芹、欧洲 防风草、魏豆、桃、花生、梨、沼泽植物（peat)、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石恼、 马铃墓、西葫芦、菊宦（radicchio)、萝K油菜（rapeseed)、息钩子、稻、黑麦、高梁、柳树、 玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖萝K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、红枯（tangerine)、茶、烟草、番 茄、树、黑小麦、草坪草、宪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、墓葫、红豆杉和夏南瓜。
[0019] 在另一实施方案中，所述碑1是来自辣根猿叶甲化cochleariae)的基因，所述植 物选自金合欢、首荐、苹果、杏、朝鲜葫、白蜡树、天口冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、禅木、 山毛棒、黑霉、蓝霉、挪菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝K木墓、花挪菜、雪松、 谷类、芹菜、栗、禮、大白菜、枯橘、克莱n氏小枯橘、H叶草、咖啡、棉、班豆、黄瓜、柏木、茄 子、偷、宦卖菜、按树、茵香、无花果、冷杉、老鹤草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山 核桃、羽衣甘蓝、縣猴桃、孽蓝、落叶松、窝宦、韭葱、巧樣、来樣、洋槐、松、铁线藤、玉米、芒 果、械树、瓜、泰、磨茹、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、枯、观赏植物或花或树、番木瓜、踪 搁、欧芹、欧洲防风草、魏豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、 石恼、马铃墓、西葫芦、菊宦、萝K油菜、息钩子、稻、黑麦、高梁、柳树、玻菜、云杉、南瓜、草 霉、糖萝K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、红枯、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、宪青、蔓 生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、墓葫、红豆杉和夏南瓜。
[0020] 在另一实施方案中，所述祀是来自墨西哥豆瓢虫巧.varivetis)的基因，所述植 物选自金合欢、首荐、苹果、杏、朝鲜葫、白蜡树、天口冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、禅木、 山毛棒、黑霉、蓝霉、挪菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝K木墓、花挪菜、雪松、 谷类、芹菜、栗、禮、大白菜、巧橘、克莱口氏小巧橘、H叶草、咖啡、棉、班豆、黄瓜、柏木、茄 子、偷、宦卖菜、按树、茵香、无花果、冷杉、老鹤草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山 核桃、羽衣甘蓝、縣猴桃、孽蓝、落叶松、窝宦、韭葱、巧樣、来樣、洋槐、松、铁线藤、玉米、芒 果、械树、瓜、泰、磨茹、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、枯、观赏植物或花或树、番木瓜、踪 搁、欧芹、欧洲防风草、魏豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、 石恼、马铃墓、西葫芦、菊宦、萝K油菜、息钩子、稻、黑麦、高梁、柳树、玻菜、云杉、南瓜、草 霉、糖萝K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、红枯、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、宪青、蔓 生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、墓葫、红豆杉和夏南瓜。
[0021] 在另一实施方案中，所述祀是来自墨西哥棉铃象（A.grandis)的基因，所述植物 选自金合欢、首荐、苹果、杏、朝鲜葫、白蜡树、天口冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、禅木、山 毛棒、黑霉、蓝霉、挪菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝K木墓、花挪菜、雪松、谷 类、芹菜、栗、禮、大白菜、巧橘、克莱n氏小枯橘、立叶草、咖啡、棉、班豆、黄瓜、柏木、茄子、 偷、宦卖菜、按树、茵香、无花果、冷杉、老鹤草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核 桃、羽衣甘蓝、縣猴桃、孽蓝、落叶松、窝宦、韭葱、巧樣、来樣、洋槐、松、铁线藤、玉米、芒果、 械树、瓜、泰、磨茹、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、枯、观赏植物或花或树、番木瓜、踪搁、 欧芹、欧洲防风草、魏豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石 恼、马铃墓、西葫芦、菊宦、萝K油菜、息钩子、稻、黑麦、高梁、柳树、玻菜、云杉、南瓜、草霉、 糖萝K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、红枯、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、宪青、蔓生植 物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、墓葫、红豆杉和夏南瓜。
[0022] 在另一实施方案中，所述祀是来自赤拟谷盗（T. castaneum)的基因，所述植物选 自金合欢、首荐、苹果、杏、朝鲜葫、白蜡树、天口冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、禅木、山 毛棒、黑霉、蓝霉、挪菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝K木墓、花挪菜、雪松、谷 类、芹菜、栗、禮、大白菜、册喬、克莱n氏小枯橘、立叶草、咖啡、棉、班豆、黄瓜、柏木、茄子、 偷、宦卖菜、按树、茵香、无花果、冷杉、老鹤草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核 桃、羽衣甘蓝、縣猴桃、孽蓝、落叶松、窝宦、韭葱、巧樣、来樣、洋槐、松、铁线藤、玉米、芒果、 械树、瓜、泰、磨茹、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、枯、观赏植物或花或树、番木瓜、踪搁、 欧芹、欧洲防风草、魏豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石 恼、马铃墓、西葫芦、菊宦、萝K油菜、息钩子、稻、黑麦、高梁、柳树、玻菜、云杉、南瓜、草霉、 糖萝K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、红枯、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、宪青、蔓生植 物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、墓葫、红豆杉和夏南瓜。
[0023] 在另一实施方案中，所述祀是来自桃闽（Epersicae)的基因，所述植物选自金合 欢、首荐、苹果、杏、朝鲜葫、白蜡树、天n冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、禅木、山毛棒、黑 霉、蓝霉、挪菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝K木墓、花挪菜、雪松、谷类、芹菜、 栗、禮、大白菜、枯橘、克莱口氏小枯橘、立叶草、咖啡、棉、班豆、黄瓜、柏木、茄子、偷、宦卖 菜、按树、茵香、无花果、冷杉、老鹤草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衣 甘蓝、縣猴桃、孽蓝、落叶松、窝宦、韭葱、巧樣、来樣、洋槐、松、铁线藤、玉米、芒果、械树、瓜、 泰、磨茹、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、枯、观赏植物或花或树、番木瓜、踪搁、欧芹、欧洲 防风草、魏豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石恼、马铃墓、 西葫芦、菊宦、萝K油菜、息钩子、稻、黑麦、高梁、柳树、玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖萝K甘 藏、向日葵、甘墓、甜玉米、红枯、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、宪青、蔓生植物、核桃、 豆瓣菜、西瓜、小麦、墓葫、红豆杉和夏南瓜。
[0024] 在另一实施方案中，所述祀是来自褐飞風（N. Iugens)的基因，所述植物选自金合 欢、首荐、苹果、杏、朝鲜葫、白蜡树、天n冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、禅木、山毛棒、黑 霉、蓝霉、挪菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝K木墓、花挪菜、雪松、谷类、芹菜、 栗、禮、大白菜、枯橘、克莱n氏小枯橘、H叶草、咖啡、棉、班豆、黄瓜、柏木、茄子、偷、宦卖 菜、按树、茵香、无花果、冷杉、老鹤草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衣 甘蓝、縣猴桃、孽蓝、落叶松、窝宦、韭葱、巧樣、来樣、洋槐、松、铁线藤、玉米、芒果、械树、瓜、 泰、磨茹、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、枯、观赏植物或花或树、番木瓜、踪搁、欧芹、欧洲 防风草、魏豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石恼、马铃墓、 西葫芦、菊宦、萝K油菜、息钩子、稻、黑麦、高梁、柳树、玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖萝K甘 藏、向日葵、甘墓、甜玉米、红枯、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、宪青、蔓生植物、核桃、 豆瓣菜、西瓜、小麦、墓葫、红豆杉和夏南瓜。
[00巧]在另一实施方案中，所述祀是来自二化頓（C. suppressalis)的基因，所述植物选 自金合欢、首荐、苹果、杏、朝鲜葫、白蜡树、天口冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、禅木、山 毛棒、黑霉、蓝霉、挪菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝K木墓、花挪菜、雪松、谷 类、芹菜、栗、禮、大白菜、巧橘、克莱n氏小枯橘、立叶草、咖啡、棉、班豆、黄瓜、柏木、茄子、 偷、宦卖菜、按树、茵香、无花果、冷杉、老鹤草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核 桃、羽衣甘蓝、縣猴桃、孽蓝、落叶松、窝宦、韭葱、巧樣、来樣、洋槐、松、铁线藤、玉米、芒果、 械树、瓜、泰、磨茹、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、枯、观赏植物或花或树、番木瓜、踪搁、 欧芹、欧洲防风草、魏豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石 恼、马铃墓、西葫芦、菊宦、萝K油菜、息钩子、稻、黑麦、高梁、柳树、玻菜、云杉、南瓜、草霉、 糖萝K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、红枯、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、宪青、蔓生植 物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、墓葫、红豆杉和夏南瓜。
[0026] 在另一实施方案中，所述祀是来自菜蛾（P.xylostella)的基因，所述植物选自金 合欢、首荐、苹果、杏、朝鲜葫、白蜡树、天口冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、禅木、山毛棒、 黑霉、蓝霉、挪菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝K木墓、花挪菜、雪松、谷类、芹 菜、栗、禮、大白菜、巧橘、克莱n氏小枯橘、立叶草、咖啡、棉、班豆、黄瓜、柏木、茄子、偷、宦 卖菜、按树、茵香、无花果、冷杉、老鹤草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽 衣甘蓝、縣猴桃、孽蓝、落叶松、窝宦、韭葱、巧樣、来樣、洋槐、松、铁线藤、玉米、芒果、械树、 瓜、泰、磨茹、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、枯、观赏植物或花或树、番木瓜、踪搁、欧芹、 欧洲防风草、魏豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石恼、马 铃墓、西葫芦、菊宦、萝K油菜、息钩子、稻、黑麦、高梁、柳树、玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖萝 K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、红枯、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、宪青、蔓生植物、 核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、墓葫、红豆杉和夏南瓜。
[0027] 在另一实施方案中，所述祀是来自居屋艾幡（A. domesticus)的基因，所述植物选 自金合欢、首荐、苹果、杏、朝鲜葫、白蜡树、天口冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、禅木、山 毛棒、黑霉、蓝霉、挪菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝K木墓、花挪菜、雪松、谷 类、芹菜、栗、禮、大白菜、册喬、克莱n氏小枯橘、立叶草、咖啡、棉、班豆、黄瓜、柏木、茄子、 偷、宦卖菜、按树、茵香、无花果、冷杉、老鹤草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核 桃、羽衣甘蓝、縣猴桃、孽蓝、落叶松、窝宦、韭葱、巧樣、来樣、洋槐、松、铁线藤、玉米、芒果、 械树、瓜、泰、磨茹、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、枯、观赏植物或花或树、番木瓜、踪搁、 欧芹、欧洲防风草、魏豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石 恼、马铃墓、西葫芦、菊宦、萝K油菜、息钩子、稻、黑麦、高梁、柳树、玻菜、云杉、南瓜、草霉、 糖萝K甘藏、向日葵、甘墓、甜玉米、红枯、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、宪青、蔓生植 物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、墓葫、红豆杉和夏南瓜。
[0028] 在另一实施方案中，所述祀是来自真菌的基因，所述植物选自金合欢、首荐、苹果、 杏、朝鲜葫、白蜡树、天口冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、禅木、山毛棒、黑霉、蓝霉、挪菜、 抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝K木墓、花挪菜、雪松、谷类、芹菜、栗、禮、大白菜、 巧橘、克莱口氏小巧橘、H叶草、咖啡、棉、班豆、黄瓜、柏木、茄子、偷、宦卖菜、按树、茵香、无 花果、冷杉、老鹤草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衣甘蓝、縣猴桃、孽 蓝、落叶松、窝宦、韭葱、削i、来樣、洋槐、松、铁线藤、玉米、芒果、械树、瓜、泰、磨茹、白芥、 坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、枯、观赏植物或花或树、番木瓜、踪搁、欧芹、欧洲防风草、魏豆、 桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石恼、马铃墓、西葫芦、菊宦、 萝K油菜、息钩子、稻、黑麦、高梁、柳树、玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖萝K甘藏、向日葵、甘 墓、甜玉米、红枯、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、宪青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、 小麦、墓葫、红豆杉和夏南瓜。
[0029] 在另一实施方案中，本发明提供了经分离的核巧酸序列、双链核糖核巧酸序列、细 胞、植物或产品用于处理植物的昆虫侵袭的用途。
[0030] 在另一实施方案中，本发明提供了经分离的核巧酸序列、双链核糖核巧酸序列、细 胞、植物或产品用于处理植物的线虫侵袭的用途。
[0031] 在另一实施方案中，本发明提供了经分离的核巧酸序列、双链核糖核巧酸序列、细 胞、植物或产品用于处理植物的真菌侵袭的用途。

【专利附图】

【附图说明】
[0032] 图I-LD ;马铃墓叶甲在用dsRNA处理过的人工食物上的存活。向第二幼虫期的昆 虫喂饲用50 y 1局部应用的dsRNA (祀或奸P对照）溶液处理过的膳食。膳食在7天后被含 有局部应用dsRNA的新鲜膳食替换。在第2、5、7、8、9和13天评定存活昆虫的数量。计算相 对于第0天（检测开始时）的存活幼虫百分比。祀LD006;(SEQ ID N0:178);祀LD007(SEQ ID N0:183);祀 LD010(SEQ ID N0:188);祀 LDOlUSEQ ID N0:193);祀 LD014(SEQ ID N0:198) ;gfp dsRNA(SEQ ID N0:235)。
[0033] 图2-LD ;马铃墓叶甲在用dsRNA处理过的人工膳食上的存活。向第二幼虫期的 昆虫喂饲用50 y 1局部应用的dsRNA (祀或奸P对照）溶液处理过的膳食。膳食仅在7天 后被新鲜膳食替换。在第2、5、6、7、8、9、12和14天评定存活昆虫的数量。计算相对于第 0天（检测开始时）的存活幼虫百分比。祀LD001;(SEQ ID N0:163);祀LD002(SEQ ID NO: 168) ；|ELD003(SEQ ID NO: 173) ；|ELD015(SEQ ID NO:215) ；|ELD016(SEQ ID NO:220)； gfp dsRNA(SEQ ID N0:235)。
[0034] 图3-LD ;在用dsRNA处理过的马铃墓叶盘上的马铃墓叶甲幼虫平均重量。向第二 幼虫期的昆虫喂饲用20 y 1局部应用的dsRNA (祀LD002或奸P对照）溶液（1化g/ y 1)处 理过的叶盘。2天后，每天都将昆虫转移到未经处理的叶上。
[003引图4-LD ;马铃墓叶甲在用祀LDOHdsRNA的较短形式和多联体dsRNA处理过的人 工膳食上的存活。向第二幼虫期的昆虫喂饲经50 y 1局部应用的dsRNA (g巧或祀）溶液处 理过的膳食。在第3、4、5、6和7天评定存活昆虫的数量。计算相对于第0天（检测开始 时）的存活幼虫百分比。
[0036] 图5-〇);马铃墓叶甲幼虫在用不同浓度的祀0)002(3)、祀0)007化）、祀0)010似、 祀 LDOll (d)、祀 LD014 (e)、祀 LD015 (f)、LD016 (g)和祀 LD027 化）的 dsRNA 处理过的人工膳 食上的存活。向第二幼虫期的昆虫喂饲经50 y 1局部应用的dsRNA溶液处理过的膳食。膳 食在7天后被含有局部应用dsRNA的新鲜膳食替换。W常规间隔评定存活昆虫的数量。计 算相对于第0天（检测开始时）的存活幼虫百分比。
[0037] 图6-LD ;表达dsRNA祀LDOlO的大肠杆菌化coli)菌株对马铃墓甲虫--马铃 墓叶甲幼虫存活随时间的影响。在单独的基于人工膳食的生物测定中，对两种细菌菌株进 行了测试；（a)AB309-105 ;针对PGBNJ003和pGN29的数据点代表了来自5个不同细菌克隆 的平均死亡率的值，化)化2UDE3);针对PGBNJ003和PGN29的数据点代表了分别来自5个 不同和1个单细菌克隆的平均死亡率的值。误差条代表标准差。
[003引 图7-LD ;侵袭后12天，大肠杆菌菌株的不同克隆（a)AB309-105和化）表达dsRNA 祀LDOlO的化21 (DE3)对马铃墓甲虫--马铃墓叶甲幼虫存活的影响。数据点是针对pGN29 和PGBNJ003而言每个克隆的平均死亡率的值。携带有质粒PGBNJ003的AB309-105的克隆 1在该时间点显示出针对CPB的100%死亡率。误差条代表标准差。
[003引 图8-LD ;侵袭后7天，大肠杆菌菌株的不同克隆（a)AB309-105和化）表达dsRNA 祀LDOlO的化21 (DE3)对马铃墓甲虫--马铃墓叶甲幼虫存活者的生长和发育的影响。数 据点是基于表10的数据针对每个克隆（对于PGN29而言1个克隆，对于PGBNJ003而言5 个克隆）的％平均幼虫重量值。仅给予膳食的处理代表100%正常的幼虫重量。
[0040] 图9-LD ;在侵袭后7天用产生双链RNA的细菌喷雾过的马铃墓植物上，马铃墓甲 虫一马铃墓叶甲幼虫的存活。对幼虫存活者的数量加W计数，表示为％死亡率的形式。所 用的细菌宿主菌株是RNaseIII-缺陷型菌株AB309-105。昆虫基因祀是LD010。
[0041] 图IO-LD ;在侵袭后11天用产生dsRNA的细菌喷雾的马铃墓植物上喂饲的马铃墓 甲虫一马铃墓叶甲幼虫存活者的生长/发育延迟。所用的细菌宿主菌株是RNaseIII-缺 陷型菌株AB309-105。数据图表示为正常幼虫重量的百分比；仅给予膳食的处理被视为正 常幼虫重量的100%。昆虫基因祀是LD010。误差条代表标准差。
[004引图Il-LD ;在侵袭后7天通过产生双链RNA的细菌导致的、对马铃墓甲虫--马铃 墓叶甲幼虫引起的马铃墓损伤的抗性。左边是用7个单位的含PGN29质粒的细菌AB309-105 喷雾的植物；右边是用7个单位的含PGBNJ003质粒的细菌AB309-105喷雾的植物。一个单 位被定义为在600nm处OD值为1的Iml细菌息浮液的等同物。昆虫基因祀是LD010。
[0043] 图12-LD ;在用dsRNA处理过的马铃墓叶盘上马铃墓叶甲成虫的存活。最初两天 用双链RNA处理过的叶盘来喂饲年轻的昆虫成虫，之后将它们放在未经处理的马铃墓叶子 上。常规评定存活昆虫的数量；活着并且看起来正常移动的昆虫被记为可移动的昆虫；活 着但是看起来病态并且移动缓慢的昆虫被记为瀬死的昆虫一该些昆虫一旦被背朝下放 置无法自己翻过身来。祀LD002(SEQ ID N0:168);祀LD010(SEQ ID N0:188);祀LD014(SEQ ID N0:198);祀 LD016(SEQ ID N0:220) ;gfp dsRNA(SEQ ID N0:235)。
[0044] 图13-LD ;产生祀双链RNA的细菌对马铃墓叶甲幼虫的影响。将50 ylOD为I的 经热处理细菌（表达dsRNA (SEQ ID NO:188))的息浮液局部应用到48孔板每个孔中的固 体人工膳食上。将L2期的(PB幼虫放置于每个孔中。在第7天，对于含有下述物质的板中 的CPB幼虫取图，其中含有（a)含有表达祀10双链RNA的细菌的膳食，化）具有携带有空 载体PGN29的细菌的膳食W及（C)仅膳食。
[0045] 图14-LD;在昆虫侵袭之前，局部应用到马铃墓叶上的不同量的灭活大肠杆菌 AB309-105菌株（携带质粒PGBNJ003)对于(PB幼虫存活和生长的影响。向10只Ll幼虫喂 饲经处理的马铃墓，喂饲7天。喷雾到植物上的细菌息浮液的量为；0. 2抓、0. 08U、0. 025U、 0. 008U的祀10 W及0. 25U的pGN29 (阴性对照，还包括Milli-Q水）。一个单位（U)被定 义为；与在600nm光密度值为1的Iml培养物中存在的细菌等同的量。喷雾到每株植物上 的总体积为1. 6ml。昆虫基因祀是LD010。
[0046] 图15-LD ;侵袭后7天，携带质粒PGBNJ003的灭活大肠杆菌AB309-105菌株导致 的CPB幼虫对马铃墓损伤的抗性。（a)水，化)0. 2抓携带PGN29的大肠杆菌AB309-105， (C)O. 02抓携带PGBNJ003的大肠杆菌AB309-105，（d)0. 008U携带PGBNJ003的大肠杆菌 AB309-105。一个单位扣）被定义为；与在600nm光密度值为1的Iml培养物中存在的细菌 等同的量。喷雾到每株植物上的总体积为1.6ml。昆虫基因祀是LD010。
[0047] 图I-PC ;摄入的碑IdsRNA对辣根猿叶甲幼虫存活和生长的影响。向新生（neonate) 幼虫喂饲用25 y 1局部应用的0. 1 y g/ y 1 dsRNA (祀或奸P对照）溶液处理过油菜叶盘。 2天后，将昆虫转移到新鲜的用dsRNA处理过的叶盘上。第4天，针对每种处理收集来自一 份重复的幼虫，将其放进含有新鲜的未经处理的油菜叶子的Petri培养皿中。在第2、4、7、 9和11天，对昆虫加W评定。（a)墨西哥豆瓢虫幼虫在用dsRNA处理过的油菜叶盘上的存 活。计算相对于第0天（检测开始时）的存活幼虫百分比。化）在用dsRNA处理过的油菜 叶盘上辣根猿叶甲幼虫的平均重量。将来自每份重复实验的昆虫一起称重，确定每只幼虫 的平均重量。误差条代表标准差。祀1 =SEQ ID NO: 473 ;祀3 ;SEQ ID NO: 478 ;祀5 ;SEQ ID N0:483 ;祀 10 ;SEQ ID N0:488 ;祀 14 ;SEQ ID N0:493 ;祀 16 ;沈Q ID N0:498 ;祀27 ;SEQ ID NO:503 ;gfP dsRNA;SEQ ID NO:235。
[004引 图2-PC ;在用不同浓度的（a)祀PCOlO和（b)祀PC027的dsRNA处理过的油菜叶 盘上辣根猿叶甲的存活。将新生幼虫放到用25 y 1局部应用的dsRNA溶液处理过的叶盘上。 在第2天将昆虫转移到新鲜的经处理叶盘上。对祀PCOlO而言在第4天，对祀PC027而言 在第5天，将昆虫转移到未经处理的叶上。针对PCOlO在第2、4、7、8、9和11天，针对PC027 在第2、5、8、9和12天，评定存活昆虫的数量。计算相对于第0天（检测开始时）的存活幼 虫百分比。
[0049] 图3-PC ;表达dsRNA祀PCOlO的大肠杆菌菌株AB309-105对白芥叶甲虫--辣根 猿叶甲幼虫存活随时间的影响。针对每种处理的数据点代表来自3份不同重复的平均死亡 率的值。误差条代表标准差。祀10 =SEQ ID N0:488。
[0050] 图I-EV ;墨西哥豆瓢虫幼虫在用dsR化处理过的豆叶盘上的存活。向新生幼虫喂 饲用25 y 1局部应用的1 y g/ y 1 dsRNA (祀或奸P对照）溶液处理过的豆叶盘。2天后，将 昆虫转移到新鲜的用dsRNA处理过的叶盘上。第4天，收集来自一种处理的幼虫，将其放进 含有新鲜的未经处理的豆叶的塑料盒中。在第2、4、6、8和10天，对昆虫的死亡率加W评定。 计算相对于第0天（检测开始时）的存活幼虫百分比。祀5 =SEQ ID NO:576 ;祀10 =SEQ ID N0:586 ;祀 15 ;SEQ ID N0:591 ;祀 16 ;SEQ ID N0:596 ;gfp ds RNA ;SEQ ID N0:235。
[0051] 图2-EV ;摄入的祀dsRNA对于墨西哥豆瓢虫成虫存活W及对食芙菜豆叶的昆虫损 伤的抗性的影响。（a)墨西哥豆瓢虫成虫在用dsRNA处理过的豆叶上的存活。向成虫喂饲 用75 ill局部应用的0. 1 y g/ ill dsRNA (祀或奸P对照）溶液处理过的豆叶盘。24小时 后，将昆虫转移到新鲜的用dsRNA处理过的叶盘上。再24小时后，收集来自一种处理的成 虫，将其放进含有盆栽的新鲜未经处理整株豆植株的塑料盒里。在第4、5、6、7、8和11天 评定昆虫的死亡率。计算相对于第0天（检测开始时）的存活成虫百分比。祀10 =SEQ ID N0:586 ;祀 15 ;SEQ ID N0:591 ;祀 16 ;SEQ ID N0:596 ;gfp ds RNA ;SEQ ID N0:235。化） 通过dsRNA导致的对墨西哥豆瓢虫成虫引起的豆叶损伤的抗性。在第9天，针对叶的损伤 对含有来自一种处理（见（a))的昆虫的整株植物进行目视检查。（i)祀10 ;(ii)祀15; (iii)祀 16 ; (iv)gfp dsRNA ; (V)未经处理的。
[0052] 图I-TC ;赤拟谷盗幼虫在用祀14的dsRNA处理过的人工膳食上的存活。向新生 幼虫喂饲含有Img dsRNA祀14的基于面粉/奶混合物的膳食。对照是膳食中的水（没有 dsRNA)。针对每种处理采用四份重复，每份重复为10只第一龄虫。在第6、17、31、45和60 天，评定昆虫的存活（作为平均百分比值）。计算相对于第0天（检测开始时）的存活幼虫 百分比。误差条代表标准差。祀TC014;SEQ ID N0:878。
[005引图I-MP ;摄入的祀27dsRNA对于桃闽蛹的存活的影响。将第一龄虫放进喂饲室中， 其中含有50 y 1具2 y g/ y 1 dsRNA (祀27或奸P dsRNA对照）的液体膳食。对每种处理 而言，使用5个喂饲室，每个喂饲室中10只龄虫。在生物测定开始后8天评定存活者的数 量。误差条代表标准差。祀 MP027;SEQ ID N0:1061;gfp ds RNA;SEQ ID N0:235。
[0054] 图I-NL ;褐飞風在用dsRNA处理过的液体人工膳食上的存活。在分别的生物测定 中，向第一至第二幼虫期的蛹喂饲补充有2mg/ml dsRNA祀溶液的膳食；(a)化002、化003、 化005、化010 ;化）化009、化016 ;(。）化014、化018 ;(屯化013、化015、化021。将昆虫在祀上 的存活与仅用膳食W及用含有同样浓度的奸P dsRNA对照的膳食时的情况相比。膳食每两 天被含有dsRNA的新鲜膳食替换。每天评定存活昆虫的数量。
[00巧]图2-NL;褐飞風在用不同浓度的祀dsRNA化002处理的液体人工膳食上的存活。 向第一至第二幼虫期的蛹喂饲补充有1、〇. 2、0. 08和0. 04mg/ml (最终浓度）化002的膳食。 膳食每两天被含有dsRNA的新鲜膳食替换。每天评定存活昆虫的数量。
[0056] 发明详沐
[0057] 本发明提供了控制有害生物侵袭的手段，该是通过向有害生物施用祀编码序列来 实现的，所述序列能对有害生物中必要的生物学功能造成转录后阻遏或抑制。在一个方面， 本发明包括向有害生物喂饲一种或多种转录自祀编码序列的全部或一部分的、双链或小干 扰核糖核酸（RNA)分子，所述祀编码序列对于有害生物的给养和存活来说是重要的。因此， 本发明涉及使用双链RNA (dsRNA)，包括小干扰RNA(SiRNA)对编码序列进行序列特异性抑 巧||，用作为有害生物控制的手段。
[0058] 直到现在，在大多数有害生物物种的膳食中提供dsRNA分子也还是不切实际的， 因为RNA分子易于被环境中的核酸酶降解，其被认为在温和碱性或酸性环境（例如，在大多 数无脊椎有害生物消化道中发现的环境）中不稳定。因此，为了控制有害生物侵袭或引入 新的表型性状的目的，人们需要通过阻遏、延迟或降低特定有害生物中的基因表达来调节 基因表达的改进的方法。
[0059] 发明人在此鉴定出了控制有害生物侵袭的方法，所述方法通过在所述有害生物的 膳食中提供dsRNA分子来实现。dsRNA的序列对应于重要的有害生物基因的部分或全部， 其引起了通过RNA干扰（RNAi)对有害生物祀的下调。作为对mRNA下调的结果，dsRNA防 止了祀有害生物蛋白质的表达，进而产生（包括但不限于）下述性质中的一种或多种；有害 生物进食减少；有害生物生存能力降低；有害生物死亡；对有害生物分化和发育的抑制；有 害生物的有性繁殖，肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素调节，离子调节和转运，细胞膜电位 保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素感知，触角形成，翅膀形 成，腿形成、发育和分化，卵形成，幼虫成熟，消化酶形成，血淋己合成，血淋己保持，神经传 递，细胞分裂，能量代谢，呼吸，调亡W及真核细胞细胞骨架结构的任何组分（例如，肌动蛋 白和微管蛋白）能力的消失或降低。该些性质中的任何一种或任何组合能导致对有害生物 侵袭的有效抑制，在植物有害生物的情况下，导致对植物侵袭的抑制。
[0060] 本申请文件中使用的所有技术术语是通常用于生物化学、分子生物学和农学领 域中的，因此，它们是本发明所属领域的技术人员所理解的。该些技术术语可在，例如 MOLECULAR 化0肌NG:A LABORATORY MANUAL 第3版，卷 I-3,编著，Sambrook和Russel, Cold Spring Harbor L油oratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,编著 Ausubel 等人，Greene Publishing Associates and 111巧-11116'3。1611。6，爬￥化'1^，1988(及定期更新）、5册^?1?01'0〇)1^5^]\?)1^6(：化八1? BIOLOGY:A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 第 5 版，卷 1-2,编著 Ausubel 等人，John Wil巧&Sons, Inc.，2002、GENOME ANALYSIS:A LABORATORY MANUAL 卷 1-2,编著 Green 等人，Cold Spring Harbor L油oratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1997 中找到。
[0061] 本文描述了涉及植物生物学技术的方法，其还在例如下述论文中被详细描述： MET册DS IN PLANT MOL抓LAR BIOLOGY = A LABORATORY COURSE MANUAL 编辑 Maliga 等 人,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1995。 使 用PCR的多种技术被描述于，例如，Innis等人，PCR PR0T0C0LS:A GUIDE TO MET册DS AND AP化ICATIONS, Academic Press,San Diego, 1990 和 Dieffenbach 和 Dveksler, PCR PRIMER:A LABORATORY MANUAL 第 2版，Cold Spring 化rbor L油oratory Press，Cold Spring Harbor, N. Y.，2003中。可通过已知技术从已知序列获得PCR-引物对，所述 技术例如使用用于该目的的计算机程序，例如Primer,版本0. 5, 1991，Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Md 用于核酸化学合成的方法在例 如 Beaucage&Caruthers, Tetra. Letts. 22:1859-62(1981)和 Matteucci&化ruthers,J. Am. Qiem.Soc. 103:3185(1981)中讨论过。
[0062] 限制性酶消化、磯酸化、连接和转化按照Sambrook等人，MOLECULAR化0NING:A LABORATORY MANUAL 第 2 版（1989) ,Cold Spring 化 rbor L油 oratory Press 所述来 进行。如无其它指明，用于细菌细胞生长和保持的所有试剂和材料都从阿尔德里克化 学公司（Al 化ich Qiemicals) (Milwaukee, Wis. )、DIFCO 实验室值IFCO L 油 oratories) 值etroit, Mich.)、英杰生命科学公司（Invitrogen) (Gaithersburg, Md.)或西格玛化学公 司(Sigma Chemical Company) (St. Louis, Mo.)获得。
[0063] 农杆甫（Agrobacterium)或细甫转化：化本领域公知的，巧于转化枯物细胸的 农杆菌是通常根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)、发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes)的卸甲（disarmed)和有毒利（virulent)衍生物，其含有载体。通常，载体 含有位于T-DNA边界之间的想要的多核巧酸。但是，能转化植物细胞的任何细菌都可使 用，例如H叶草根瘤菌（Miizobium trifolii)、魏豆根瘤菌（Miizobium Ieguminosarum)、 Phyllobacterium myrsinacearum、首荐中华根瘤菌（SinoMiizobium meliloti)和百脉根 中慢生根瘤菌（MesoMiizobium loti)。
[0064] 被子枯物；在子房中含有种子的维管枯物。被子植物是产生能结果的花的种子植 物。被子植物被分为双子叶植物和单子叶植物。
[0065] 生物堂活性指蛋白质或肤的生物学行为和影响及其对有害生物的表现。例如，本 发明的RNAi可防止特定mRNA的翻译，由此抑制所述mRNA编码的蛋白质的生物学活性或者 有害生物的其它生物学活性。
[0066] 在本说明书中，RNAi分子可抑制有害生物中的生物学活性，产生（包括但不限于） 下述性质中的一种或多种：有害生物进食减少；有害生物生存能力降低；有害生物死亡；对 有害生物分化和发育的抑制；有害生物的有性繁殖，肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素调 节，离子调节和转运，细胞膜电位保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合 成，信息素感知，触角形成，翅膀形成，腿形成、发育和分化，卵形成，幼虫成熟，消化酶形成， 血淋己合成，血淋己保持，神经传递，细胞分裂，能量代谢，呼吸，调亡W及真核细胞细胞骨 架结构的任何组分（例如，肌动蛋白和微管蛋白）能力的消失或降低。
[0067] 商品产品包括从植物制备或源自植物的任何产品，其包括但不限于;食品、饲料、 纤维、纸、餐食、蛋白质、淀粉、面粉、青胆饲料、咖啡、茶和油。
[0068] 互补DNA(CDNA)指从成熟的mRNA模板合成的单链DNA。虽然有若干种方法，但是 最通常是使用逆转录酶该种酶从成熟（经完全剪接的）mRNA来合成cDNA。该酶在mRNA的 单链上进行操作，基于RNA碱基对（A、U、G、C)与其DNA互补体（T、A、C、G)的配对产生所述 mRNA的互补DNA。两条核酸链的碱基中有至少85%配对时，该两条链就是充分巧补的。
[0069] 想要的《核昔酸：本发明的想要的多核昔酸是遗传元件，例如启动子、增强子或 终止子，或将在其基因组中包含想要的多核巧酸的经转化细胞中转录和/或翻译的基因或 多核巧酸。如果想要的多核巧酸包含编码蛋白质产物的序列，编码区域可与调控元件（例 女口，启动子和终止子）有效地连接，所述调控元件能使得相关联的信使RNA转录本和/或想 要的多核巧酸编码的蛋白质产物表达。因此，"想要的多核巧酸"可包含该样的基因：其W 5' -至3' -方向有效地连接启动子、编码蛋白质的基因和终止子。或者，想要的多核巧酸可 包含"正义"和/或"反义"方向的基因或其片段，其转录产生可能影响到植物细胞中内源基 因表达的核酸。想要的多核巧酸还可基于转录产生双链RNA产物，在此基础上起始对所述 想要的多核巧酸相关联的基因的RNA干扰。本发明的想要的多核巧酸可被放置于载体中， 使得左右边界序列侧翼连接于想要的多核巧酸或在其任何一侧。本发明设想将一种或多种 想要的多核巧酸稳定整合进至少一种宿主细胞的基因组。想要的多核巧酸可经突变或者是 其野生型序列的变体。应当理解，想要的多核巧酸的全部或部分可整合进宿主的基因组。还 应当理解，术语"想要的多核巧酸"包括一种或多种此类多核巧酸。因此，本发明的载体可 包含一种、两种、H种、四种、五种、六种、走种、八种、九种、十种或更多种想要的多核巧酸。
[0070] 双子叶枯物（dicotyledonous plant,英文中也称dicot)是开花植物，其胚具有 两个种子半边部分或者两片子叶，分支叶脉，花的各部分为4或5的倍数。双子叶植物的 实例包括但不限于；按属巧ucalyp化S)、杨属（Populus)、枫香属（Liquidamber)、金合欢属 (Acacia)、抽木、桃花也木、棉花、烟草、拟南芥属（Ar油idopsis)、番茄、马铃墓、糖萝h、挪 菜、木墓、甘墓、胡椒、猩猩木、菜豆、首荐、大豆、胡萝K草霉、窝宦、橡树、械树、核桃、醫薇、 薄荷、南瓜、维菊、老鹤草、鳄梨和仙人掌。
[0071] 在提到核酸时，外源表示核酸源自非宿主生物。根据本发明，外源DNA或RNA表示 天然存在于真菌、细菌、病毒、哺乳动物、鱼或鸟的遗传构成中但是在待转化的宿主中并非 天然存在的核酸。因此，外源核酸是该样的核酸，其编码例如经转化宿主并不天然产生的多 肤。外源核酸不一定编码蛋白质产物。
[0072] 本文中使用的直菌或真菌细胞指属于真菌界的生物中存在的或源自所述生物的 任何细胞。本发明的方法可应用于下述所有真菌和真菌细胞，它们对于RNA干扰导致的基 因沉默来说是易感（SUSC邱t化Ie)的，并且能使得双链RNA从它们的直接环境被内在化。
[0073] 在本发明的一种实施方案中，真菌可W是霉菌，或者更特别地，丝状真菌。在本发 明的其它一些实施方案中，真菌可W是酵母。
[0074] 在一种实施方案中，真菌可W是子囊菌真菌，gp，属于子囊菌（Ascomycota) 口的 真菌。
[007引在本发明的优选但非限制性的实施方案和方法中，真菌细胞选自：
[0076]植物病原性真菌的真菌细胞或源自植物病原性真菌的细胞，其例如但不限于：小 枝顶抱属物种（Acremoniella spp.)、异水霉属物种（Allomyces spp.)、链格抱属物种 (Alternaria spp.)(例如芸苔生链格抱（Alternaria brassicola)或索兰尼（氏）链格 抱（Alternaria solani))、暗膜菌属物种（Amoi^pho化ec spp.)、壳二抱属物种（Ascochyta spp.)(例如魏豆壳二抱（Ascochyta pisi))、曲霉属物种（Aspergillius spp.)、短梗霉 属物种（Aureobasidium spp.)、小芽枝霉属物种化Iastocladiella spp.)、葡萄抱属物 种化Otiytis spp.)(例如灰葡萄抱化Otiytis cinerea)或富克葡萄抱化otiyotinia fuckeliana))、假丝酵母属物种（Candida spp.)、枝抱属物种（Cladosporium spp.)、尾 抱属物种（Cercospora spp.)(例如菊池尾抱（Cercospora kikuchii)或 Cercospora zaea-maydis)、毛壳属物种（Qiaetomium spp.)、枝抱属物种（Cladosporium spp.)(例 如黄枝抱（Cladosporium fulvum))、刺盘抱属物种（Colletotrichum spp.)(例如豆刺 盘抱（Colletotrichum Iindemu化ianum))、球抱子菌属物种（Coccidioides spp.)、耳霉 属物种（Conidiobolus spp.)、鬼伞菌属物种（Coprinopsis spp.)、Coiynascus spp.、 栗疫属物种（化yphonectria spp.)、隐球酵母属物种（Cryptococcus spp.)、小克银汉 霉属物种（Cunnin組amelia spp.)、弯抱属物种（Curvularia spp.)、德己利酵母属物 种化ebarymyces spp.)、色二抱属物种化iplo化a spp.)(例如玉米色二抱化iplo化a maydis))、裸胞壳属物种（Emericella ssp.)、脑炎微抱子虫属瓜IC邱halitozoon spp.)、 假囊酵母属物种巧1'61110化6(3；[111113口口.）、白粉菌属物种巧巧31口116 3口口.）（例如目巧31口116 graminis f. sp. grami打is、大麦白粉菌（Erysiphe graminis f. sp. hordei)或良宛丑白粉 菌巧 iysiphe pisi))、Erwinia armylovora、镶抱属物种（F'usarium spp.)(例如雪腐镶 抱（Fusarium nivale)、拟分支抱镶抱（Fusarium sporotrichioides)、尖镶抱（Fusarium oxysporum)、禾本科窄廉抱（Fusarium graminearum)、Fusarium germinearum、大刀窄廉抱 (Fusarium culmorum)、腐皮镶抱（Fusarium solani)、串珠镶抱（Fusarium moniIiforme) 或粉红镶抱（F'usarium roseum))、顶囊壳属物种（Gaeumanomyces spp.)(例如小麦禾顶囊 壳（Gaeumanomyces graminis f. sp. tritici))、Geomyces spp.、赤霉属物种（Gibberella spp.)(例如玉蜀泰赤霉（GiLbberella zeae))、粘禪菌属物种（Gloeoph^dlum spp.)、球囊霉 属物种（Glomus spp.)、长蠕抱属物种（Helminthosporium spp.)(例如 Helmin^osporium turcicum、炭色长蠕抱（Helminthosporium carbonum)、玉蜀泰长蠕抱（Helminthosporium mavdis)或水稻小球菌棱病菌（Helmin化osporium sigmoideum))、肉座菌属物种（Hypocrea spp.)、克鲁维酵母属物种OUuyveromyces spp.)、香茹属物种（Xentinula spp.)、稻小球 腔菌化邱tosphaeria salvinii)、白冬抱酵母属物种（Xeucosporidium spp.)、壳球抱属 物种（Macrophomina spp.)(例如莱丑壳球抱（Macrophomina phaseolina))、Magnapo:rtha spp.(例如稻磕病菌（Magnaporthe OTyzae))、Me化arhizium spp.、毛霉属物种（Mucor spp.)、球腔菌属物种（Mycosphaerella spp.)、脉抱菌属物种（Neurospora spp.)、从赤壳 属物种（Nectria spp.)(例如 Nectria heamatococca)、长嗦壳属物种（Ophiostoma spp.)、 Paracocidioides spp、霜霉属物种巧 eronospora spp.)(例如东北霜霉巧 eronospora manshurica)或烟草霜霉巧eronospora tabacina))、茎点霉属物种巧homa spp.)(例如 泰莱茎点霉（J^homa betae))、Phaeopsheria spp?、平革菌属物种卿ianerochaete spp.)、 层诱菌属物种脚iakopsora spp.)(例如豆墓层诱菌脚iakopsora pachyrhizi))、瘤梗 抱属物种脚iymatotrichum spp.)(例如多主瘤梗抱脚iymatotrichum omnivorum))、 疫霉属物种脚iytoph化ora spp.)(例如棒疫霉脚iytoph化ora cinnamomi)、恶疫霉 (Phytophthora cactorum) (Phytophthora phaseoli) ^(Phytophthora parasitica)、巧枯褐腐疫霉（Phytophthora citrophthora)、Phytophthora megasperma f. sp. soiae 或致病疫霉卿iytoph化ora infestans))、单轴霉属物种巧Iasmopara spp.) (例如葡萄生单轴霉巧Iasmopara viticola))、肺抱子属物种巧neumocystis spp.)、叉丝 单囊壳属物种巧odosphaera spp.)(例如白叉丝单囊壳巧odosphaera leucotricha))、 柄诱菌属物种（；Puccinia spp.)(例如高梁柄诱菌（；Puccinia sor組i)、条形柄诱菌 (Puccinia striiformis)、小麦禾柄诱菌（Puccinia graminis f. sp. tritici)、天 口 冬属柄诱菌巧uccinia asparagi)、隐匿柄诱菌巧uccinia recondita)或落花生柄 诱菌巧uccinia arachidis))、腐霉属物种巧ythium spp.)(例如瓜果腐霉巧ythium aphanidermatum))、火丝菌属物种巧yronema spp.)、棱腔菌属物种巧yrenophora spp.) (例如偃麦草棱腔菌巧yrenophora tritici-r邱entens)或圆棱腔菌巧yrenophora teres))、梨抱属物种巧 yricularia spp.)(例如稻梨抱巧 yricularia oryzae))、腐霉 属物种巧^hium spp.)(例如终极腐霉巧^hium ultimum))、Rhincosporium secalis、 丝棱菌属物种（Rhizoctoniaspp?)(例如立枯丝棱菌（Rhizoctoniasolani)、稻枯斑 丝棱菌（Rhizoctonia OTyzae)或禾谷丝棱菌（Rhizoctonia cerealis))、根霉属物种 (Rhizopus spp.)(例如华根霉（Rhizopus chinensid))、酵母属物种（Saccharomyces spp. )、Scerotium spp.(例如 Scerotium rolfsii)、棱盘菌属物种（Sclerotinia spp.) (例如棱盘菌（Sclerotinia sclerotiorum))、壳针抱属物种（S邱toria spp.)(例如 番茄壳针抱（Septoria lycopersici)、大豆壳针抱（Septoria glycines)、颖枯壳针抱 (Septoria nodorum)或小麦壳针抱（Septoria tritici))、Spizellomyces spp.、嗜热真 菌属物种（Thermomyces spp.)、根串珠霉属物种（Thielaviopsis spp.)(例如根串珠霉 (Tliielaviopsis basicola))、腥黑粉菌属物种（Tilletia spp.)、栓菌属物种 ^rametes spp.)、木霉属物种（T'richoderma spp.)(例如绿色木霉（Trichoderma virde))、发癖 菌属物种（Trichophyton spp.)、钩丝壳属物种（Uncinula spp.)(例如葡萄钩丝壳 (Uncinula necator))、玉蜀泰黑粉菌（Ustilago maydis)(例如玉蜀泰黑粉病）、黑星菌属 物种（Ven化ria spp.)(例如苹果黑星菌（Ven化ria inaequalis)或梨黑星菌（Ven化ria pirina))、Yarrwia spp?或轮枝抱属物种（Verticillium spp.)(例如大丽花轮枝抱 (Verticillium dahliae)或黄萎轮枝抱（Verticillium a化o-atrum))。
[0077] 基厦指这样的多棱昔酸序列，其包含对于多献或前体的生产来说必要的控制和编 码序列。多肤可由全长编码序列或编码序列的任何部分所编码。基因可组成连续的编码序 列，或者其可包括通过合适的剪接点结合的一个或多个内含子。此外，基因可在编码或非翻 译区域含有一种或多种修饰，该可能会影响到表达产物的生物学活性或化学结构、表达速 率或表达控制方式。此类修饰包括但不限于；一个或多个核巧酸的突变、插入、缺失和取代。 在该方面，此类经修饰的基因可被称为"天然"基因的"变体"。
[0078] 遗传元件是任何重要的(discreet)核巧酸序列，其例如但不限于，启动子、基因、 终止子、内含子、增强子、间隔区、5' -非翻译区域、3' -非翻译区域或重组酶识别位点。
[0079] 遗传修饰指;通过应用分子生物学和细胞生物学的方法，将DNA稳定引入某些生 物的基因组。
[0080] "基因遏巧r或"对基因表达的下调"或"对基因表达的抑巧r可互换使化其指庙 来自祀基因的蛋白质产物和/或mRNA产物的水平上可测量的或可观察到的基因表达的降 低，或可探测到的基因表达的完全消失。当祀基因的下调或抑制发生但对有害生物的其它 基因没有明显影响的时候，对基因表达的下调或抑制是"特异性的"。
[0081] 根据祀基因的性质，可通过使用分子技术，例如，RNA溶液杂交、核酸酶保护、 Nodhern杂交、逆转录、微阵列基因表达监测、抗体结合、酶联免疫吸附测定巧LISA)、 Western印迹、放射性免疫测定巧IA)、其它免疫测定或英光活化细胞分析（FAC巧测量mRNA 或蛋白质表达，或通过对细胞或整个有害生物进行表型分析，来验证对有害生物细胞中基 因表达的下调或抑制。
[0082] 在本文中使用时，裸子植物指产生种子但没有子房的种子植物。裸子植物的实例 包括针叶树、苏铁、银杏和麻黄。
[0083] 在本文中使用时，同源性涉及序列；如果蛋白质或核巧酸序列显示出"显著"水平 的序列相似性或更优选地序列同一性，那么所述蛋白或核酸序列就可能是同源的。真正同 源的序列通过来自共同祖先基因的趋异相关联。序列同源物可W是两种类型的；（i)同源 物存在于不同物种中时，它们被认为是直向同源物，例如，在小鼠和人中的a-珠蛋白基因 是直向同源物；（ii)旁系同源物（paralogue)是在单种物种中的同源基因，例如，小鼠中的 a-珠蛋白和目-珠蛋白基因是旁系同源物。
[0084] 宿主细胞指该样的微生物、原核细胞、真核细胞或作为单细胞实体培养的细胞系， 其可W或已经用作为重组载体或其它多核巧酸传递的受体，包括已被转染的原始细胞的子 代。由于天然的、偶然的或刻意的突变，单个细胞的子代在形态，或基因组DNA或总DNA互 补的方面并不一定与原始亲本完全相同。
[0085] 在本文中使用时，昆虫可W是任何昆虫，该表示属于动物界的任何生物，更具 体地，属于节肢动物口（Arthropoda)任何生物、W及属于昆虫纲（Insecta)或蛛形纲 (Arachnida)的任何生物。本发明的方法可应用于所有昆虫，所述昆虫对于RNA干扰导致的 基因沉默来说是易感的，并且能使得双链RNA从它们的直接环境被内在化。
[0086] 在本发明的一种实施方案中，昆虫可W属于下述的目：峨目（Acari)、蜘蛛 目（Araneae)、風目（Anoplura)、銷翅目（Coleoptera)、弹尾目（Collembola)、革翅目 (Dermaptera)、网翅目值ictyoptera)、双尾目值iplura)、双翅目值iptera)、纺足目 (Embioptera)、蜂雌目巧地emeroptera)、型嘘目（G巧Iloblatodea)、半翅目化emiptera)、 同翅目化omoptera)、膜翅目（Hymenoptera)、等翅目（Isoptera)、鱗翅目（Lepidoptera)、 食毛目（Mallophaga)、长翅目（Mecoptera)、脉翅目（Neuroptera)、蛹艇目（Odonata)、直翅 目（Orthoptera)、竹节虫目（F*hasmida)、橫翅目（Plecoptera)、原尾目（Pro1:ura)、晒虫目 (Psocoptera)、圣目（Si地onaptera)、風目（Si地unculata)、t婴尾目（Hiysanura)、抢翅目 (Strepsiptera)、製翅目（Hiysanoptera)、毛翅目（Trichoptera)和缺翅目狂oraptera)。 [0087] 在本发明的优选但非限制性的实施方案和方法中，昆虫选自是植物有害生物 的昆虫，其例如但不限于；褐飞Il属物种（Nilaparvata spp.)(例如褐飞風（N. Lugens) (褐稻風））；灰飞風属物种（Laodelphax spp.)(例如灰飞風（L. Striatellus)(灰飞 風））；黑尾叶蜡属物种（Nephotettix spp.)(例如二点黑尾叶蜡（N. Virescens)或黑 尾叶蜡（N. Cincticeps)(青叶蜡）或二条黑尾叶蜡（N. nigropicUis)(稻叶蜡））；白背 飞風属物种（Sogatella spp.)(例如白背飞風（^SJurcifera)(白背飞風））；杆长赔属 物种炬Iissus spp.)(例如美洲谷杆长赔炬.Ieucopterus Ieucopterus)(美洲谷杆 长赔））；黑赔属物种（Scotino地ora spp.)(例如S. vermidulate (稻黑赔））；绿赔属 物种（Acrosternum spp.)(例如拟绿赔A. hi Iare (拟绿赔））；稻弄蝶属物种（Parnara spp.)(例如直纹稻弄蝶化Guttata)(直纹稻弄蝶））；禾草頓属物种（化ilo spp.) (例如二化頓（C. Suppressalis)(稻二化頓（rice striped stem borer))、台湾稻 頓（C. Aurici I ius)(金线二化頓（gold-fringed stem borer))或 C.polychiTsus (黑 头二化頓（dark-headed stem bored))) ;Qiilotraea spp.(例如 C.polyc虹ysa(水 稻蛙也虫（rice Sta化borer)));蛙茎夜蛾属物种（Sesamia spp.)(例如稻蛙茎夜 蛾（S. Inferens)(大頓））；蛙禾頓属物种（TiTpoiTza spp.)(例如 T. innotata (白稻 H化頓（white rice borer))或H化頓（T. IncertulasH H化頓））；纵卷叶野頓属 物种（Giaphalocrocis spp.)(例如稻纵卷叶野頓（C. MedinalisH稻纵卷叶野頓））； 潜虫电属物种（Agromyza spp.)(例如日本稻潜禍（A. Oryzae)(日本稻潜禍）或美洲泰 潜叶禍（A. Parvicornis)(潜叶禍））；杆草頓属物种值iatraea spp.)(例如小藏頓 值.Saccharalis)(小藏頓）或西南玉米杆草頓化Grandiosella)(玉米杆草頓））；頓岭 夜蛾属物种（Narnaga spp.)(例如N. aenescens(稻頓岭））；黄夜蛾属物种狂anthodes spp.)(例如舉纹黄夜蛾化Transversa)(舉纹黄夜蛾））；灰翅夜蛾属物种（Spodoptera spp.)(例如草地贪夜蛾化化Ugiperda)(秋天行军虫）、甜菜夜蛾（S. Exigua)(甜菜夜 蛾）、灰翅夜蛾仅Littoralis)(月斑虎甲（climbing州tworm))或S.praefica(西部黄 条行军虫（western yellowstriped armyworm)));秘夜蛾属物种（Mythi皿a spp.)(例如 粘虫（Mythmna(Pseudaletia) seperata(行军虫））；铃夜蛾属物种化elicove巧a spp.) (例如谷实夜蛾化.Zea)(棉铃虫（corn earworm)));肖叶甲属物种（Colaspis spp.) (例如C. brunnea(葡萄肖叶甲））；稻水象属物种（Lissorhoptrus spp.)(例如稻水象甲 (L. Oryzophilus)(稻水象甲））；稻象属物种巧chinocnemus spp.)(例如稻象巧.Squamos) (稻象））；Diclodispa spp.(例如D. armigera(稻铁甲））；禾谷负泥虫属物种（Oulema spp.)(例如水稻负泥虫化化yzae)(叶甲）；米象属物种（Sitophilus spp.)(例如米象 (S. Oryzae)(稻象虫））；瘦蚊属物种（Pachydiplosis spp.)(例如稻瘦蚊（？. Oryzae)(稻 瘦蚊））；水禍属物种（Hy化ellia spp.)(例如麦叶毛眼水禍化Griseola)(大麦水禍）或 日稻毛眼水禍化.Sasakii)(稻杆潜禍（rice stem maggot)));黄潜禍属物种（Chlorops spp.)(例如稻黄潜禍（C.化yzae)(杆禍））；杆野頓属物种（Ostrinia spp.)(例如玉米頓 (0. Nubilalis)(欧洲玉米钻也虫））；地虎属（Agrotis spp.)(例如小地老虎（A. ipsilon) (小地老虎））；Elasmopalpus spp.(例如南美玉米苗斑頓化Lignosellus)(小玉米茎蛙 虫（lesser cornstalk borer)));梳爪叩头虫属物种（Melanotus spp.)(金针虫）；圆头犀 金龟属物种（切cloce地ala spp.)(例如C. borealis (北方假面金龟子（northern masked chafer)),或 C.immaculata(南方假面金龟子（^southern masked chafer)));弧咖金龟 属物种（Popillia spp.)(例如日本弧丽金龟（P. Japonica)(日本弧丽金龟））；跳甲属物 种（化aetocnema spp.)(例如玉米铜色跳甲（C. PulicariaH玉米铜色跳甲））；龙颈象属 物种（S地enophorus spp.)(例如玉米长瞭象化Maidis)(玉米长瞭象））；溢管闽属物种 (Miopalosiphum spp.)(例如玉米闽化Maidis)(玉米闽））；圆尾闽属物种（Anuraphis spp.)(例如 A.maidiradicis(玉米根闽（corn root aphid)));黑幢属物种（Melanoplus spp.)(例如红足黑幢（M.化murrubrum)(红足黑幢）、特异黑幢（M. Differentialis)(特 异黑幢）或迁飞黑幢（M. Sanguinipes)(迁飞黑幢））；种禍属物种（Hylemya spp.)(例如 灰地种禍化.Pla化ra)(灰地种禍））；呆葫马属物种（Anaphot虹ips spp.)(例如黄呆葫 马（A. Obscrurus)(黄呆葫马））；火蚁属物种（Solenopsis spp.)(例如窃蚁化Milesta) (盗窃蚁））；或叶峨属物种（Tetranychus spp.)(例如二点叶峨化化ticae)(二点叶 峨）、朱砂叶峨化Cinn油arinus)(朱砂叶峨））；铃夜蛾属物种化elicove巧a spp.)(例 如谷实夜蛾化Zea)(棉铃虫（cotton bollworm)),或棉铃虫化Armigera)(美洲棉铃 虫））；Pectino地ora spp.(例如红铃麦蛾（P. Gossypiella)(棉花红铃虫））；金刚钻 属物种巧arias spp.)(例如翠纹金刚钻巧.Vittella)(翠纹金刚钻））；实夜蛾属物种 化eliothis spp.)(例如烟芽夜蛾化.VirescensH烟青虫））；花象属物种（Anthonomus spp.)(例如墨西哥棉铃象（A. Grandis)(棉子象鼻虫））；Pseudatomoscelis spp.(例如棉 伪斑腿盲赔（P. Seria化s)(棉伪斑腿盲赔））；结翅粉風属物种（Trialeurodes spp.)(例 如结翅粉風化Abutiloneus)(结翅粉風）、温室粉風（T. Vaporariorum)(温室粉風））； 小粉Il属物种炬emisia spp.)(例如银叶粉風化Argentifolii)(银叶粉風））；闽属物 种（Aphis spp.)(例如棉闽（A. Gossypii)(棉闽）、A. mellifera);草盲赔属物种（Lygus spp.)(例如美国牧草盲赔（L. Lineolaris)(美国牧草盲赔）或豆芙草盲赔（L. Hesperus) (西牧草盲赔（western tarnished plant bug)));美洲赔属物种巧uschis1:us spp.) (例如斑点美洲赔巧.conspersus)(斑点美洲赔））；Chloroc虹oa spp.(例如赛氏赔 (C-Sayi)(赛氏赔））；绿赔属物种（Nezara spp.)(例如稻绿赔（N. Viridula)(稻绿赔））； 葫马属物种订虹ips spp.)(例如葱葫马（T. T油aci)(葱葫马（onion trips)));花葫马 属物种（Prankliniella spp.)(例如烟褐葫马化化sea)(烟褐葫马），或西方花葫马 (F. OccidentaliS)(西方花葫马））；马铃墓叶甲属物种（Leptinotarsa spp.)(例如马 铃墓叶甲（LDecemlineata)(马铃墓叶甲）、伪马铃墓叶甲（L.化ncta)(伪马铃墓叶甲） 或L texana(泰克斯伪马铃墓叶甲（Texan false potato beetle)));合爪负泥虫属物 种（Lema spp.)(例如H条负泥虫（L. Trilineata) ( H条负泥虫））；跳甲属物种巧pitrix spp.)(例如马铃墓跳甲化化州meris)(马铃墓跳甲）、烟草跳甲巧.Hirtipennis)(跳 甲）或块茎跳甲巧.Tuberis)(块茎跳甲））；豆完菁属物种巧Picauta spp.)(例如北 美豆完菁巧.Vittata)(北美豆完菁））；绿小叶蜡属物种（Empoasca spp.)(例如蚕豆 小绿叶蜡巧.F油ae)(黑豆闽））；瘤闽属物种（Myzus spp.)(例如桃闽（M. Persicae) (桃财））；墓个木動属物种（^aratrioza spp.)(例如马铃墓木動巧.Cockerelli)(木 動））；单叶叩甲属物种（Conoderus spp.)(例如C.falli (南方马铃墓铁线虫（soui'thern potato wireworm))或叩头甲（C.Vespe:rtinus)(烟草铁线虫（tobacco wireworm))); Phthorimaea spp?(例如马铃墓麦蛾（P.Operculella)(马铃墓麦蛾））；长管财属物种 (Macrosiphum spp.)(例如大戟长管财（M. Euphorbiae)(马铃墓财））；Thyanta spp. (例女口 T. pallidovirens (redshouldered stinkbug)) ；Phthorimaea spp.(例女口马铃 墓麦蛾（P. Operculel la((马铃墓麦蛾））；铃夜蛾属物种（Helicoverpa spp.)(例如 谷实夜蛾化Zea)(美洲柿铃虫（tomato fruitworm)) ;Keiferia spp.(例如番茄蠢 蛾 K. Iycopersicella(番茄蠢蛾））；Limonius spp.(铁线虫（wireworm));天蛾属物种 (Manduca spp.)(例如烟草天蛾（M. Sexta)(烟草天蛾），或番茄天蛾（M. Quinquemaculata) (番茄天蛾））；斑潜M属物种（Xiriomyza spp.)(例如蔬莱斑潜M (X. Sativae)、兰 叶草斑潜M (X. Trifolli)或南美斑潜M (L Huidobrensis)(斑潜M ));果M属物种 G)rosophiIla spp.)(例如黑尾果虫畢 〇)? Melanogaster)、D. yakuba、D. pseudoobscura 或D.simulans);步甲属物种（Carabus spp.)(例如粒步甲（C.granulatus));摇蚊属物 种（Qiironomus spp.)(例如 C. tentanus);柿头圣属物种（Ctenoc邱halides spp.)(例 如猫柿头圣把Felis)(猫圣））；非耳嗦象属物种Oiapr邱es spp.)(例如甘藏根頓虫 (D-Abbreviatus)(根象鼻虫））；齿小蠢属物种（Ips spp.)(例如美松齿小蠢（I. Pini)(美 松齿小蠢））；拟谷盗属物种（Tribolium spp.)(例如赤拟谷盗（T. CastaneumH赤拟谷 盗））；舌M属物种（Glossina spp.)(例如刺舌M (G. Morsitans)(采采M));按蚊属物种 (Anopheles spp.)(例如冈比亚按蚊（A. Gambiae)(追蚊））；铃夜蛾属物种Glelicoverpa spp.)(例如棉铃虫化Armigera)(非洲棉铃虫））；无网长管财属物种（Acyi'thosiphon spp.)(例如豆无网长管财（A. pisum) ( 5宛豆财））；蜜蜂属物种（Apis spp.)(例如意大利 蜂（A. Melifera)(蜜蜂））；Homalodisca spp.(例如玻璃叶婢巧.coagulate)(玻璃翅 叶虫单））；伊蚊属物种（Aedes spp.)(例如埃及伊蚊（Ae. Aegypti)(埃及伊蚊））；蚕蛾属 物种化ombyx spp.)(例如家蚕化Mori)(家蚕）、野桑蚕化Mandarina));飞幢属物种 (Locusta spp.)(例如飞幢（L Migratoria)(飞幢））；牛婢属物种化oophilus spp.)(例 如微小牛婢化.Microplus)(具环牛婢））；Acan化oscurria spp.(例如A.gomesiana (红毛 褐鸟虫（red-haired chololate bird eater))) ;Diploptera spp.(例如 D. Punctata(太 平洋甲虫蜂鄉（pacific beetle cockroach)));毒蝶属物种（}feliconius spp.)(例 如瓦氏袖蝶化Erato)(红型花蝶（red passion flower buttei^fly))或墨尔波蝶 (比 MelpomeneH 邮差蝶（postman buttei^fly)));象虫属物种（Curculio spp.)(例如欧洲 栋象（C.glandium)(橡实象甲（acorn weevil)));莱蛾属物种（[Plutella spp.)(例如莱 蛾（P. X^dostella)(莱蛾（diamon 化 ack moth)));纯眼婢属物种（Amblyomma spp.)(例如 彩饰纯眼婢（A. Variegatum)(具环牛婢））；巧蚕属物种（Anteraea spp.)(例如半目大蚕 蛾（A. Yamamai)(蚕蛾（silkmo化)））；Belgica spp.(例如南极百吉卡蚊化 Antartica))、 Bemisa spp.(例如 B. Tabaci)、Bicyclus spp.、Biphillus spp?、瘤背豆象属物种 (Callosobruchus spp.)、色卷蛾属物种（Qioristoneura spp.)、虎甲属物种（Cicindela spp.)、库蚊属物种（Culex spp.)，库朦属（Culicoides spp.)、枯木動属物种 Oiaphorina spp.)、非耳嗦象属物种 Oiapr邱es spp.)、Euclidia spp.、舌虫畢属物种（Glossina spp.)、 幡蜂属物种（Girllus spp.)、纹石蛾属物种（Hy化opsyche spp. )、±吉了属物种Qulodis spp. )、Lonomia spp.、罗岭属物种（Lutzomyia spp. )、Lysiphebus spp、Meladema spp、覃 甲属物种（Mycetophagus spp.)、金小蜂属物种 O^Jasonia spp.)、Oncometopia S卵.、凤 蝶属物种（Papilio spp.)、風属物种（Pedi州Ius spp.)、谷斑頓属物种（Plodia spp.)、 Rhynchosciara spp.、Sphaerius spp.、声虫牙属物种（Toxoptera spp. )、Trichoplusa spp.、 和阿蚊属物种（Armigeres spp.)(例如骚扰阿蚊（A. Suba化aUis))。
[0088] "有害生物控制剂"或"基因遏制剂"指包含第一 RNA片断和第二RNA片断的特定 RNA分子，其中，第一和第二RNA片断之间的互补性导致两条片断能在体内和体外杂交，形 成双链分子。通常，其优选可W包括连接和稳定第一和第二序列的第H RNA片断，从而可 形成茎，其中通过第H片段将第一和第二片段的各一端连接在一起W形成环，从而整个结 构形成茎环结构，甚至更紧密地杂交结构可形成茎环有结（stem-loop knotted)结构。或 者，可在没有第H片断的情况下形成对称发夹，其中，没有设计的环，但是就立体理由来说， 当茎足够长到能稳定自身的时候，发夹将产生其自身的环。通常，第一和第二RNA片断将处 于RNA分子的长度内，是各自的充分倒置重复序列，并通过第H RNA片断连到一起。对于在 被dsRNA分子的摄入所遏制的祀昆虫有害生物中从祀基因转录来的祀RNA而言，第一和第 二片断总是（并非分别）对应于所述祀RNA的正义和反义序列。
[0089] 有害生物控制剂还可W是经充分纯化（或分离）的核酸分子，更具体地，来自基因 组DNA (曲NA)或CDNA文库的核酸分子或其核酸片段分子。或者，片段可包含具有大约15 至大约250个核巧酸残基（更优选地，大约15至大约30个核巧酸残基）的更小的寡核巧 酸。
[0090] 在本文中使用时，引入指核酸序列插入细胞，该通过包括感染、转染、转化或转导 的方法来实现。
[0091] 单子叶植物（monocotyledonous plant,英文也作monocot)是开花植物，其具有 含一片子叶的胚，平行叶脉，花的各部分为3的倍数。单子叶植物的实例包括但不限于：草 坪草、玉米、稻、燕麦、小麦、大麦、高梁、红口兰、鸾尾、百合、葱和踪搁。
[0092] 线虫或蝴虫是最常见的动物口之一，其具有超过20, 000种不同的已知物种（超过 15, 000种是寄生的）。它们在淡水、海洋和陆地环境中普遍存在，在该些环境中，它们在个 体数量和物种数量上通常都超过其它动物，在远至南极和海沟的地方都能发现它们。此外， 有大量的寄生形式，包括大多数植物和动物中的病原体。
[0093] 本发明的方法可应用于所有线虫，其对于RNA干扰导致的基因沉默来说是易感 的，并且能使得双链RNA从它们的直接环境被内在化。
[0094] 在本发明的一种实施方案中，线虫可W属于异皮科化eteroderidae)，包括胞囊线 虫属化eterodera)和球胞囊线虫属（Globodera)。
[0095] 在本发明的优选但非限制性的实施方案和方法中，昆虫选自下述组，该组包括但 不限于：根结线虫属物种（Meloidogyne spp.)(例如南方根结线虫（M. Incognita)、爪哇 根结线虫（M. Javanica)、禾草根结线虫（M. Graminicola)、花生根结线虫（M. Arenaria)、 奇氏根结线虫（M. Chitwoodi)、北方根结线虫（M.化pla)或M.paranaensis);胞囊线虫属 物种化eterodera spp.)(例如水稻胞囊线虫化oryzae)、大豆胞囊线虫化Glycines)、 玉米胞囊线虫化.Zeae)或甜菜胞囊线虫化Schachtii));球胞囊线虫属物种（Globodera spp.)(例如马铃墓白线虫（G.化llida)或马铃墓金线虫（G. Rostochiensis));肾形 线虫属物种（Rotylenchulus spp.)(例如肾形线虫化Reniformis));短体线虫属物 种（Pratylenchus spp.)(例如咖啡短体线虫（P. coffeae)、玉米短体线虫（P. Zeae) 或古迪短体线虫（P. good巧i));穿孔线虫属物种（Rado地Olus spp.)(例如香蕉穿 孔线虫化Similis));潜根线虫属物种化irschmaniella spp.)(例如稻潜根线虫 化.Oryzae));钩 口线虫属物种（Ancylostoma spp.)(例如犬钩 口线虫（A. caninum)、 锡兰钩口线虫（A. C巧Ianicum)、十二指肠钩口线虫（A. Duodenale)或管形钩口线虫 (A. Tubaeforme)) ;Anisakid ;滑刃线虫属物种（Aphelenchoides spp.)(例如水稻干 尖线虫（A. BesseyU);蝴虫（Ascarids);蝴虫属物种（Ascaris spp.)(例如猪蝴虫 (A. Simm)或A. Iumbridoides);刺线虫属物种炬elonolaimus spp.);布鲁丝虫属物种 炬rugia spp.)(例如马来丝虫化Mala^)或彭亨丝虫炬.P址angi));伞滑刃线虫属物 种炬ursaphelenchus spp.);新杆状线虫属物种（Caenorh油ditis spp.)(例如漂亮新小 杆线虫（C. elegans)、C. briggsae 或 C. remanei);梭菌属物种（Clostridium spp.)(例如 丙丽了醇梭菌（C. Acetobut^ixum));古柏线虫属物种（Cooperia spp.)(例如肿孔古柏 线虫（C. Onco地ora));轮线虫属物种（Criconemoides spp.);杯口属物种（切athostomum spp.)(例如碗状杯 口线虫（C. Catinatum)、冠状杯 口线虫（C. Corona1:um)或C. patera1:um); 杯环属物种（切Iicocyclus spp.)(例如鲜明杯环线虫（C. Insigne)、细颈杯环线虫 (C. ^ssatus)或C. radiatus);杯冠属物种（切Iicoste地anus spp.)(例如高氏杯冠线 虫（C. Goldi)或长伞杯冠线虫（C. Longibursa1:us));裂头属（Di地}dlobot虹ium);恶丝 虫属物种值irofilaria spp.)(例如犬恶丝虫值.Immitis));茎线虫属物种值it^enchus spp.)(例如续断双垫刃线虫值.Dipsaci)、马铃墓腐烂线虫值.Destructor)或水稻茎线虫 (D. Angustus));烧虫属物种巧nterobius spp.)(例如蠕形住肠烧虫化Vermi州laris)); 血矛线虫属物种（化emonchus spp.)(例如抢转血矛线虫化Contortus));螺旋线虫属 物种化elicot}denchus spp.);纽带线虫属物种化oplolaimus spp.);光丝虫属物种 (Litomosoides spp.)(例如棉鼠丝虫（LSigmodontis));长针线虫属物种（Longidorus spp.)(例如大体长针线虫（L. Macrosoma));板口线虫属物种（Necator spp.)(例如 美洲板口线虫（N. Americanus));日本圆线虫属物种（Nippostrong5dus spp.)(例如 己西钩虫（N.化asiliensis));盘尾丝虫属物种的nchocerca spp.)(例如旋盘尾丝虫 (0. Volvulus));胃线虫属物种（Ostertagia spp.)(例如奧斯特线虫（0. Ostertagi)); Parastrongyloides spp.(例如 P.trichosuri);类毛刺线虫属物种（Paratrichodorus spp.)(例如较小类毛刺线虫化Minor)或圆形类毛刺线虫（P. Teres));拟马鹿圆线虫 属物种（Parelaphostrong5dus spp.)(例如薄副鹿圆线虫（P. Tenuis)) ;Rado地ulus spp.;盾线虫属物种（S 州 tel lonerna. spp.);类圆线虫属物种（Strongyloides spp.) (例如鼠类圆线虫化Ratti)或粪类圆线虫仅Stercoralis));背带线虫属物种 (Teladorsagia spp.)(例如 T.cir 州 mcincta);弓虫回线虫属物种（Toxascaris spp.)(例 如狮弓蝴线虫（T. Ieonina));弓蝴虫属物种（Toxocara spp.)(例如犬弓蝴虫（T. Canis) 或猫弓蝴虫（T. Cati);毛线虫属物种（Trichinella spp.)(例如T.britovi、旋毛线 虫（T. Spiralis)或T.spirae);毛刺线虫属物种（Trichodorus spp.)(例如相似毛刺 线虫（T. Similis));鞭虫属物种（Trichuris spp.)(例如鼠鞭虫化Muris)、狐毛首线 虫化化1口13)或鞭形鞭虫化Trichiura));小垫刃线虫属物种（T}denchulus spp.); 矮化线虫属物种（Tylenchorhynchus spp.);钩虫属物种（Uncinaria spp.)(例如小头 钩虫属扣.Stenoce地ala));吴策线虫属物种（Wuchereria spp.)(例如班氏吴策线虫 (W-Bancrofti));剑线虫属物种狂iphinema spp.)(例如标准剑线虫（Xlndex)或美洲剑 线虫狂.Americanum))。
[0096] 植物寄生线虫导致严重作物损失。最常见的属是滑刃线虫属（Aphelenchoides) (叶线虫）、根结线虫属（Meloidogyne)(根结线虫）、胞囊线虫属、球胞囊线虫属（胞囊线 虫）（例如，马铃墓根线虫）、珍珠线虫属（NaccAbus)、短体线虫属（腐线虫）、茎线虫属、剑 线虫属、长针线虫属、毛刺线虫属。其它线虫攻击树皮和林木。该组中最重要的代表是松材 线虫炬ursaphelenchus巧Io地ilus)，该是松木线虫，其存在于亚洲和美洲，近来也被发现 于欧洲。
[0097] 正常细胞是指未转化表型的细胞或表现出待检测组织类型的未转化细胞形态的 细胞。
[0098] 有效地连接表示将两个或多个分子W下述方式组合起来，所述方式使得在组合中 它们可W在植物细胞中正确发挥功能。例如，当启动子能控制结构基因的转录时，启动子就 是与结构基因有效地连接的。
[0099] 直向同源物是通过来自共同祖先的垂直演化相关的基因，它们编码在不同物种中 具有相同功能的蛋白质。由于它们在物种形成事件后分离，因此，直向同源物可能有所差 异，但是通常具有序列和结构水平上的相似性。源自共同祖先并且编码具有相似功能的蛋 白质的两个基因被称为直向同源物。对直向同源物的鉴定对于可靠预测新测序基因组中基 因的功能来说是关键的。
[0100] 有害生物或祀有害生物包括但不限于；昆虫、蜘蛛类、甲壳类、真菌、细菌、病毒、线 虫、扁形动物、蝴虫、烧虫、钩虫、缘虫、锥虫、血吸虫、狂禍、固陆、壁風、峨和風，它们是人类 环境中遍布的，并且会对植物造成损伤。有害生物可摄入或接触用双链基因遏制剂转化的 植物产生的一种或多种细胞、组织或产物。
[0101] 杀虫剂指意欲用来防止、破坏、击退或减轻任何有害生物的任何物质或物质的混 合物。杀虫剂可W是化学物质或生物剂，例如，转基因植物，其用于抵抗与人类竞争食物、破 坏财产、传播疾病或令人讨厌的有害生物，包括昆虫、植物病原体、杂草、线虫和微生物。
[0102] 表型是植物的区别特性或特征，可根据本发明通过将一种或多种"想要的多核巧 酸"和/或可筛选/选择标记整合进经转化植物的至少一个植物细胞的基因组中来对其 加W改变。"想要的多核巧酸"和/或标记可通过对经转化植物细胞或整株植物的大量遗 传、分子、生物化学、生理、形态或农艺学特征或属性中的任何一种加W修饰，向经转化的植 物表型赋予变化。因此，一种或多种稳定整合进植物基因组中的想要的多核巧酸地表达可 能产生选自（但不限于）下述的表型：增加的疾病耐受性、增加的昆虫耐受性、增加的干旱 耐受性、增强的寒冷和霜冻耐受性、改善的活力（vigor)、增强的颜色、增强的健康和营养特 征、改善的胆藏性、增强的产量、增强的盐耐受性、增强的重金属耐受性、增加的水胁迫耐受 性、增强的甜度、改善的活力、改善的味道、改善的质地、减少的磯酸盐含量、增加的萌发、增 加的微量营养素摄取、改善的淀粉组成W及改善的花寿命。
[0103] 植物组织；"植物"是植物界的多种光合、真核、多细胞生物中的任何生物，其特征 性地产生胚，含有叶绿体并且具有纤维素细胞壁。可根据本发明的方法，对植物的一部分， 目r植物组织"加W处理，W产生转基因植物。可根据本发明，来转化很多合适的植物组织， 其包括但不限于：体细胞胚、花粉、叶、茎、愈伤组织、甸旬茎、微块茎（micro化bers)和枝 条。因此，本发明预想对被子植物和裸子植物的转化，所述植物例如，金合欢、首荐、苹果、 杏、朝鲜葫、白蜡树、天口冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、禅木、山毛棒、黑霉、蓝霉、挪菜、 抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝K木墓、花挪菜、雪松、谷类、芹菜、栗、禮、大白菜、 巧橘、克莱口氏小巧橘、H叶草、咖啡、谷物、棉、班豆、黄瓜、柏木、茄子、偷、宦卖菜、按树、茵 香、无花果、冷杉、老鹤草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衣甘蓝、縣猴 桃、孽蓝、落叶松、窝宦、韭葱、削i、来樣、洋槐、松、铁线藤、玉米、芒果、械树、瓜、泰、磨茹、 白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、枯、观赏植物或花或树、番木瓜、踪搁、欧芹、欧洲防风草、 魏豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石恼、马铃墓、西葫芦、 菊宦、萝K油菜、息钩子、稻、黑麦、高梁、柳树、大豆、玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖萝K甘藏、 向日葵、甘墓、甜玉米、红枯、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、宪青、蔓生植物、核桃、豆瓣 菜、西瓜、小麦、墓葫、红豆杉和夏南瓜。
[0104] 根据本发明，"植物组织"还包括植物细胞。植物细胞包括息浮培养物、脱腑体、胚、 分生组织区域、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、抱子体、花粉、种子和小抱子。植物组织可W 是多种成熟期的，其可生长于液体或固体培养物中，或者生长于罐、温室或田间的±壤或适 当的培养基中。植物组织还可指此类植物、种子、子代、繁殖体（无论有性还是无性产生的） W及任何该些的后续传代物（descendent)(例如插条或种子）的任何克隆。
[0105] 植物转化和细胞培养；泛指下述工艺，通过所述工艺，对植物细胞进行遗传修饰， 并将其转移到合适的植物培养基中用于保持、进一步生长和/或进一步发育。此类方法是 技术人员公知的。
[0106] 子代（progeny);本发明的"子代"，例如，转基因植物的子代，是由植物或转基因 植物作为母本或父本产生的或源自其的子代。因此，"子代"植物，即"Fl"代植物是本发明 的方法产生的转基因植物的后裔或后代。转基因植物的子代可在其至少一个、一些或全部 的细胞基因组中含有通过本文所述的方法整合进亲本转基因植物细胞的想要的多核巧酸。 因此，想要的多核巧酸被子代植物"传递"或"遗传"。由此在子代植物中遗传的想要的多核 巧酸可处于T-DNA构建体中，所述构建体也从其亲本通过子代植物遗传。本文中使用的术 语"子代"还可被认为是一组植物的后裔或后代。
[0107] 启动子：启动子意欲表示与RNA聚合酶和/或其它转录调控元件结合的核酸，优选 地，DNA。和任何启动子一样，本发明的启动子将协助或控制DNA或RNA的转录，W从与所述 启动子有效地连接的核酸分子产生mRNA分子。如前文所述，产生的RNA可编码蛋白质或多 肤，或者编码RNA干扰或反义分子。
[0108] 植物启动子是能起始植物细胞中的转录的启动子，而无论其来源是否是植物细 胞。示例性的植物启动子包括但不限于；从植物、植物病毒和细菌（例如农杆菌属或根瘤 菌属巧hizobium))(其包含在植物细胞中表达的基因）获得的启动子。处于发育控制下的 启动子的例子包括；优先在某些组织（例如，木质部、叶、根和种子）中起始转录的启动子。 此类启动子被称为组织优先型启动子。能仅在某些组织中起始转录的启动子被称为组织特 异性启动子。细胞类型特异性启动子主要驱动一种或多种器官中某些细胞类型（例如，根 或叶中的维管细胞）中的表达，例如根特异性启动子。诱导型或阻抑型启动子是处于环境 控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件或光的存 在。组织特异性、组织优先型、细胞类型特异性和诱导型启动子构成了非组成型启动子的 组。组成型启动子是在大多数环境条件下W及在大多数植物部分中具有活性的启动子。
[0109] 多核巧酸是该样的核巧酸序列，其包含基因编码序列或其片段、启动子、内含子、 增强子区域、聚腺巧酸化位点、翻译起始位点、5'或3'非翻译区域、报道基因、可选择标记 等。多核巧酸可包含单链或双链DNA或RNA。多核巧酸可包含经修饰的碱基或经修饰的主 链。多核巧酸可W是基因组、RNA转录本（例如mRNA)或经加工的核巧酸序列（例如cDNA)。 多核巧酸可包含正义或反义方向的序列。
[0110] 经分离的多核巧酸是并非处于其天然状态的多核巧酸序列，例如，所述多核巧酸 包含并非在自然界中发现的核巧酸序列，或者所述多核巧酸与其通常接近的核巧酸序列分 开，或者所述多核巧酸与其通常不接近的核巧酸序列相邻。
[0111] 重组核巧酸序列指该样的核酸分子，其含有通过诱变、限制性酶等进行的操作产 生的遗传工程修饰。
[0112] RNA干扰（RNAi)指通过短干扰RNA(SiRNA)介导的、对基因表达（蛋白质合成）的 序列特异性或基因特异性遏制。
[0113] 种子；"种子"可被认为是成熟的植物胚珠（含胚）W及植物的繁殖部分，例如块 茎或抱子。可在微生物介导的转化之前，在黑暗中对种子进行赔育，例如W促进萌发。还可 在赔育之前对种子灭菌，例如通过用漂白剂简单处理。然后可将得到的幼苗暴露给想要的 细菌，W进行转化。
[0114] 可选择/可筛选标记；在植物或植物组织中表达时，使得可W将所述植物或植物 组织与不表达该基因的其它植物或植物组织区别开的基因。筛选流程可能需要针对可筛选 标记基因编码的蛋白质的表达的检测。可选择标记的例子包括新霉素磯酸转移酶（NPTII) 基因（编码卡那霉素和遗传霉素（geneticin)抗性）、潮霉素磯酸转移酶（HPT或APHIV)基 因（编码对潮霉素的抗性）或本领域已知的其它类似基因。
[0115] 序列同一性；在本文中使用时，在提到两条核酸序列的上下文中，"序列同一性"或 "同一性"包括指：当在特定区域上为最大程度对应而比对时两条序列中相同的残基。当序 列因为保守取代有所不同时，可对百分比序列同一性加W调整，W针对取代的保守性质加 W校正。由于此类保守取代而有所不同的序列被认为具有"序列相似性"或"相似性"。用 于进行该调整的手段是本领域技术人员公知的。
[0116] 在本文中使用时，序列同一性百分比表示；通过在比较窗口上比较两条最优比对 的序列所确定的值，其中，为了对两条序列进行最优比对，比较窗口中多核巧酸序列的部分 较之对照序列（不包含添加或缺失）而言可包含添加或缺失（即，空位）。通过下述方法来 计算百分比：测定在两条序列中出现相同核酸碱基的位置数量，W产生匹配的位置，用所述 匹配位置数除W比较窗口中的位置总数，并将结果乘W 100,产生序列同一性百分比。
[0117] "序列同一性"具有本领域认可的含义，可使用公开的技术来计算。见 COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk,编著（Oxford 化iversity Press, 1988)、 BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PRCUECTS, Smith,编著（Academic Press, 1993)、 COMPUT邸 ANALYSIS OF SEQ肥NCE DATA,部分 I，Griffin&Griffin,编著，（Humana Press, 1994)、沈卵ENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje 编著，Academic Press (1987)、沈卵 ENCE ANALYSIS PRIMER, Gr 化 skov&Devereux,编著.（Macmillan Stockton Press,1991)和 Carillo&Lipton, SIAM J.Applied Math. 48:1073(1988)。 通常用来测定两条序列间同一性或相似性的方法包括但不限于GUIDE TO HUGE COMPUT邸S, Bishop,编著，（Academic Press, 1994)和上文 Carillo化ipton 中公开的。 用于测定同一性和相似性的方法被编码为计算机程序。用于测定两条序列间同一性和相 似性的优选计算机程序方法包括但不限于GCG程序包值evereux等人，Nucleic Acids Research 12:387 (1984))、BLASTN、FASTA (Atschul 等人，J. Mol. Biol. 215:403 (1990))和 FASTDB 炬rutlag 等人，Comp. App. Biosci. 6:237 (1990))。
[0118] 短发夹RNA(ShRNA)是该样的短单链RNA，其具有高度二级结构，使得RNA链的一部 分可形成发夹环。
[0119] 短干扰RNA (SiRNA)指大约10至大约30个核巧酸长的双链RNA分子，其具有特异 性干扰基因蛋白质表达的能力并由此得名。
[0120] 祀序列指有害生物中被选来通过双链RNA技术遏制或抑制的核巧酸序列。祀序列 编码有害生物中重要的特性或生物学活性。
[0121] 转录终止子；通常，本发明的表达DNA构建体具有转录终止区域，其位于转录起始 调控区域的反向端。可就mRNA的稳定性（W增强表达）和/或就加到基因转录产物上的 聚腺巧酸化尾的添加，来选择转录终止区域。当H链终止密码子中的任何一个进入核糖体 上的A位点时，刚产生的多肤的翻译就终止了。翻译终止密码子是UAA、UAG和UGA。
[0122] 转化DNA(T-DNA);细菌T-DNA是公知的遗传元件，其是能将其边界内含有的核巧 酸序列整合进另一基因组的元件。在该方面，通常，T-DNA侧翼有两条"边界"序列。本发明的 想要的多核巧酸和可选择标记可位于T-DNA的左边界样序列和右边界样序列之间。T-DNA 中含有的想要的多核巧酸和可选择标记可与多种不同的、植物特异性的（即，天然的）或外 源的核酸（例如启动子和终止子调控元件）有效地连接，所述核酸协助其表达（即，想要的 多核巧酸或可选择标记编码的DNA序列的转录和/或翻译）。
[0123] 对植物细胞的转化；通过其将核酸稳定插入进植物细胞基因组的方法。可使用本 领域公知的多种方法，在天然或人工条件下进行转化。转化可依赖于用于将核酸序列插入 原核或真核宿主细胞的任何已知方法，其包括：农杆菌介导的转化方案（例如，"精细转化" 或"精准育种"）、病毒感染、Whiskers、电穿孔、显微注射、聚己二醇处理、热激、脂质体转染 和粒子轰击。
[0124] 转基因植物；本发明的转基因植物包含至少一个其中已稳定整合了外源核酸的细 胞基因组。根据本发明，转基因植物是包含仅一个经遗传修饰的细胞和细胞基因组的植物， 或者是包含一些经遗传修饰的细胞的植物，或者是其中全部细胞被遗传修饰的植物。本发 明的转基因植物可W是仅在植物的某些部分包含想要的多核巧酸（即外源核酸）的表达的 植物。因此，转基因植物可仅在其结构的某些部分含有经遗传修饰的细胞。
[0125] 变体；在本文中使用时，"变体"应当被理解为表示与特定基因的标准或给定核巧 酸序列有所不同的核巧酸序列。术语"同等型（iso化rm)"、"同种型（isotype)"和"类似 物"也表示核巧酸序列的"变体"形式。通过一个或多个核巧酸的添加、移除或取代改变的 核巧酸序列可被认为是"变体"序列。"变体"还可指"经改组的基因"，例如Maxygen名下的 专利中描述的。
[0126] 应当理解，本发明并不限于本文描述的特定方法、方案、载体和试剂等，该些都可 W变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非意欲限制本发 明的范围。应当注意，除非上下文明确另外指示，在本文和所附权利要求中使用时，单数形 式"一个/ 一种"和"该个/该种"（"a"、"an"和"the")包括复数。因此，例如，提到"一 种基因/基因"时也表示一种或多种基因，并且包括本领域技术人员已知的其等同物等。
[0127] I.祀有害生物
[012引本发明提供了控制有害生物侵袭的方法和构建体，该是通过向有害生物施用祀编 码序列来实现的，所述序列能对有害生物中必要的生物学功能加W转录后阻遏或抑制。在 本文中使用时，术语"有害生物"指昆虫、蜘蛛类、甲壳类、真菌、细菌、病毒、线虫、扁形动物、 蝴虫、烧虫、钩虫、缘虫、锥虫、血吸虫、狂禍、跳圣、壁風、峨和風等，其是人、动物和植物中普 遍存在的。有害生物可摄入或接触用双链基因遏制剂转化的植物产生的一种或多种细胞、 组织或产物。
[0129] "有害生物抗性"性状是使得植物对有害生物攻击（通常，能造成植物的损伤或损 失）有抗性的转基因植物宿主的特征。此类有害生物抗性可W是天然突变导致的，或者， 更通常是赋予有害生物抗性的重组DNA的惨入导致的。为向转基因植物给予昆虫抗性，可 W例如将重组DNA转录为RNA分子，其在重组植物的组织或液体中形成dsRNA分子。所述 dsRNA分子部分地由RNA片段组成，所述RNA片段与喜好在重组植物上进食的昆虫有害生物 中DNA序列编码的相应RNA片断相同。祀昆虫有害生物中的基因表达被所述dsRNA遏制， 并且对祀昆虫有害生物中基因表达的遏制导致植物对昆虫具有抗性。
[0130] 合适的有害生物包括导致对植物或其部分的损伤的任何食植动物。本发明特别包 括昆虫、线虫和真菌有害生物。
[0131] 昆虫有害生物是特别感兴趣的，其包括但不限于；来自鱗翅目的，例如，长 翅卷蛾属物种（Acleris spp.)、褐带卷蛾属物种（Adoxo地yes spp.)、透翅蛾属物种 (Aegeria spp.)、地虎属物种（Agrotis spp.)、棉叶虫（Al油ama argillaceae)、Amylois spp.、梨豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis)、黄卷蛾属物种（Archips spp)、卷蛾属物种 (Argyrotaenia spp.)、银纹夜蛾属物种（Autographa spp.)、Busseola fusca、干果斑頓 (化化a cautella)、桃蛙果蛾（Ca巧osina nipponensis)、禾草頓属物种（Qiilo spp.)、色 卷蛾属物种（Qioristoneura spp.)、葡萄果蠢蛾（Clysia ambiguella)、纵卷叶野頓属物 种（Qiaphalocrocis spp.)、云卷蛾属物种（Qiephasia spp.)、Coch}dis S卵.、銷蛾属物种 (Coleo地ora spp.)、大菜頓（Crocidolomia binotalis)、苹果异形小卷蛾（Crypto地Iebia Ieucotreta)、小卷蛾属物种（切dia spp.)、杆草頓属物种值iahaea spp.)、苏丹棉铃 虫值iparopsis castanea)、金刚钻属物种巧arias spp.)、粉斑頓属物种巧地estia spp.)、花小卷蛾属物种巧ucosma spp.)、女贞细卷蛾巧upoecilia ambiguell)、黄毒蛾 属物种巧uproctis spp.)、切夜蛾属物种巧Uxoa spp.)、小食也虫属物种（Grapholita spp. )、Hedya nubiferana、实夜蛾属物种化eliothis spp.)、菜也野頓化ellula undalis)、美国白蛾化yphantria cunea)、番茄蠢蛾化eiferia Iycopersicella)、方度纹 潜蛾（Leucoptera scitella)、柯扁闽属物种（Lithocollethis spp.)、葡萄花翅小卷蛾 (Lobesia botrana)、毒蛾属物种（Lymantria spp.)、潜蛾属物种（Lyonetia spp.)、天幕 毛虫属物种（Malacosoma spp.)、甘蓝夜蛾（Mamestra brassicae)、烟草天蛾（Manduca sexta)、秋尺蛾属物种（Operophtera spp.)、玉米頓（Ostrinia Nubilalis)、超小卷蛾属 物种巧ammene spp.)、褐卷蛾属物种巧andemis spp.)、小眼夜蛾巧anolis flammea)、红 铃麦蛾巧ectinophora gossypiella)、马铃墓麦蛾脚Ithorimaea operculella)、莱粉蝶 巧ieris rapae)、粉蝶属物种巧ieris spp.)、莱蛾巧Iutella ；Kylostella)、Rrays spp.、 白禾頓属物种（Scii^pophaga spp.)、蛙茎野蛾属物种（Sesamia spp.)、长须卷蛾属物种 (Sparganothis spp.)、灰翅夜蛾属物种（Spodoptera spp.)、Synan化edon spp?、异舟蛾属 物种（Thaumetopoea spp.)、卷蛾属物种（Tortrix spp.)、粉斑夜蛾（Trichoplusia ni)和 巢蛾属物种灯ponomeuta spp.);
[013引来自稍翅目的，例如，叩头虫属物种（Agriotes spp.)、花象属物种（Anthonomus spp.)、甜莱隐食甲（Atomaria linearis)、甜莱腔跳甲（Qiaetocnema tibialis)、根頭象 甲属物种（Cosmopolites spp.)、象虫属物种（Curculio spp.)、皮蠢属物种 Oermestes spp.)、食植瓢虫属物种巧pilachna spp.)、Eremnus spp.、马铃墓叶甲（L 邱 tinotarsa decemlineata)、稻水象属物种(Xissorhoptrus spp.)、觸金龟属物种（Melolon化a spp.)、 Oryca 邱 hilus spp.、耳嗦象属物种（Otiorhynchus spp.)、Phlyctinus spp.、弧丽金龟属 物种巧opillia spp.)、十节跳甲属物种巧sylliodes spp.)、蛙长蠢属物种（Rhizopertha spp.)、金龟甲科（Scarabeidae)、米象属物种（Sitophilus spp. )、Sitotroga spp.、粉虫 属物种（Tenebrio spp.)、拟谷盗属物种（Tribolium spp.)和斑皮蠢属物种（Trogoderma S卵?）；
[0133] 来自直翅目的，例如娜属物种化Iatta spp.)、小娜属物种化Iattella spp.)、虫类 帖属物种（Giyllotalpa spp.)、马德拉斐娜（Xeucophaea maderae)、飞幢属物种（Xocusta spp.)、大娜属物种（[Periplaneta ssp.)和沙鎮幢属物种（Schistocerca spp.);
[0134] 来自等翅目的，例如散白蚁属物种Gteticulitemes ssp);
[0135] 来自晒虫目的，例如動晒属物种化iposcelis spp.);
[0136] 来自動目（Anoplura)的，例如血動属物种（Haematopinus spp.)、毛動属物种 (Linognathus spp.)、動属物种（[Pediculus spp.)、瘦绵财属物种（[Pemphigus spp.)和倭 财属物种脚lylloxera spp.);
[0137] 来自食毛目的，例如Damalinea spp?和晒毛動属物种（Trichodectes spp.);
[0138] 来自缕翅目的，例如花萄马属物种^ranklinella spp.)、篱萄马属物种 Glercino化rips spp.)、带萄马属物种（Taeniothrips spp.)、节瓜萄马（Thrips palmi)、 烟萄马（Thrips tabaci)和南非黄硬萄马（Sci:rtothrips aurantii);
[0139] 来自异翅目版teroptera)的，例如，奥虫属物种（Cimex spp.)、狄盲曝 (Distantiella theobroma)、棉红曝属物种 〇)ysdercus spp.)、Euchis 化 S spp?、扁盾曝属 物种（Eurygaster spp.)、稻缘曝属物种（Xeptocorisa spp.)、绿曝属物种（Nezara spp.)、 皮曝属物种巧iesma spp.)、红猎曝属物种（Rhodnius spp.)、可可褐盲曝（Satdbergella singularis)、黑曝属物种（Scotinophara spp.)、锥猎曝属物种（Triatoma spp.)、盲曝 科物种（Miridae family spp.)，例如豆芙草盲曝（Lygus hesperus)和美洲牧草盲曝 (Lygus Iineoloris)、长曝科物种（Xygaeidae family spp.)例如美洲谷杆长曝化 Iissus Ieucopterus)和曝科物种巧entatomidae family spp.);
[0140] 来自同翅目的，例如，棉粉動（Aleurothrixus floccosus)、莱粉動（Aleyrodes brassicae)、肾圆盾阶属物种（Aonidiella spp.)、财科（Aphididae)、财属物种（Aphis spp.)、圆盾阶属物种（AspidioUis spp.)、甘墓粉動化emisia tabaci)、蜡阶属物 种（Ceroplaster spp.)、Qi:rysomphalus aonidium、网巧草叶圆阶（Qiiysomphalus dictyosperm;L)、褐软蜡阶（Coccus hesperidum)、绿小叶婢属物种（Empoasca spp.)、 Eriosoma larigerum、斑叶虫单属物种（Erythroneura spp. )、Gascardia spp.、灰飞動 属物种（Xaodelphax spp. )、Lacanium corni、虫厉盾阶属物种（X邱idosaphes spp.)、 Macrosiphus spp.、瘤财属物种、Nehotettix spp.、褐飞動属物种（Nilaparvata spp.)、 Paratoria spp.、瘦绵财属物种、臀纹粉阶属物种（Planococcus spp.)、白盾阶属物 种巧seudaulacaspis spp.)、粉阶属物种巧seudococcus spp.)、木動属物种巧sylla ssp.)、Pulvinaria aethiopica、笠圆盾阶属物种（Quadraspidiotus spp.)、鑑管财属物 种（Rhopalosiphum spp.)、珠蜡阶属物种（Saissetia spp.)、带叶虫单属物种（Scaphoideus spp.)、二叉财属物种（Schizaphis spp.)、谷网财属物种（Sitobion spp.)、温室粉 動（Trialeurodes vaporariorum)、非洲木動（Trioza erytreae)和矢尖阶（Unaspis citri)；
[0141] 来自膜翅目的，例如Acromyrmex、美切叶蚁属物种（Atta spp.)、麦茎蜂属物 种（Cephus spp.)、松叶蜂属物种 〇)iprion spp.)、松叶蜂科 〇)iprionidae)、Gilpinia polytoma、李实蜂属物种（Hoplocampa spp.)、毛蚁属物种（Xasius sppp.)、小家蚁 (Monomorium pharaonis)、新松叶蜂属物种（Neodiprion spp)、火蚁属物种（Solenopsis spp.)和胡蜂属物种（Vespa ssp.);
[0142] 来自双翅目的，例如，伊蚊属物种（Aedes spp.)、An化erigona soccata、全北毛蚁 化；Lbio hoi'tulanus)、红头丽M (Calliphora eiythroc邱hala)、蜡实M属物种（Ceratitis spp.)、金虫畢属物种（OiiTsomyia spp.)、库蚊属物种（Culex spp.)、黄虫畢属物种（Cuterebra spp.)、寡鬚实虫畢属物种Oacus spp.)、黑尾果虫畢、厕虫畢属物种（；Fannia spp.)、胃虫畢属物 种（Gastrophilus spp.)、舌虫畢属物种（Glossina spp.)、牛虫畢属物种（Hypoderma spp.)、 Hyppobosca spp?、斑潜虫畢属物种（Xiriomysa spp.)、绿虫畢属物种（Lucilia spp.)、黑潜虫畢 属物种（Melanagromyza spp.)、家虫畢属物种（Musca ssp.)、狂虫畢属物种（Oestrus spp.)、 Orseolia spp?、欧洲麦轩M (Oscinella frit)、天仙子泉M 巧egomyia hyoscyami)、草 种虫畢属物种脚iorbia spp.)、苹绕实M (Rhagoletis pomonella)、覃蚊属物种（Sciara spp.)、废虫畢属物种（Stomoxys spp.)、配虫属物种（Tabanus spp.)、Tannia spp?和大蚊属 物种（Tipula spp.);
[0143] 来自圣目的，例如角叶圣属物种（Ceratophyllus spp.)和鼠疫圣（Xenopsylla cheopis) 及
[0144] 来自缕尾目的，例如衣鱼（X邱isma saccharina)。
[0145] 特别感兴趣的线虫有害生物包括，例如犬钩口线虫（A. caninum)、锡兰钩口 线虫（A. Ce^dancium)、捻转血矛线虫（比Contoi'tus)、奧斯特线虫（0? Ostertagi)、漂 亮新小杆线虫、C. briggsae、P. pacificus、粪类圆线虫仅Stercoralis)、鼠类圆线虫 仅 Ratti)、P. trichosuri、花生根结线虫（M. Arenaria)、奇氏根结线虫（M. Qiitwoodi)、 北方根结线虫（M. Hapla)、南方根结线虫（M. Incognita)、爪哇根结线虫（M. Javanica)、 M.paraensis、马铃墓金线虫（G.Rostochiensis)、马铃墓白线虫（G. Pallida)、大豆胞囊 线虫化Glycines)、甜莱胞囊线虫GLSchattii)、穿刺短体线虫（P. Penetrans)、伤残短 体线虫（P. Vulnus)、香蕉穿化线虫化Similis)、Z. punctata、猪蝴虫（A. Suum)、犬弓蝴虫 (T. Canis)、马来丝虫化Malayi)、犬恶丝虫〇? Immitis)、旋盘尾丝虫（0? Volvulus)、狐毛 首线虫（T. Vulpis)、旋毛线虫（T. Spiralis)、标准剑线虫（X. Index)、十二指肠钩口线虫 (A. Duodenale)、人蝴虫（A. Lumbricoides) W及来自下述属的物种：滑刃线虫属、珍珠线虫 属、茎线虫属、长针线虫属、毛刺线虫属和伞滑刃线虫属。
[0146] 特别感兴趣的真菌有害生物包括但不限于：小枝顶抱属物种（Acremoniella spp.)、链格抱属物种（Alternaria spp.)(例如芸苔生链格抱（Alternaria brassicola) 或索兰尼（氏）链格抱（Alternaria solani))、壳二抱属物种（Ascochyta spp.)(例如邑宛 豆壳二抱（Ascochyta pisi))、葡萄抱属物种（[BotITtis spp.)(例如灰葡萄抱化Otiytis cinerea)或富克葡萄抱化otiyotinia fuckeliana))、枝抱属物种（Cladosporium spp.)、尾抱属物种（Cercospora spp.)(例如菊池尾抱（Cercospora kikuchii)或 Cercospora zaea-maydis)、枝抱属物种（Cladosporium spp.)(例如黄枝抱（Cladosporium fulvum))、刺盘抱属物种（Colletotrichum spp.)(例如豆刺盘抱（Colletotrichum Iindemu 化 ianum))、弯抱属物种（Curvularia spp.)、色二抱属物种 Oiplodia spp.) (例如玉米色二抱Oiplodia maydis))、白粉菌属物种巧iysiphe spp.)(例如Erysiphe graminis f. sp.graminis、 大麦白粉菌（Erysiphe graminis f. sp. hordei)或邑宛豆白粉 菌巧 iysiphe pisi))、Erwinia armylovora、镶抱属物种（F'usarium spp.)(例如雪腐镶 抱（Fusarium nivale)、拟分支抱镶抱（Fusarium sporotrichioides)、尖镶抱（Fusarium oxysporum)、禾本科窄廉抱（Fusarium graminearum)、Fusarium germinearum、大刀窄廉抱 (Fusarium culmorum)、腐皮镶抱（Fusarium solani)、串珠镶抱（Fusarium moniIiforme) 或粉红镶抱（F'usarium roseum))、顶囊壳属物种（Gaeumanomyces spp.)(例如小麦禾 顶囊壳（Gaeumanomyces graminis f. sp. tritici))、赤霉属物种(Gibberella spp.) (例如玉蜀泰赤霉（GiLbberella zeae))、长蠕抱属物种（Helmin化osporium spp.) (例女口 Helminthosporium turcicum、炭色长蠕抱（Helminthosporium carbonum)、玉 蜀泰长蠕抱（Helmin化osporium mavdis)或水稻小球菌棱病菌（Helmin^osporium sigmoideum))、稻小球腔菌（X邱tosphaeria salvinii)、壳球抱属物种（Macrophomina spp.)(例如莱豆壳球抱（Macrophomina phaseoIina))、Magnaportha spp?(例如稻磕 病菌（Magnaporthe oryzae))、球腔菌属物种（Mycosphaerella spp.)、从赤壳属物种 (Nectria spp.)(例如 Nectria heamatococca)、霜霉属物种巧eronospora spp.)(例如 东北霜霉（Peronospora manshurica)或烟草霜霉（Peronospora tabacina))、茎点霉属 物种卿ioma spp.)(例如泰莱茎点霉（；Phoma betae))、层诱菌属物种（[Phakopsora spp.) (例如豆墓层诱菌脚iakopsora pachyrhizi))、瘤梗抱属物种脚iymatotrichum spp.) (例如多主瘤梗抱脚iymatotrichum omnivorum))、疫霉属物种脚iytoph化ora spp.) (例如棒疫霉卿iytoph化ora cinnamomi)、恶疫霉卿iytoph化ora cactorum)、莱豆 疫霉脚iytoph化ora phaseoli)、寄生疫霉脚iytoph化ora parasitica)、巧枯褐腐疫 霉(Phytophthora citrophthora)、Phytophthora megasperma f. sp. soiae 或重文病疫 霉脚iytoph化ora infestans))、单轴霉属物种巧Iasmopara spp.)(例如葡萄生单轴 霉（Plasmopara viticola))、叉丝单囊壳属物种（Podos地aera spp.)(例如白叉丝单 囊壳（Podos地aera Ieucotricha))、柄镑菌属物种（Puccinia spp.)(例如高梁柄镑 菌（Puccinia sorghi)、条形柄镑菌（Puccinia striiformis)、小麦禾柄镑菌（Puccinia graminis f.sp.tritici)、天口冬属柄镑菌（Puccinia asparag;L)、隐匿柄镑菌（Puccinia recondita)或落花生柄镑菌（Puccinia arachidis))、腐霉属物种（P}fthium spp.)(例 如瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum))、核腔菌属物种（Pyrenophora spp.)(例如偃 麦草核腔菌（Pyrenophora tritici-r巧entens)或圆核腔菌（Pyrenophora teres))、 梨抱属物种（Pyricularia spp.)(例如稻梨抱（Pyricularia Oirzae))、腐霉属物种 (P}fthium spp.)(例如终极腐霉（P}fthium ultimum))、Miincospo;rium secalis、丝核菌 属物种巧hizoctonia spp.)(例如立枯丝核菌巧hizoctonia solani)、稻枯斑丝核菌 (Miizoctonia Oiyzae)或禾谷丝核菌（Miizoctonia cerealis))、根霉属物种（Miizopus spp.)(例如华根霉（Miizopus chinensid))、Scerotium spp.(例如 Scerotium rolfsii)、 核盘菌属物种（Sclerotinia spp.)(例如核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum))、壳针抱属 物种（Septoria spp.)(例如番茄壳针抱（Septoria Iycopersici)、大豆壳针抱（Septoria glycines)、颖枯壳针抱（Septoria nodorum)或小麦壳针抱（Septoria tritici))、根串珠 霉属物种（Thielaviopsis spp.)(例如根串珠霉（Thielaviopsis basicola))、腥黑粉菌 属物种（Tilletia spp.)、木霉属物种（Trichoderma spp.)(例如绿色木霉（Trichoderma virde))、钩丝壳属物种（Uncinula spp.)(例如葡萄钩丝壳（Uncinula necator))、玉蜀 泰黑粉菌扣Stilago maydis)(例如玉蜀泰黑粉病）、黑星菌属物种（Ven化ria spp.)(例 如苹果黑星菌（VenUiria inaequalis)或梨黑星菌（VenUiria pirina))、或轮枝抱属物 种（Verticillium spp.)(例如大丽花轮枝抱（Verticillium d址Iiae)或黄萎轮枝抱 (Verticillium albo-atrum))。
[0147] II.鉴定祀序列
[014引本发明提供了一种方法，用于鉴定和获得包含用于生产dsRNA或SiRNA的核巧酸 序列的核酸。例如，此类方法包括：(a)用包含来自被祀向昆虫的核巧酸序列或其同源物 的全部或一部分的杂交探针去探测CDNA或基因组DNA文库；化）鉴定出与杂交探针杂交的 DNA克隆；（C)分离出步骤化）中鉴定的DNA克隆；W及（d)对包含步骤（C)中分离出的克 隆的CDNA或基因组DNA片段测序，其中，被测序的核酸分子转录RNA核巧酸序列或其同源 物的全部或相当大部分。
[0149] 此外，本发明包括获得下述核酸片段的方法，所述核酸片段包含用于生产dsRNA 或SiRNA的相当大部分的核巧酸序列，所述方法包括；(a)合成第一和第二寡核巧酸引物， 其对应于来自被祀向有害生物的核巧酸序列之一的一部分；W及化）使用步骤（a)的第一 和第二寡核巧酸引物，扩增克隆载体中的CDM或基因组DNA模板，其中，被扩增的核酸分子 转录本发明的dsRNA或SiRNA的相当大部分。
[0150] 在对本发明的实践中，祀基因可源自导致对作物植物的损伤并且因此导致产量损 失的任何有害生物。采用若干种标准来选择优选的祀基因。所述基因是该样的：其蛋白质 产物具有迅速的周转率，使得dsRNA抑制导致蛋白质水平上的迅速减少。在某些实施方案 中，选用下述基因是有好处的，所述基因表达水平的小降低就会对受体有害生物造成有害 影响。如果想要祀向宽范围的昆虫物种，则例如，选择在该些物种间高度保守的基因。相反， 为了赋予特异性的目的而言，在本发明的某些实施方案中，选用该样的基因，其含有在各昆 虫物种间，或昆虫与其它生物间保守程度较低的区域。在某些实施方案中，可能想要选用在 其它生物中没有已知同源物的基因。
[0151] 本文中使用的术语"源自"指可从特定来源或物种获得的特定的核巧酸序列，但是 不一定要直接从该特定来源或物种获得。
[0152] 在一种实施方案中，选用在昆虫肠中表达的基因。祀向在肠中表达的基因避免了 对在昆虫内部扩散dsRNA的需求。用于本发明的祀基因可包括，例如，与已知肠表达的、编 码质膜质子V-ATPase的蛋白质组分值OW等人，1997, ；Dow，1999)，例如V-ATPase B或E 亚基的基因的核巧酸序列享有充分同源性的那些。该蛋白质复合体是上皮离子转运的唯一 增能剂（energizer),并且负责中肠腔的碱化。V-ATPase还在马氏管中表达，马氏管是昆虫 后肠的突起，其作用于液体平衡W及W类似于哺乳动物肾脏器官的方式针对外来化合物解 O
[0153] 在另一实施方案中，选用W重要方式参与昆虫生长、发育和繁殖的基因。示例性的 基因包括但不限于；核糖体蛋白的结构亚基和目-coatamer基因，CHD3基因。核糖体蛋白如 S4(化S4)和S9(化S9)是参与蛋白质生物合成的核糖体的结构组成成分，它们是胞质小核 糖体亚基的组分，核糖体蛋白如L9和L19是参与定位到核糖体上的蛋白质生物合成的核糖 体的结构组成成分。漂亮新小杆线虫中的目-coatamer基因编码蛋白质，其是形成膜小泡 外壳的多聚复合体的亚基。已在不同的生物体（例如拟南芥（Ar油idopsis thaliana)、黑 尾果禍和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))中发现了相似的序列。还在不同生物体 (例如，马铃墓叶甲（Leptinotarsa decemlineata)、辣根猿叶甲（Phaedon cochleariae)、 墨西哥豆瓢虫巧pilachna varivetis)、墨西哥棉铃象（Anthonomus grandis)、赤拟谷盗 (Tribolium castaneum)、桃虫牙（Myzus persicae)、褐飞風（Nilaparvata Iugens)、二化頓 (Qiilo suppressalis)、菜蛾（Plutella xylostella)和居屋艾幡（Acheta domesti州S)) 中发现了相关序列。用于本发明的其它祀基因可包括，例如，在生存能力、生长、发育、繁 殖和侵染性方面具有重要作用的那些基因。该些祀基因包括，例如持家基因、转录因子 W及昆虫特异性基因或新杆状线虫属（Caenorhabditis)或果禍属值roso地ila)中的 致死敲除突变。用于本发明的祀基因还可W是来自其它生物体的那些，例如，来自线虫 (例如，根结线虫属物种或胞囊线虫属物种）、其它昆虫或蛛形纲（例如，马铃墓叶甲属物 种（Leptinotarsa spp.)、猿叶甲属物种（Phaedon spp.)、食植瓢虫属物种巧pilachna spp.)、花象属物种（Anthonomus spp.)、拟谷盗属物种（Tribolium spp.)、瘤闽属物种、 褐飞風属物种（Nilaparvata spp.)、禾草頓属物种（Chilo spp.)、菜蛾属物种（Plutella SPP.)或Acheta SPP.)。此外，在本发明中用作为祀序列的核巧酸序列还可源自下述病毒、 细菌、真菌、昆虫或真菌基因，所述基因的功能已从文献中建立，其核巧酸序列与昆虫基因 组中的祀基因共享充分相似性。
[0154] 对于可能成为本发明控制的祀的很多昆虫来说，在关于大多数基因的序列方面 或特定基因突变导致的表型方面信息有限。因此，可基于模式生物（例如新杆状线虫属 (Caenorh油ditis)或果禍属值roso地ila))中或其它一些昆虫物种中的相应基因的可获 得的信息来选择基因。还可基于其基因已被表征过的其它物种（例如线虫或真菌物种）的 可获得的序列信息来选择基因。在一些情况下，可能通过使用基因名或基因序列的检索数 据库（例如GenBank)来获得来自祀昆虫的相应基因的序列。一旦获得了序列，就可W使用 PCR来扩增昆虫中被适当选出的基因片断，W用于本发明。
[0155] 为获得来自昆虫物种的相应基因的DNA片断，例如，可基于在漂亮新小杆线虫或 果虫电属中，或其基因已被克隆的昆虫中发现的序列，来设计PCR引物。对引物加W设计，W 扩增足够长的DNA片断，W用于本发明。选择扩增条件使得即使引物并不精确匹配祀序列 但扩增仍能进行。或者，可使用已知的昆虫基因作为探针，从制备自昆虫有害生物物种的基 因组DNA或CDNA文库，克隆出基因或其部分。用于进行PCR和从文库克隆的技术是已知 的。在实施例中提供了关于基于W前从昆虫物种中克隆出的基因序列来从祀昆虫有害生物 物种分离出DNA片断的工艺的详细细节。本领域普通技术人员将认识到，可W用多种技术 来从昆虫有害生物物种中分离出对应于W前从其它物种分离出的基因的基因片断。
[0156] III.用于抑制或遏制祀基因的方法
[0157] 本发明提供了使用dsRNA方法抑制一种或多种祀基因在祀有害生物中的基因表 达的方法。本发明特别可用于对真核基因表达加W调节，特别是对下述有害生物中存在的 基因的表达加W调节，所述有害生物展示出大约4. 5至大约9. 5的消化系统抑水平，更优 选地，大约5. 0至大约8. 0,进一步更优选地，大约6. 5至大约7. 5。对于具有展示出上述范 围之外的抑水平的消化系统的植物有害生物来说，可能需要使用无须摄入dsRNA分子的递 送方法。
[015引本发明的方法包括将两种或多种不同的双链RNA或RNA构建体同时或顺序提供给 同一昆虫，使得实现对多条祀基因的下调或抑制，或者使得实现对单个祀基因的更有效的 抑制。
[0159] 或者，通过提供击中多条祀序列的一种双链RNA来击中多个祀，W及通过对应于 祀基因的双链RNA片段的超过一个拷贝的存在，来更高效地抑制单个祀。因此，在本发明的 一种实施方案中，双链RNA构建体包含多个dsRNA区域，每个dsRNA区域中的至少一条链包 含与昆虫祀基因的祀核巧酸序列的至少一部分互补的核巧酸序列。根据本发明，RNA构建 体中的dsRNA区域可与相同或不同的祀基因互补和/或dsRNA区域可与来自相同或不同昆 虫物种的祀互补。由此，在植物宿主细胞中使用此类dsRNA构建体，在植物中建立对单种或 多种昆虫物种的更为有效的抗性。在一种实施方案中，双链RNA区域包括与祀基因互补的 核巧酸序列的多个拷贝。或者，dsRNA击中同一祀基因的超过一个祀序列。本发明由此包 括下述经分离的双链RNA构建体，其包含与昆虫祀的核巧酸序列的至少一部分互补的所述 核巧酸的至少两个拷贝。开发了击中多于一个上述祀的dsRNA或者针对不同的上述祀的不 同dsRNA的组合，并将它们用于本发明的方法。 申请人:在W02006/046148中描述了合适的 dsRNA核巧酸和dsRNA构建体，该文献W其全文引入本文。
[0160] 术语"击中"及其各种时态形式是表示dsRNA的至少一条链与祀基因或核巧酸序 列互补（W及从而可W结合）的替换性措辞方式。
[0161] dsRNA的调节作用可应用于有害生物中表达的多种基因，例如，负责细胞代谢或细 胞转化的内源基因，包括持家基因、转录因子和编码涉及细胞代谢的多肤的其它基因。
[0162] 在本文中使用时，短语"对基因表达的抑制"或"抑制祀基因在有害生物细胞中的 表达"指来自所述祀基因的mRNA产物和/或蛋白质水平不存在（或可观察到的减少）。特 异性指能抑制祀基因但不会对细胞的其它基因造成影响W及不会对产生所述dsRNA分子 的细胞中的任何基因造成任何影响的能力。对祀基因在昆虫有害生物中的基因表达的抑制 可能导致昆虫有害生物中产生新的表型性状。
[0163] "基因遏制"指用于降低基因转录为mRNA的水平和/或随后mRNA的翻译水平的任 何公知方法。基因遏制还意欲表示来自基因或编码序列的蛋白质表达的降低，该包括转录 后基因遏制和转录遏制。转录后基因遏制由从被祀向遏制的基因或编码序列转录来的mRNA 的全部或部分与相应的用于遏制的双链RNA之间的同源性介导，其指细胞中可获得来与核 糖体结合的mRNA可获得的量的充分并且可测量到的降低。转录的RNA可W是正义向的，实 现所谓的共遏制，或者是反义向的，实现所谓的反义遏制，或者是双向的，产生dsRNA，实现 所谓的RNA干扰（RNAi)D
[0164] 转录遏制由细胞中dsRNA基因遏制剂的存在介导，所述遏制剂展示出与启动子 DNA序列或其互补序列的充分序列同一性，W实现被称为启动子反式遏制的效果。基因遏 制可对与性状相关的天然植物基因有效，例如，提供给植物降低的蛋白质（天然基因编码 的）水平，或增强或降低的受影响代谢物水平。基因遏制还可对植物的下述有害生物中的 祀基因有效，所述有害生物可摄入或接触含有基因遏制剂的植物材料，所述基因遏制剂具 体地设计用来抑制或遏制在有害生物细胞中一种或多种同源或互补序列的表达。在美国专 利 No. 5, 107, 065、5, 759, 829、5, 283, 184 和 5, 231,020 中公开了反义或正义方向的 RNA 进 行的转录后基因遏制，W调控植物细胞中的基因表达。在WO 99/53050、W0 99/49029、美国 专利申请公开No. 2003/0175965和2003/0061626、美国专利申请No. 10/465, 800和美国专 利No. 6, 506, 559和6, 326, 193中，公开了 dsRNA在植物中遏制基因的用途。
[0165] 在植物中进行转录后基因遏制的有益方法既利用了正义方向也利用了反义方向 的转录RNA，它们作为例如发夹和茎和环结构是稳定的。用于实现转录后基因遏制的优选 DNA构建体是该样的；其中，第一片断编码展示出反义方向的RNA，其展示出与被祀向遏制 的基因片断的充分同一性，其与正义方向的第二片断相连，所述第二片断编码展示出与第 一片断充分互补的RNA。此类构建体通过第一片断与第二片断的杂交W及来自连接两条片 断的核巧酸序列的环结构形成茎环结构（见，W094/01550、W098/05770、US 2002/0048814 和 S 2003/0018993)。
[0166] 根据本发明的一种实施方案中，提供了下述核巧酸序列，其体外表达导致下述 dsRNA序列的转录，所述dsRNA序列与有害生物中被祀向基因的RNA分子充分同源，所述有 害生物包含有害生物基因组中核巧酸序列编码的RNA序列。因此，在有害生物摄入或吸收 惨入膳食中或喷雾到植物表面上的dsRNA序列后，就实现了对应于祀有害生物细胞中祀基 因的核巧酸序列下调。
[0167] 使用本发明的dsRNA技术对祀基因的抑制是序列特异性的，因为对应于RNA的双 链体区域的核巧酸序列被祀向进行遗传抑制。对于抑制而言，含有与祀基因的一部分相同 的核巧酸序列的RNA是优选的。相对于祀序列而言具有插入、缺失和单点突变的RNA序列 也被认为是有效于抑制的。在对本发明的实施中，优选地，抑制性dsRNA和祀基因的部分 至少享有大约80%的序列同一性，或者大约85%的序列同一性，或者大约90%的序列同一 性，或者大约95 %的序列同一性，或者大约99 %的序列同一性或者甚至大约100 %的序列 同一性。或者，可将RNA的双链体区域功能性定义为：能与祀基因转录本的一部分杂交的核 巧酸序列。展示出更高同源性但短于全长的序列能够抵补较长但同源性较少的序列。相同 核巧酸序列的长度可W为至少大约25、50、100、200、300、400、500或者至少大约1000个碱 基。通常，应当使用超过20-100个核巧酸的序列，虽然超过大约200-300个核巧酸的序列 将是优选的，并且超过大约500-1000个核巧酸的序列将是尤其优选的，该取决于祀基因的 大小。本发明具有如下优点；能耐受可能由于遗传突变、株系多态性或进化趋异性预期的序 列变异。相对于祀基因的初级转录产物或经完全加工的mRNA来说，引入的核酸分子可W无 需是绝对同源的，可W无需是全长的。因此，本领域技术人员需要认识到，如本文所公开的， 为实践本发明，RNA和祀基因之间无需100%的序列同一性。
[016引 IV.制备dsRNA的方法
[0169] 可体内或体外合成dsRNA分子。可通过单条自身互补的RNA链或从两条互补的RNA 链来形成dsRNA。细胞的内源RNA聚合酶可介导体内转录，或者，可用克隆的RNA聚合酶来 用于体内或体外转录。可通过在器官、组织或细胞类型中的特异性转录；环境条件（例如， 感染、胁迫、温度、化学诱导物）的刺激；和/或在发育期或年龄的工程转录（engineering transcription)来祀向抑制。RNA链可被聚腺巧酸化或者可不被聚腺巧酸化；RNA链可W 能够通过细胞的翻译设备翻译为多肤，或者可W不能该样。
[0170] 本领域技术人员可通过人工或自动反应W化学或酶促方式产生本发明的RNA、 dsRNA、siRNA或miRNA，或在另一生物体中体内产生。还可通过部分或全部的有机合成来产 生RNA ;可W通过体外酶促或有机合成引入任何经修饰的核糖核巧酸。可通过细胞RNA聚 合酶或瞻菌体RNA聚合酶（例如，T3、T7、SP6)来合成RNA。表达构建体的使用和产生都是 本领域已知的（见，例如，WO 97/32016 ;美国专利 No. 5, 593, 874、5, 698, 425、5, 712, 135、 5, 789, 214和5, 804, 693)。如果RNA是通过化学合成或者通过体外酶促合成的话，那么可 在引入细胞之前对RNA进行纯化。例如，可使用溶剂或树脂萃取、沉淀、电泳、色谱或其组合 从混合物中纯化出RNA。可选地，可在不纯化或尽量少纯化的条件下使用RNA，W避免由于 样品加工造成的损失。RNA可被干燥用于胆存，或者可溶解于水溶液中。溶液可含有缓冲液 或盐，W促进双链体的退火和/或稳定。
[0171] V.多核巧酸序列
[0172] 根据本发明提供了下述核巧酸序列，其表达产生了与有害生物中被祀向基因的 RNA分子（包含有害生物基因组中核巧酸序列编码的RNA序列）充分同源的RNA序列。因 此，dsRNA序列被摄入后，可获得对有害生物细胞中祀基因的核巧酸序列的下调，该导致对 有害生物的保持、生存能力、增殖、繁殖和侵袭来说有害的影响。
[0173] 本文示出的每条"核巧酸序列"都表示为脱氧核糖核巧酸（缩写为A、G、C和T)序 列。但是，核酸分子或多核巧酸的"核巧酸序列"对于RNA分子或多核巧酸而言表示脱氧核 糖核巧酸的序列，但是对于RNA分子或多核巧酸而言，其表示相应的核糖核巧酸（A、G、C和 U)的序列，其中，给定的脱氧核巧酸序列中的每个胸巧脱氧核巧酸（T)被核糖核巧酸尿巧 扣）替换。
[0174] 在本文中使用时，"核酸"表示从5'到3'末端阅读的脱氧核糖核巧酸或核糖核巧 酸碱基的单链或双链聚合物。任选地，核酸还可含有下述非天然存在的核巧酸碱基或改变 的核巧酸碱基，其允许聚合酶的正确连读，并且不会降低所述核酸编码的多肤的表达。"核 巧酸序列"或"核酸序列"既指核酸的正义链也指其反义链，并且无论是单个单链状态或处 于双链体中的。
[0175] 术语"核糖核酸"（RNA)包括RNAi (抑制性RNA)、dsRNA (双链RNA)、SiRNA (小干 扰RNA)、mRNA (信使RNA)、miRNA (微小RNA)、tRNA (转移RNA，无论是否被相应的醜基化氨 基酸加上电荷或卸掉电荷）和CRNA (互补RNA)，术语"脱氧核糖核酸"值NA)包括CDNA和 基因组DNA和DNA-RNA杂交体。
[0176] 本领域技术人员应当将词汇一"核酸片断"、"核巧酸片断"或更一般性的"片 断"理解为功能性术语，其包括基因组序列、核糖体RNA序列、转移RNA序列、信使RNA序列、 操纵子序列W及更小的经过改造的核巧酸序列，所述核巧酸序列表达或被改造来表达蛋白 质、多肤或肤。
[0177] 因此，本发明涉及经分离的核酸分子，其包含下述多核巧酸，所述多核巧酸具有选 自沈Q ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、 183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、 473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、 601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813" 862、 863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、 1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、 1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、 1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、 1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730" 2039、 2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、 2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、 2384 - 2460、2461、2466、2471、2476和2481的任何多核巧酸序列的序列。本发明还提供了 沈Q ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、 188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、 478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、 603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、 863、 868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、 1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、 1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、 1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、 1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、 2040、 2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、 2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：M9、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 -2460、2461、2466、2471、2476和2481的多核巧酸序列的功能性片段。本发明还提供了569 ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、 193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、 483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、 605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、 868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、 1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、1101、 1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、 1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、 1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、 2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、 2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、 2461、2466、2471、2476和2481的任何多核巧酸序列的互补核酸或其片段，W及包含至少 15 个连续碱基的核酸，其与 SEQ ID NO:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、 160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、 255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、 576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、 797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、 1046、1051、1056、1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091、 1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、 1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、 1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、 1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、 2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、2354、2359、2364、2366、 2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 的任何多核巧酸序列杂交。 [017引 本发明还提供了本发明的 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、 49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、 249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、 521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、 783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046、1051'1056、1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 的多 核巧酸序列的直向同源物序列及其互补序列和片段。因此，本发明包括下述祀基因，它们是 包含下述核巧酸序列的基因的昆虫直向同源物，所述核巧酸序列如SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、 11、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、 215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、 503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621" 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 -862、863、868、873、878、883、888、 890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、 1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、1101'1103、1105、1107、1109、 1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、 1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、 1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、 2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、 2：344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481中任何所示。举例而言，昆虫直向同源物可包含SEQ ID N0:49-123、275-434、533-562、 621-738、813-852、908-1010、1161-1437、1730-1987、2120-2290、2384-2438 中任何所示的 核巧酸序列，或其至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核巧酸的片段。包 含本发明的序列之一的至少巧bp(优选至少17bp)片段的、昆虫或蛛形纲直向同源物基因 或序列的非限制性列表在表4中给出。
[0179] 本发明还包括下述祀基因，它们是包含下述核巧酸序列的基因的线虫直向同 源物，所述核巧酸序列如本发明的任何SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、 49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、 249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、 521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、 783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046、1051'1056、1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1妨7、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中所 示。举例而言，线虫直向同源物可包含本发明的SEQ ID N0s:124-135、435-446、563、564、 739-751、853、854、1011-1025、1438-1473、1988-2001、2291-2298、2439-2440 中任何所示的 核巧酸序列，或者其至少15、16、17、18、19、20或21个核巧酸的片段。根据另一方面，本发明 由此包括本文所述的、用于控制生物体中线虫生长或者用于防止线虫侵袭对线虫感染易感 的生物体的任何方法，所述方法包括：将线虫细胞与下述双链RNA相接触，其中，所述双链 RNA包含退火的互补链，其中之一具有与下述祀基因的核巧酸序列的至少一部分互补的核 巧酸序列，所述祀基因包含 SEQ ID N0s:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、 160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、 255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、 576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、 797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、 1046、1051'1056、1061、1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091、 1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、 1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、 1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、 1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、 2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、 2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 所示的任何序列的至少 17、 18、19、20或21个核巧酸的片段，由此，所述双链RNA被真菌摄取，并由此控制了生长或防 止了侵袭。本发明还涉及线虫抗性转基因植物，其包含SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、 17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、 225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、 515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、 773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、 894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 所示 的任何序列的至少17、18、19、20或21个核巧酸的片段。包含本发明的序列之一的至少 巧bp(优选至少17bp)的片段的、线虫直向同源物基因或序列的非限制性列表在表5中给 出。
[0180] 根据另一实施方案，本发明包括下述祀基因，它们是包含下述核巧酸序列的基因 的真菌直向同源物，所述核巧酸序列如本发明的SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、 230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、 517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、 778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046、1051'1056、1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中 任何所示。举例而言，真菌直向同源物可包含SEQ ID N0:136-158、447-472、565-575、 752-767、855-862、1026-1040、1474-1571、2002-2039、2299-2338、2441-2460 中任何序列 所示的核巧酸序列，或者其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核巧酸的片段。 根据另一方面，本发明由此包括本文所述的、用于控制细胞或生物体上真菌生长或者用于 防止真菌侵袭对真菌感染易感的细胞或生物体的任何方法，所述方法包括；将真菌细胞与 下述双链RNA相接触，其中，所述双链RNA包含退火的互补链，其中之一具有与下述祀基因 的核巧酸序列的至少一部分互补的核巧酸序列，所述祀基因包含SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、 11、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、 215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、 503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、 890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、 1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、I101、I103、1105、I107、I109、 1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、 1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、 1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、 2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、 2：M4、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481所示的任何序列的至少17、18、19、20或21个核巧酸的片段，由此，所述双链RNA被真 菌摄取，并由此控制了生长或防止了侵袭。本发明还涉及真菌抗性转基因植物，其包含SEQ ID NO:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、 193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、 483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、 605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、 868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、 1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、1097、1099、1101、 1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、 1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、 1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、 2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、 2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、 2461、2466、2471、2476和2481所示的任何序列的至少17、18、19、20或21个的片段。包含 本发明的序列之一的至少15bp(优选至少nbp)的片段的、真菌直向同源物基因或序列的 非限制性列表在表6中给出。
[01引]在又一实施方案中，本发明的dsRNA分子包含SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、 17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、 225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、 515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、 773、778、783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、 894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中的 任何序列，虽然 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、163、 168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、 259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、 586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、 80U813 -862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、 1056、1061、1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091'1093、1095、 1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、 1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、 1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、 1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、 2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2：344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、 2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476和2481中示出的序列是非限制性的。本发明的 dsRNA分子可包含来自有害生物物种的任何连续的祀基因（例如，大约15至大约25或更 多，或大约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25或更多个连续的核巧酸）。
[0182]"经分离的"核酸分子表示已从其天然环境移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，就 本发明的目的而言，DNA构建体中含有的重组DNA分子就被认为是经分离的。经分离的DNA 分子的另外实例包括在异源宿主细胞中保持的重组DNA分子，或溶液中经（部分或充分） 纯化的DNA分子。经分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体外RNA转录本。根据本发 明，经分离的核酸分子还包括合成生产的那些分子。
[018引本发明的核酸分子可W是RNA(例如mRNA)的形式或DNA的形式，包括，例如，cDNA 或基因组DNA，它们是通过克隆获得的或合成产生的。DNA或RNA可W是双链或单链的。单 链DNA可W是编码链，其也被称为正义链，或者其可W是非编码链，该也被称为反义链。
[0184] VI.序列分析
[0185] 除非另有指明，本文中通过对DNA分子进行测序测定的所有核巧酸序列都是用自 动DNA测序仪（例如来自应用生物系统公司（Applied Biosystems, Inc.)的373型）测定 的。因此，如本领域中关于通过该自动手段测定的任何DNA序列而言已知的那样，本文测定 的任何核巧酸序列可能含有一些错误。通常，通过自动方法测定的核巧酸序列与被测序DNA 分子的实际核巧酸序列有至少大约95%同一，更通常，至少大约96%至至少大约99. 9%同 一。可W通过本领域公知的其它手段，包括手动DNA测序法，来更为精确地测定实际序列。 如本领域中还已知的那样，测定的核巧酸序列中较之实际序列的单个插入或缺失将引起在 核巧酸序列翻译中移码，从而，测定的核巧酸序列编码的预测氨基酸序列可能从此类插入 或缺失之处开始与被测序DNA分子实际编码的氨基酸序列完全不同。
[0186] 在另一方面，本发明提供了经分离的核酸分子，其包含在严格杂交条件下与上文 所述的本发明核酸分子中多核巧酸的一部分杂交的多核巧酸。与多核巧酸的"一部分"杂 交的多核巧酸意指：与参照多核巧酸的至少大约15个核巧酸，更优选地，至少大约20个核 巧酸，仍更优选地，至少大约30个核巧酸，甚至更优选地，超过30个核巧酸杂交的多核巧 酸值NA或RNA)。与参照片段杂交的该些片段可用作为诊断探针和引物。就本发明的目的 而言，当两条序列能在6XSSC，0. 5% SDS，5XDenhar化'S溶液和IOOy g非特异性运载体 (Carrier)DNA的杂交溶液中形成双链复合体时，那么两条序列就是能杂交的。见，Ausubel 等人，2. 9部分，supplement增刊27(1994)。序列可在"中等严格度"下杂交，其被定义为： 在6XSSC，0. 5% SDS，5XDenhar化'S溶液和IOOyg非特异性载体DNA的杂交溶液中，温 度为6(TC。对"高严格度"杂交而言，温度增加至68°C。中等严格度杂交反应之后，于室 温下，在2XSSC加0.05% SDS中的溶液中对核巧酸洗涂5次，随后在6(TC用0. IXSSC加 0. 1% SDS洗1小时。对于高严格度而言，洗涂温度增加至68C。就本发明的目的而言，杂 交的核巧酸是使用Ing具有10, OOOcpm/ng的特异放射性的经放射标记的探针探测到的那 些，其中，在-7(TC暴露给X-射线胶片不超过72小时后，杂交的核巧酸清晰可见。
[0187] 本申请涉及下述核酸分子，它们与 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、 23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、 247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、 519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、 783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896'908-1040、1041'1046、1051'1056'1061'1071'1073'1075'1077'1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 中任 何序列所示的核酸序列至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、99% 或 100% 同一。但是，优选的是与 SEQ ID N0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、 23、49 - 158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、 247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、 519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、 783、788、793、795、797、799、801、813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、 896、908-1040、1041'1046、1051'1056、1061'1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、 1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、 1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、 1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、 2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2349、 2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 所示 的核酸序列至少95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %同一的核酸分子。两条核酸序列间的 差异可能发生于参照核巧酸序列的5'或3'末端的位置，或者该些末端位置之间的任何地 方，它们可W各自单独地散布于参照序列的核巧酸中，或者散布在参照序列中的一个或多 个连续的组中。
[0188] 在实践方面而言，任何特定核酸分子是否与参照核巧酸序列至少95%、96 %、 97%、98%或99%同一是指使用本领域公知的标准算法在两个分子间进行的比较，该可W 使用公众可获得的计算机程序，例如BLASTN算法方便地测定。见，Altschul等人，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997)。
[0189] 在本发明的一种实施方案中，核酸包含具有大约15至大约30(例如，大约15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)个核巧酸的反义链，其中，所述反义链 与编码下述蛋白质的RNA序列或其一部分互补，所述蛋白质能控制细胞周期或同源重组， 并且，其中，所述SiNA还包含具有大约15至大约30(例如，大约15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29或30)个核巧酸的正义链，并且，其中，所述正义链和所述反义 链是不同的核巧酸序列，其中，每条链中至少大约15个核巧酸与另一条链互补。
[0190] 在一种实施方案中，本发明提供了能介导RNA干扰基因沉默的双链核酸分子。在 另一实施方案中，本发明的SiNA分子由下述双链体核酸分子构成，所述核酸分子在包含大 约 15 至大约 30(例如，大约 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)个核 巧酸的寡核巧酸之间含有大约15至大约30个碱基对。在再一实施方案中，本发明的SiNA 分子包含具有大约1至大约32 (例如，大约1、2或3)个核巧酸的突出末端的双链体核酸分 子，例如，大约21-核巧酸双链体，其具有大约19个碱基对和3'端单核巧酸、二核巧酸或H 核巧酸突出端。在再一实施方案中，本发明的SiNA分子包含具有平端的双链体核酸分子， 其中两端均是平端，或者可选地，其末端之一是平末端。
[01W] 本发明的SiNA分子可包含经修饰的核巧酸，并且同时保留介导RNAi的能力。经 修饰的核巧酸可用于改善体外或体内特征，例如，稳定性、活性和/或生物利用性。例如，本 发明的SiNA分子可包含占SiNA分子中存在的核巧酸总数百分比的经修饰核巧酸。同样 地，一般而言，本发明的SiNA分子可包含大约5%至大约100%的经修饰核巧酸（例如，大 约 5%、10%'15%'20%'25%'30%'35%'40%'45%'50%'55%'60%'65%'70%'75%、 80%、85%、90%、95%或100%的经修饰核巧酸）。给定的31臟分子中存在的经修饰核巧 酸的实际百分比将取决于SiNA中存在的核巧酸的总数。如果SiNA分子是单链的，那么百 分比修饰可基于单链SiNA分子中存在的核巧酸的总数。类似地，如果SiNA分子是双链的， 那么，百分比修饰可基于正义链、反义链或正义和反义两条链中存在的核巧酸的总数。
[0192] VII.核酸构建体
[0193] 重组核酸载体，可W例如是线性质粒或闭合环状质粒。载体系统可W是单个载 体或质粒或一起含有将引入细菌宿主基因组中的全部核酸的两个或多个载体或质粒。此 夕F，细菌载体可W是表达载体。例如，可在合适启动子的控制下，将SEQ ID NO: 1、3、5、7、 9、11、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、161、162、163、168、173、178、183、188、193、 198、203、208、215、220、225、230、240 - 246、247、249、251、253、255、257、259、275-472、 473、478、483、488、493、498、503、508-512、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、 591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、 813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、 1056、1061、1066-1070、1071'1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091、 1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571'1572、1577、 1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、 1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、 1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、 2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2：344、2349、2354、2359、2364、2366、 2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481 示出的核酸分子或其片段适 当地插入载体，所述启动子在一种或多种微生物宿主中发挥作用，W驱动所连的编码序列 或其它DM序列的表达。就此目的而言，很多种载体都是可获得的，对合适的载体的选择主 要取决于将插入载体的核酸的大小W及将用载体转化的特定宿主细胞。每种载体都含有多 种组分，该取决于其功能（扩增DNA或表达DNA)和与其相容的特定宿主细胞。对于细菌转 化而言，载体组分通常包括但不限于下述中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多 种可选择标记基因和诱导型启动子，W允许外源DNA的表达。
[0194] 启动子
[0195] 提到调控序列和结构核巧酸序列时使用的"有效地连接"表示，调控序列能使得所 连接的结构核巧酸序列受调控表达。"调控序列"或"控制元件"指位于结构核巧酸序列上 游保非编码序列）、内部或下游保非翻译序列）的核巧酸序列，其能影响转录的时间选 择和水平或量、RNA加工或稳定性或相关联的结构核巧酸序列的翻译。调控序列可包括启动 子、翻译前导序列、内含子、增强子、茎环结构、阻抑物结合序列和聚腺巧酸化识别序列等。
[0196] 用于生产mRNA的表达载体还可含有诱导型启动子，其可被宿主细菌生物体 识别，并且其与感兴趣的核酸有效地连接，所述核酸编码，例如，编码玉米根蛮叶甲 (D. V. virgifera)mRNA的核酸分子或其片段。适用于细菌宿主的诱导型启动子包括：目-内 醜胺酶启动子、大肠杆菌A瞻菌体化和PR启动子和大肠杆菌半乳糖启动子、阿拉伯糖启 动子、碱性磯酸酶启动子、色氨酸（trp)启动子和乳糖操纵子启动子及其变异W及杂合启 动子，例如tac启动子。但是，已知的其它细菌诱导型启动子也是合适的。
[0197] 本发明包括在不同植物物种中具有功能的启动子。可用于在植物中表达多肤的 启动子包括；如Odell等人（1985)所述的，诱导型启动子、病毒启动子、合成启动子或组 成型启动子，和/或受时间调控、受空间调控和受时空调控的启动子。优选的启动子包括 增强的CaMV35S启动子和FMV35S启动子。就本发明的目的而言，例如，为了对W根为食的 物种进行最优控制，实现该些基因在植物根中的最高水平表达可能是优选的。大量的根增 强启动子已得到鉴定，它们是本领域中已知的（Lu等人，2000、美国专利No. 5, 837, 848和 6, 489, 542)。
[0198] 在一种实施方案中，植物转化载体包含经分离的和经纯化的DNA分子，其包含与 本发明的一条或多条核巧酸序列有效地连接的启动子。所述核巧酸序列选自SEQ ID N0:1、 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49 - 158、159、160、161、162、163、168、173、178、183、188、 193、198、203、208、215、220、225、230、240 - 246、247、249、251、253、255、257、259、275-472、 473、478、483、488、493、498、503、508-512、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、 591、596、601、603、605、607、609、621 - 767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、 813 - 862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、 1056、1061、1066-1070、1071、1073、1075、1077、1079、1081'1083、1085、1087、1089、1091、 1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、 1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、 1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、 1702、1704、1730 - 2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、 2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120 - 2338、2339、2344、2：349、2354、2359、2364、2366、 2368、2370、2372、2384 - 2460、2461、2466、2471、2476 和 2481。所述核巧酸序列包括编码被 祀向的有害生物RNA转录本中存在的RNA的全部或部分的片断，并且可W包含被祀向的有 害生物RNA全部或部分的倒置重复序列。包含表达载体的DNA分子还可含有位于编码序列 上游或者甚至位于编码序列内部的功能性内含子序列，并且还可含有位于启动子和翻译起 始点之间的5撇巧'）非翻译前导序列（即，UTR或5' -UTR)。
[0199] 可选择标记基因
[0200] 通常，本发明的重组DNA载体或构建体将包含可选择标记，其赋予植物细胞可选 择的表型。可选择标记还可用于选出含有编码本发明的多肤或蛋白质的外源核酸的植物 或植物细胞。所述标记可编码杀生物剂抗性、抗生素抗性（例如，卡那霉素、G418、博来霉 素、潮霉素等）或除草剂抗性（例如，草甘麟等）。可选择标记的实例包括但不限于：neo 基因，其编码卡那霉素抗性，可使用卡那霉素、G418等来加W选择；bar基因，其编码双丙氨 麟抗性；突变EPSP合酶基因，其编码草甘麟抗性；膳水解酶基因，其赋予对漠苯膳的抗性； 突变己醜乳酸合酶基因（ALS)，其赋予对咪哇晰丽类和賴醜脈类的抗性；W及氨甲蝶岭抗 性的DHFR基因。此类可选择标记的实例在美国专利5, 550, 318、5, 633, 435、5, 780, 708和 6, 118,047中有所阐述。
[0201] 本发明的重组载体或构建体还可包括可筛选标记。可筛选标记可用于监测表达。 示例性的可筛选标记包括；目-葡糖酵酸糖巧酶或UidA基因佑U巧，已知有多种显色底物可 用于其编码的酶（Jefferson, 1987 Jefferson等人，1987) ;R-基因座基因，其编码的产物 调控植物组织中花色素巧色素（红色）的产生值ellaporta等人，1988);目-内醜胺酶基 因（Sutcliffe等人，1978)，已知有多种显色底物可用于该基因编码的酶（例如，PADAC，显 色的头抱菌素）；英光素酶基因（Ow等人，1986) ;xy化基因狂Ukowsky等人，1983)，其编码 儿茶酷加双氧酶，该酶可转化显色的儿茶酷；a-淀粉酶基因（Ika化等人，1990);酪氨酸 酶基因化atz等人，1983)，其编码能将酪氨酸氧化为DOPA和多己酿（进而缩合为黑色素） 的酶；和a -半乳糖巧酶，其催化显色的a -半乳糖底物。
[0202] 优选的植物转化载体包括源自根癌农杆菌的Ti质粒的那些（例如，美国专利 齡.4,536,475、4,693,977、4,886,937、5,501，967和6? 0 122 791)。发根农杆菌质粒（或 "化"）也可使用，其也是本领域已知的。其它优选的植物转化载体包括公开的那些，例如， Herrera-Estrella(1983)、Bevan(1983)、Klee(1985)和 EP 0 120 516 公开的。
[0203] 一般而言，优选将功能性重组DNA引入到植物基因组的非特异性位置上。在特定 的情况下，通过位点特异性整合来插入重组DNA构建体可能是有用的。存在若干种已知能 使植入物发挥功能的位点特异性重组系统，包括美国专利4, 959, 317公开的cre-lox和美 国专利5, 527, 695公开的FLP-FRT。
[0204] 可使用本领域中可获得的方法，来容易地制备转化载体。转化载体包含一种或多 种下述核巧酸序列，所述序列能被转录为RNA分子并且与昆虫基因组编码的一种或多种核 巧酸序列充分同源和/或互补，从而，吸收所述RNA后，昆虫基因组中分别的核巧酸序列中 的至少一种的表达被下调。
[0205] 植物转化载体可含有来自多于一个基因的序列，由此允许产生多于一种dsRNA， W抑制祀有害生物细胞中两种或多种基因的表达。本领域技术人员将容易认识到；其序 列对应于不同基因中存在的序列的DNA片断可被组合为单个复合DNA片断，用于在转基因 植物中表达。可选地，可通过在增强子和启动子和终止子序列之间顺序插入额外的DNA片 断，来修饰本发明的已经含有至少一种DNA片断的质粒。在设计来抑制多种基因的本发明 的昆虫控制剂中，将被抑制的基因可W从相同的昆虫物种获得，W增强昆虫控制剂的有效 性。在某些实施方案中，基因可源自不同的昆虫，W拓宽所述剂有效的昆虫范围。当为了 遏制或为了表达和遏制的组合祀向了多种基因时，可按照Fillatti,申请公开文本No. US 2004-0029283的阐述和公开，来构造多顺反子DNA元件。
[0206] 转化载体可被称为dsDNA构建体，其还可被界定为重组分子、昆虫控制剂、遗传分 子或嵌合遗传构建体。本发明的嵌合遗传构建体可包含，例如，核巧酸序列，其编码一种或 多种反义转录本、一种或多种正义转录本、一种或多种前述每种，其中，转录本的全部或部 分与下述RNA分子的全部或部分同源，所述RNA分子包含昆虫基因组中的核巧酸序列编码 的RNA序列。
[0207] VIII.用于遗传工程改造的植物
[020引"植物"是植物界的多种光合、真核、多细胞生物中的任何生物，其特征性地产生 胚，含有叶绿体并且具有纤维素细胞壁。可根据本发明的方法，对植物的一部分，目r植物组 织巧日W处理，W产生转基因植物。可根据本发明，来转化很多合适的植物组织，其包括但不 限于；体细胞胚、花粉、叶、茎、愈伤组织、甸旬茎、微块茎和枝条。
[0209] 因此，本发明包括对被子植物和裸子植物的转化，所述植物例如，金合欢、首荐、苹 果、杏、朝鲜葫、白蜡树、天n冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、禅木、山毛棒、黑霉、蓝霉、挪 菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝K木墓、花挪菜、雪松、谷类、芹菜、栗、禮、大白 菜、巧橘、克莱口氏小巧橘、H叶草、咖啡、谷物、棉、班豆、黄瓜、柏木、茄子、偷、宦卖菜、按 树、茵香、无花果、冷杉、老鹤草、葡萄、葡萄抽、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衣甘蓝、 縣猴桃、孽蓝、落叶松、窝宦、韭葱、削i、来樣、洋槐、松、铁线藤、玉米、芒果、械树、瓜、泰、磨 茹、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、枯、观赏植物或花或树、番木瓜、踪搁、欧芹、欧洲防风 草、魏豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石恼、马铃墓、西葫 芦、菊宦、萝K油菜、息钩子、稻、黑麦、高梁、柳树、大豆、玻菜、云杉、南瓜、草霉、糖萝K甘 藏、向日葵、甘墓、甜玉米、红枯、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、宪青、蔓生植物、核桃、 豆瓣菜、西瓜、小麦、墓葫、红豆杉和夏南瓜。
[0210] 根据本发明，"植物组织"还包括植物细胞。植物细胞包括息浮培养物、脱腑体、胚、 分生组织区域、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、抱子体、花粉、种子和小抱子。植物组织可W 是多种成熟阶段的，其可生长于液体或固体培养物中，或者生长于罐、温室或田间的±壤或 合适的培养基中。植物组织还可指此类植物、种子、子代、繁殖体（无论有性还是无性产生 的）W及任何该些的后续传代物（例如枝条或种子）的任何克隆。
[0211] 本发明的"子代"，例如，转基因植物的子代，是由植物或转基因植物作为母本或父 本产生的或源自其的子代。因此，"子代"植物，即"F1"代植物是本发明的方法产生的转基 因植物的后裔或后代。转基因植物的子代可在其至少一个、一些或全部的细胞基因组中含 有通过本文所述的方法整合进亲本转基因植物细胞的想要的多核巧酸。因此，想要的多核 巧酸被子代植物"传递"或"遗传"。由此在子代植物中遗传的想要的多核巧酸可处于T-DNA 构建体中，所述构建体也从其亲本通过子代植物遗传。本文中使用的术语"子代"还可被认 为是一组植物的后裔或后代。
[0212] "种子"可被认为是成熟的植物胚珠（含胚）W及植物的繁殖部分，例如块茎或抱 子。可在农杆菌介导的转化之前，在黑暗中对种子进行赔育，例如W促进萌发。还可在赔育 之前对种子灭菌，例如通过用漂白剂简单处理。然后可将得到的幼苗暴露给想要的农杆菌 属菌株或者其它合适的细菌，W进行转化。
[0213] 本发明还涉及本文所述的方法，其中，所述昆虫是马铃墓叶甲（马铃墓甲虫），所 述植物是马铃墓、茄子、番茄、胡椒、烟草、酸浆或稻、谷物或棉。
[0214] 本发明还涉及本文所述的方法，其中，所述昆虫是辣根猿叶甲（白芥叶甲虫），所 述植物是芥末、大白菜、宪青叶（turnip greens)、绿色芥蓝菜（collard greens)或白菜。
[0215] 本发明还涉及本文所述的方法，其中，所述昆虫是墨西哥豆瓢虫（墨西哥豆甲）， 所述植物是菜豆、芸豆、四季豆、食芙菜豆、利马豆、绿豆、青豆、牛眼豆、绒毛豆（velvet bean)、大豆、班豆、木豆、H叶草或首荐。
[0216] 本发明还涉及本文所述的方法，其中，所述昆虫是墨西哥棉铃象（棉铃象虫甲）， 所述植物是棉。
[0217] 本发明还涉及本文所述的方法，其中，所述昆虫是赤拟谷盗（赤拟谷盗），所述植 物是胆藏谷类（grain)产品，例如，面粉、谷物、餐食、饼干、豆类、香料、食用面食、蛋糕混合 料、干宠物食品、干花、巧克力、坚果、种子甚至干的博物馆标本。
[021引本发明还涉及本文所述的方法，其中，所述昆虫是桃闽（桃闽），所述植物是树， 例如李属（Prunus),特别是桃、杏和李；茄科（Solanaceae)、黎科（Chenopodiaceae)、菊科 (Compositae)、十字花科（Cruciferae)和葫芦科（Qicurbitaceae)的蔬菜作物，其包括但 不限于，朝鲜葫、天口冬、菜豆、甜菜、挪菜、抱子甘蓝、甘蓝、胡萝K花挪菜、甜瓜、芹菜、谷 物、黄瓜、茵香、羽衣甘蓝、孽蓝、宪青、茄子、窝宦、白芥、秋葵、欧芹、欧洲防风草、魏豆、胡 椒、马铃墓、萝K玻菜、南瓜、番茄、宪青、豆瓣菜和西瓜；田间作物，例如但不限于，烟草、糖 萝h和向日葵；花弁作物或其它装饰植物。
[0219] 本发明还涉及本文所述的方法，其中，所述昆虫是褐飞風，所述植物是稻种n。
[0220] 本发明还涉及本文所述的方法，其中，所述昆虫是二化頓（稻二化頓），所述植物 是稻植物、大麦、高梁、玉米、小麦或草。
[0221] 本发明还涉及本文所述的方法，其中，所述昆虫是菜蛾（菜蛾），所述植物是芸苔 属炬rassica)物种，其例如但不限于，甘蓝、大白菜、抱子甘蓝、羽衣甘蓝、油菜、挪菜、花挪 菜、宪青、白芥或萝h。
[0222] 本发明还涉及下述本文所述的方法，其中，所述昆虫是居屋艾幡（家幡蜂），所述 植物是本文所述的任何植物或任何有机物质。
[0223] IX.用于遗传工程的方法
[0224] 本发明包括将核巧酸序列引入植物，W使得一种或多种dsRNA分子W能抑制有害 生物的水平表达。可通过本领域已知用来将重组序列引入祀宿主细胞的标准流程，来将本 发明的多核巧酸和多肤引入宿主植物细胞。此类流程包括但不限于：转染、感染、转化、天 然摄取、磯酸巧、电穿孔、显微注射生物射弹和微生物介导的转化方案。见，例如，Miki等 人，1993, "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants", In:Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick 和 Thompson,编著，CRC Press, Inc. , Boca Raton, pages 67-88。选用的方法随宿主植物而变化。
[0225] 微生物介导的基因转移指使用微生物将外源基因引入宿主植物。虽然农杆菌属 Olorsch等人，Science 227:1229-31,1985)已广泛用于将基因转移进植物，但是其并非唯 一的能转化植物的细菌。例如，已经显示，除农杆菌属之外的若干细菌物种可被修饰，W介 导基因转移进不同的植物。来自两个科H个属的细菌--根瘤菌属物种巧hizobium SP.) NGR234、首荐中华根瘤菌和百脉根生慢生根瘤菌可通过获得卸甲Ti质粒和二元载体而能 进行基因转移。化OOthaedSiW.等人化Uire Feb 10, 433(7026) :629-633(2005)。使用叶 盘、源自盾片的愈伤组织或浸花法（floral dip),用该些非农杆菌属物种，实现了对H种植 物物种一烟草、稻和拟南芥的稳定转化。因此，当携带有卸甲Ti质粒和二元载体（或推 测来说，共整合或整个Ti质粒）时，与不同植物相关联的细菌能够易于向植物转移T-DNA， 其可根据本发明使用。
[0226] 本发明的转基因植物是该样的植物，其包含其中已稳定整合了外源核酸的至少一 个细胞基因组。根据本发明，转基因植物是包含仅一个经遗传修饰的细胞和细胞基因组的 植物，或者是包含一些经遗传修饰的细胞的植物，或者是其中所有细胞都被遗传修饰的植 物。本发明的转基因植物可W是包含想要的多核巧酸（即，外源核酸）在植物的仅某些部 分表达的植物。因此，转基因可W仅在其结构的某些部分包含经遗传修饰的细胞。
[0227] 用于产生转基因植物W及在植物中表达异源核酸的方法是特别已知的，其可与本 文提供的核酸一起使用，W制备展示出对祀有害生物的进食的易感性降低的转基因植物。 例如，可通过将本文公开的产生dsRNA的核酸插入植物转化载体来制备植物转化载体，并 且将它们引入植物。一种已知的载体系统源自对根癌农杆菌的天然基因转移系统的修饰。 该天然系统包含大Ti (肿瘤诱导）质粒，其中含有已知为T-DNA的大片断，其被转移进经转 化植物。Ti质粒的另一片断一Vir区域负责T-DNA转移。T-DNA区域的边界是末端重复 序列。在经修饰的二元载体中，肿瘤诱导基因已被缺失，Vir区域的功能被用来转移T-DNA 边界序列作边界的外源DNA。T-区域还可含有可选择标记（用于高效回收转基因植物和细 胞）W及多克隆位点（用于插入序列，W转移编码dsRNA的核酸）。
[022引通常，使用农杆菌属或其它微生物介导的转化方法形成的转基因植物含有插入一 个染色体中的重组核巧酸序列，其被称为转基因事件。此类转基因植物可被认为对于插入 的外源序列是杂合的。可通过将独立的分离子转基因植物自交，产生Fl种子，来获得转基 因纯合的转基因植物。产生的Fl种子中有四分之一是对于转基因而言纯合的。令Fl种子 萌发，产生植物，可针对杂合性或纯合性对该些植物加W测试，通常，使用允许区分开杂合 子和纯合子的SNP测定或热扩增测定（即，接合性测定）来进行。
[0229] 因此，本发明还提供了包含本发明的多核巧酸或多肤的植物或植物细胞。在一种 实施方案中，植物是被子植物或裸子植物。除了植物的常规含义，术语"植物"还意欲表示 植物的果实、种子、花、球花等。本发明的植物可W是直接的转染子，意思是载体直接引入植 物，例如通过农杆菌，或者，植物可W是经转染植物的子代。还可通过经转染植物的无性繁 殖来获得子代。第二代或后续世代的植物可W或可W不通过有性繁殖（即，受精）产生。此 夕F，植物可W是配子体（单倍体阶段）或抱子体（二倍体阶段）。
[0230] X.传统育种/杂交
[0231] 除了用重组核酸构建体直接转化植物之外，可W通过将具有重组核酸构建体的第 一植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可将用于基因遏制的重 组核酸引入第一植物系，其可被转化，W产生可与第二植物系杂交的转基因植物，W将用于 基因遏制的重组核酸渐渗入第二植物系。
[0232] 在雄性不育植物中表达重组核酸构建体可能是有好处的，例如作为用于降低对转 基因流向周围植物的关注的手段。
[0233] 实践中，本发明可与植物中的其它昆虫控制性状组合，W实现想要的性状，用于增 强对昆虫侵袭的控制。将利用不同作用模式的昆虫控制性状组合起来可提供被保护免受昆 虫侵袭的转基因植物，其较之携带单个昆虫控制性状的植物而言具有更好的耐久性，因为 在田间抗性发展有降低的可能性。
[0234] 某些dsRNA构建体与一种或多种有害生物控制蛋白质基因的组合可能导致协同 性，其能增强转基因植物的有害生物控制表型。利用人工膳食或整个植物组织对有害生物 进行的生物测定可用于：例如定义对使用dsRNA和有害生物控制蛋白质时幼虫死亡率或生 长抑制的剂量应答。本领域技术人员可在生物测定中对dsRNA分子和有害生物控制蛋白质 的混合物加W测试，W鉴定出活性组合，所述活性是协同的并且是在受保护免遭有害生物 侵袭的植物中配置所希望的（T油ashn化，1992)。已报道了不同昆虫控制蛋白质之间杀死有 害生物的协同性（综述见Schnepf等人，1998)。应当预见到，协同性将存在于某些dsRNA 之间，W及存在于某些dsRNA和某些昆虫控制蛋白质之间。
[0235] XI.定量对祀基因表达的抑制
[0236] 可通过测量内源祀RNA或通过祀RNA的翻译产生的蛋白质，来定量对祀基因表达 的抑制，并且可W通过检查细胞或生物的外部性质来验证抑制的结果。用于对RNA和蛋白 质进行定量的技术是本领域普通技术人员公知的。可获得赋予对氨予青霉素、博来霉素、氯 霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲蝶岭、麟丝菌素、嘿岭霉素、壮观霉素、利 福霉素和四环素等的抗性的多种可选择标记。
[0237] 在某些实施方案中，基因表达被抑制至少10 %，优选地，至少33 %，更优选地，至 少50%，还更优选地，至少80%。在本发明的特别优选的实施方案中，有害生物的细胞中， 基因表达被抑制至少80 %，更优选地，至少90 %，更优选地，至少95 %，或者至少99 %，所W 发生显著的抑制。显著的抑制意欲指该样的显著抑制，其产生可探测到的表型（例如，幼虫 生长的停止、痛疾或死亡等）或可探测到的、对应于被抑制的祀基因的RNA和/或蛋白质的 减少。虽然在本发明的某些实施方案中，抑制在昆虫的几乎所有细胞中发生，但是在其它一 些优选的实施方案中，抑制仅在表达该基因的细胞亚群中发生。例如，如果将被抑制的基因 在昆虫消化道的细胞中发挥重要作用，那么对该些细胞中基因的抑制就足W向昆虫施加有 害作用。
[023引 XII.产物
[0239] 本发明还提供了含有本发明的一种或多种序列、W及从含有一种或多种本发明核 巧酸序列的重组植物或种子生产的商品产品。含有本发明的一种或多种序列的商品产品意 欲包括但不限于；餐食、油、经磨碎的或完整的植物种粒或种子、任何食物产品（包括任何 的餐食、油或重组植物或种子的经磨碎的或完整的谷粒）或任何青胆饲料、纤维、纸或源自 含有本发明的一种或多种序列的本发明植物的其它产品。对商品产品中本发明序列的探测 提供了切实的证据：即商品包含表达本发明序列的转基因植物或其部分，所述本发明序列 使用dsRNA介导的基因遏制方法控制有害生物侵袭。
[0240] 水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水水
[0241] 下文提供了关于鉴定包含至少一种或多种双链RNA分子的祀序列，W及将所述祀 序列引入植物的方法的特定实施例，所述双链RNA分子在本文示例出，用于遏制有害生物 中重要特性或功能。它们仅作示例用，而非对本发明加W限制。
[0242] 实施例1 ;在高通量筛选中沉默漂亮新小杆线虫中的漂亮新小杆线虫祀基因
[0243] 在PGN9A载体（WO 01/88121)中制备漂亮新小杆线虫全基因组文库，其处于两个 相同的T7启动子和终止子之间，在T7聚合酶表达（被IPTG诱导）的情况下驱动其在正义 和反义方向上的表达。
[0244] 将该文库转化进96孔板形式中的细菌菌株AB301-105(DE3)中。为进行全基因组 筛选，将该些细菌细胞喂饲给核酸酶缺陷型漂亮新小杆线虫nuc-1 (el392)株系。
[0245] 按照下文所述，在96孔板形式中将细菌菌株AB301-105 (DE3)产生的dsRNA喂饲 给漂亮新小杆线虫nuc-1 (el392)虫：将nuc-1卵转移至单独的板上，令其同时在2(TC赔 化，W使得Ll世代同步。向96孔板中装入100 y L包含IPTG的液体培养基W及10 y L漂 亮新小杆线虫dsRNA文库的AB301-105(DE3)细菌细胞培养物（ODe。。为1)，所述文库每个都 携带有具漂亮新小杆线虫基因组片段的载体，用于表达dsRNA。向每个孔中加入4只同步的 Ll虫，在25C赔育至少4至5天。该些实验都采用一式四份来进行。在筛选中使用6个对 昭.
[0246] pGN29 =阴性对照，野生型
[0247] pGZl = unc-22 =颤摇者表型
[024引 pGZlS =几下质合酶=胚胎致死
[0249] pGZ25 = pos-1 =胚胎致死
[0 巧 0] pGZ59 = bli-4D =急性致死
[0巧1 ] ACC =己醜辅酶A駿化酶=急性致死
[0巧2] 5天后，将用产生dsRNA的细菌喂饲的漂亮新小杆线虫nuc-1 (el392)虫的表型与 用空载体（PGN29)和其它对照喂饲的虫的表型相比较。针对致死性（急性或幼虫），亲本 (Po)世代的致死性，第一子代（Fl)世代的（胚胎）致死性，或者针对化的生长延缓，对用 dsRNA喂饲的虫加W筛选，该按照下文所述来进行；（i)化的急性致死性；Ll虫没有发育并 且死亡，该表型没有产生子代，孔看起来相当地空；（ii)化的（幼虫）致死性：化在Ll之后 的期死亡，该表型也没有产生子代。在孔中发现了死亡的幼虫或死亡的成虫；（iii)Fl的致 死性；Ll虫发育到成年期，并且仍然活着。该表型没有子代。该可能是由于不育、胚胎致死 性（在孔底有死亡的卵）、胚胎停止或幼虫停止（最终死亡）；（iv)生长停止或生长延缓/ 延迟；与具有正常发育或正常子代#的孔比较。
[0巧3] 对于表IA中示出的祀序列而言，我们推断出，dsRNA介导的线虫（例如漂亮新小 杆线虫）中漂亮新小杆线虫祀基因的沉默对于虫的生长和生存能力具有致命影响。
[0巧4] 上述dsRNA沉默实验之后，在24孔板上，W高通量模式，在漂亮新小杆线虫中进行 了更为详细的表型实验。按照下文所述，将上文所述的细菌菌株AB301-105(DE3)中产生 的dsRNA文库喂饲给24孔板上的漂亮新小杆线虫nuc-1 (el392)虫：将nuc-1卵转移至单 独的板上，令其同时在2(TC赔化，W使得Ll世代同步。随后，将100只同步的Ll虫浸泡于 500 y L S-完全喂饲培养基（包含5 y g/mL胆固醇、4 y L/mL PEG和ImM IPTG)和500 y L 漂亮新小杆线虫dsRNA文库的AB301-105(DE3)细菌细胞培养物（ODe。。为1)中，所述文库 每个都携带有具漂亮新小杆线虫基因组片段的载体，用于表达dsRNA。在25C对浸泡的Ll 虫进行2小时摇晃。
[0巧日]离也并除去950 y L上清液之后，将5 y L剩余的且重息的沉淀（包含大约10至15 只虫），转移进24孔板的每个孔的中部，所述孔装有琼脂LB肉汤层。在25C对经接种的板 进行2天赔育。在成年期，单独选出1只成虫并在25C赔育2天，W观察其子代。对其它成 虫的观察在原来的24孔板上原位进行。该些实验一式四份进行。
[0巧6] 用第二批虫重复进行该种详细的表型筛选，唯一的不同在于，第二批虫在2(TC赔 育3天。
[0257] 将用漂亮新小杆线虫dsRNA喂饲的虫的表型与用空载体喂饲的漂亮新小杆线虫 nuc-l(el392)虫的表型相比较。
[025引基于该实验推断出；对表IA中示出的漂亮新小杆线虫祀基因的沉默对于虫的生 长和生存能力有致命影响，该祀基因对线虫生存能力来说是重要的。因此，该些基因是通过 dsRNA介导的基因沉默控制（杀死或防止其生长）线虫的良好祀基因。因此，本发明包括上 述漂亮新小杆线虫祀基因的线虫直向同源物控制线虫侵袭，例如植物的线虫侵袭的用途。
[0259] 实施例2 ;对黑尾果禍直向同源物的鉴定
[0260] 如上文实施例1中所述，鉴定出了多种漂亮新小杆线虫致死序列，它们可用于鉴 定其它物种和属中的直向同源物。例如，可用漂亮新小杆线虫致死序列来鉴定直向同源的 黑尾果禍序列。目P，可用每条漂亮新小杆线虫序列就黑尾果禍中的直向同源序列去检索公 共数据库，例如GenBank。选出可能的黑尾果禍直向同源物，其享有高度序列同源性巧值 优选小于或等于1E-30)，并且序列是blast相互最佳击中化it)，后者表明来自不同生物体 (例如漂亮新小杆线虫和黑尾果禍）的序列是彼此最高的blast击中。例如，使用BLAST， 将来自漂亮新小杆线虫的序列C与黑尾果禍中的序列相比。如果黑尾果禍序列D是序列C 的最佳击中，并且当将D与漂亮新小杆线虫的所有序列进行比较时也得到序列C，那么D和 C就是相互最佳击中。该标准通常用于定义直向同源性，该表示不同物种中具有相似功能的 相似序列。黑尾果禍序列标识符示于表IA中。
[0261] 实施例3 ;马铃墓叶甲（马铃墓甲虫）
[0262] A.从马铃墓叶甲克隆部分基因序列
[026引按照厂商说明书，使用TRIzol试剂（目录化.15596-026/15596-018,英杰生命 科学公司（Invitrogen), Rockville, Maryland, USA),从马铃墓叶甲（马铃墓甲虫的来源： Jeroen van Schaik,Entocare CV Biologische Gewasbescherming, Postbus 162,6700AD Wageningen，荷兰）的四种不同幼虫期分离高质量的完整RNA。按照厂商说明书（目录 化.1700,普洛麦格公司（Promega))，通过面ase处理，除去RNA制备中存在的基因组DNA。 按照厂商说明书，使用可商购试剂盒（Superscript ? III逆转录酶，目录化.18080044， 英杰生命科学公司（Invitrogen), Rockville, Ma巧land, USA)，产生 cDNA。
[0264] 为分离出包含 LDOOl、LD002、LD003、LD006、LD007、LDOlO、LDOlI、LD014、LD015、 LD016和LD018基因的部分的cDNA序列，按照厂商说明书，使用Amplitaq Gold(目录 化.N8080240,应用生物系统公司（Applied Biosystems)),用简并引物进行一系列PCR反 应。
[0265] 用于扩增每条基因的简并引物的序列给于表2-LD中，该表展示了马铃墓叶甲祀 基因，包括引物序列和获得的CDNA序列。该些引物用于各PCR反应中，其中采用如下条 件；95°C 10分钟，接着进行40个95°C 30砂、55°C I分钟和72°C I分钟的循环，接着在 72C 10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，将其纯化（QIAquick凝胶提取试剂盒 (QIAquick Gel Extraction kit),目录化.28706,快而精公司（Qiagen)),克隆进 pCR8/ GW/topo载体（目录化.K250020,英杰生命科学公司（Invitrogen))，并测序。得到的PCR 产物的序列由表2-LD给出的各SEQ ID NO示出，它们被称为部分序列。相应的部分氨基酸 序列由表3-LD中给出的各SEQ ID NO示出，其中，读框的起点用括号示出。
[0266] B.马铃墓叶甲基因的dsRNA产生
[0267] 使用可商购试剂盒T7I?ibomax? Express RNAi系统（目录化.P1700,普洛麦格 公司（Promega))，合成毫克级的dsRNA。首先，在两个分别的PCR反应中产生两种分别的单 5'T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有相对T7启动子而言不同方向的祀序列。
[026引就每种祀基因而言，使用特异性的T7正向引物和特异性的反向引物来产生正义 T7模板。用于扩增每种祀基因的正义模板的各引物的序列给于表8-LD中。PCR反应条件 如下所述；95°C 4分钟，接着是35个95C 30砂、55C 30砂和72C 1分钟的循环，接着 在72C 10分钟。在采用与上述相同的条件的PCR反应中，使用特异性正向引物和特异性 T7反向引物来产生反义T7模板。用于扩增每种祀基因的反义模板的各引物的序列给于 表8-LD中。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，通过PCR纯化试剂盒（Qiaquick PCR Purification Kit,目录化.28106,快而精公司（Qiagen))对其进行纯化，并进行化Cl化 沉淀。将产生的T7正向和反向模板混合起来W被转录，将得到的RNA链退火，用面ase和 RNase进行处理，并且通过己酸轴纯化，该都按照厂商说明书来进行。针对每种祀基因得到 的dsRNA的正义链示于表8-LD中。表8-LD展示了用于制备马铃墓叶甲祀序列的dsRNA片 段和多联体序列的序列，包括引物序列。
[0269] C.将马铃墓叶甲基因克隆进植物载体地7GWIWG2DQI)
[0270] 鉴于RNA干扰的机制是通过dsRNA片段起作用的，因此W反义和正义方向克隆上 文选出的祀基因的祀核巧酸序列，其通过内含子-CmR-内含子分开（其中CmR是氯霉素抗 性标记），W形成dsRNA发夹构建体。在含attL的进入克隆（见实施例1)和含attR的目 的载体（=地7GWIWG2D(II))间使用LR重组反应来产生该些发夹构建体。通过材料运送协 议（Material Transfer Agreement)从VIB/植物系统生物（VIB/Plant Systems Biology) 获得植物载体地7GWIWG2DQI)。按照厂商说明书，使用LR Clonase? II酶混合物（目录 化.11791-020,英杰生命科学公司（Invitrogen))来进行LR重组反应。该些克隆实验产生 了针对LD002、LD006、LD007、LD010、LD011、LD014和LD016基因中每种的发夹构建体，它们 具有启动子-正义-内含子-CmR-内含子-反义方向，或者启动子-反义-内含子-CmR-内 含子-正义方向，其中，启动子是植物的可操作的35S启动子。具有35S启动子的二元载体 PK7GWIWG2D(II)适于进行向根癌农杆菌中的转化。
[027U 对于LD002而言，在克隆进pCR8/GW/topo的LD002上用限制性酶BsoBI和PvuI进 行双消化（见实施例3A)。对于LD006而言，在克隆进pCR8/GW/topo的LD006上用限制性 酶BsoBI进行消化（见实施例3A)。对于LD007而言，在克隆进pCR8/GW/topo的LD007上 用限制性酶BsoBI进行消化（见实施例3A)。对于LD007而言，在克隆进pCR8/GW/topo的 LD007上用限制性酶BsoBI进行消化（见实施例3A)。对于LDOlO而言，在克隆进PCR8/GW/ topo的LDOlO上用限制性酶PvuI和Pvun进行双消化（见实施例3A)。对于LD014而言， 在克隆进pCR8/GW/topo的LD014上用限制性酶BsoBI进行消化（见实施例I)。对于LD016 而言，在克隆进pCR8/GW/topo的LD016上用限制性酶BsoBI进行消化（见实施例3A)。使 用Qiaquick凝胶提取试剂盒（目录化.28706,快而精公司（Qiagen))来纯化含有感兴趣 基因（侧翼有attL位点）的条带。将150ng量的经纯化片段和15化甜K7GWIWG2DQI)与 LR克隆酶（Clonase) II酶加到一起，在25C温育至少1小时。蛋白酶K溶液处理（37C 10 分钟）之后，将整个重组混合物转化进Top 10化学感受态细胞。通过限制性消化分析选出 阳性克隆。对于下述发夹构建体的完全序列：
[027引-对LD002(反义-内含子-CmR-内含子-正义）而言，示于SEQ ID NO:: 240中； [027引-对LD006 (正义-内含子-CmR-内含子-反义）而言，不于SEQ ID NO: : 241中； [0274]-对LD007(正义-内含子-CmR-内含子-反义）而言，示于SEQ ID NO:: 242中； [027引-对LDOlO (正义-内含子-CmR-内含子-反义）而言，不于SEQ ID NO: : 243中；
[0276] -对LDOll (反义-内含子-CmR-内含子-正义）而言，示于SEQ ID NO:: 244中；
[0277] -对LD014(正义-内含子-CmR-内含子-反义）而言，示于SEQ ID NO:: 245中； [027引-对LD016(反义-内含子-CmR-内含子-正义）而言，在SEQ ID NO:: 246中给 出；
[0279] 表9-LD提供了针对每种发夹构建体的完全序列。
[0280] D.使用人工膳食，就对马铃墓叶甲的活性来筛选dsRNA祀
[0281] 用于马铃墓甲虫的人工膳食如下文所述来制备（对Gelman等人，2001，J. Ins. Sc.,卷1，号7, 1-10做了一些改变）；对水和琼脂进行高压灭菌，当温度降到55C时加入 剩余的成分（如下表2所示）。在该温度，将成分很好地混合起来，之后将膳食等分到24孔 板（纳恩克公司（Nunc)),每孔的量为Iml膳食。通过在室温冷却，令人工膳食固化。将膳 食胆存于4C，可胆存多达3周。
[0282] 表2;人工膳食的成分
[0283]

【权利要求】
1. 经分离的双链RNA分子，其包含退火的互补链，其中至少一条所述退火的互补链包 含选自以下的多核苷酸： (a) 与如下任意所示的靶基因的至少21个连续核苷酸互补的多核苷酸：SEQ ID N0:3、 795、890、1073、1684、2366、1、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、159、160、161、162、247、249、 251、253、255、257、259、513、515、517、519、521、601、603、605、607、609、793、797、799、801、 888、892、894、896、1071、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、 1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1115、1682、1686、1688、1690、1692、 1694、1696、1698、1700、1702、1704、2100、2102、2104、2106、2108、2364、2368、2370 和 2372 ; (b) 与编码如下任意所示的氨基酸序列的靶基因的至少21个连续核苷酸互补的多 核苷酸：SEQ ID N0:4、796、891、1074、1685、2367、2、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、248、 250、252、254、256、258、260、514、516、518、520、522、602、604、606、608、610、794、798、800、 802、889、893、895、897、1072、1076、1078、1080、1082、1084、1086、1088、1090、1092、1094、 1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1116、1683、1687、1689、1691、 1693、1695、1697、1699、1701、1703、1705、2101、2103、2105、2107、2109、2365、2369、2371 和 2373,以及 (c) 与（a)或（b)的多核苷酸具有至少85%序列同一性的多核苷酸， 其中所述多核苷酸接触有害生物抑制与所述多核苷酸基本互补的所述有害生物的多 核苷酸的表达。
2. 权利要求1的双链RNA分子，其中有害生物接触所述多核苷酸抑制所述有害生物的 生长、发育或繁殖。
3. 编码权利要求1或2的双链RNA分子的分离的多核苷酸或多核苷酸组。
4. 编码权利要求1或2的双链RNA分子的载体系统。
5. 用权利要求3的多核苷酸或多核苷酸组或权利要求4的载体系统转化的细胞，所述 细胞不是植物细胞。
6. 用权利要求3的多核苷酸或多核苷酸组或权利要求4的载体系统转化的植物细胞， 所述细胞不是繁殖性植物细胞。
7. 用权利要求3的多核苷酸或多核苷酸组或权利要求4的载体系统转化的植物组织， 所述组织不是繁殖材料。
8. 从用权利要求3的多核苷酸或多核苷酸组或权利要求4的载体系统转化的植物组织 产生的产品，其中所述产品包含权利要求1或2的双链RNA分子，所述产品不是繁殖材料。
9. 权利要求8的产品，其中所述产品选自食品和饲料。
10. 权利要求8的产品，其中，所述产品选自纤维、纸、餐食、蛋白质、淀粉、面粉、青贮饲 料、咖啡、茶和油。
11. 用于控制有害生物侵袭的方法，所述方法包括向所述有害生物提 供包含权利要求1或2的双链RNA分子的植物材料。
12. 用于控制有害生物侵袭的方法，所述方法包括： a) 向有害生物的宿主植物引入权利要求3的多核苷酸或多核苷酸组或权利要求4的载 体系统， b) 种植所述宿主植物以允许权利要求1或2的双链RNA分子的表达；和 C)向所述有害生物提供所述植物或植物材料。
13. 减少作为有害生物的宿主植物的作物由于有害生物侵袭导致的产量损失的方法， 包括： a) 向所述宿主植物引入权利要求3的多核苷酸或多核苷酸组或权利要求4的载体系 统，和 b) 种植所述宿主植物以允许权利要求1或2的双链RNA分子的表达； 其中所述表达抑制所述有害生物的进食并且减少由于有害生物侵袭导致的产量损失。
14. 权利要求12或13的方法，其中在所述有害生物摄入所述植物的部分时，所述双链 RAN分子遏制参与所述有害生物生长、发育或繁殖的靶基因。
15. 权利要求1或2的双链RNA分子、权利要求3的多核苷酸或多核苷酸组、权利要求 4的载体系统、权利要求5或6的细胞、权利要求7的植物组织或权利要求8-10的任一项的 产品用于处理植物的有害生物侵袭的用途。
16. 用于产生包含权利要求1或2的双链RNA分子的植物的方法，包括 a) 向所述植物引入权利要求3的多核苷酸或多核苷酸组或权利要求4的载体系统，和 b) 种植所述植物以允许所述双链RNA分子的表达。
17. 包含权利要求1或2的双链RNA分子的植物用于在所述植物中处理有害生物侵袭 或用于减少由于有害生物侵袭导致的所述植物的产量损失的用途，其中所述植物是所述有 害生物的宿主植物。
【文档编号】C12N15/82GK104357446SQ201410589369
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2006年9月18日 优先权日:2005年9月16日
【发明者】R·拉马克斯, P·菲尔德曼, G·普莱廷克, I·诺仁, E·范布勒, F·佩克尔, T·博盖尔特 申请人:德福根有限公司