使细菌自主产微细胞的方法及一株自产微细胞细菌突变株的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种使细菌自产微细胞的方法，该方法是通过构建含有SEQIDNo.1所示核苷酸序列或与SEQIDNo.1所示核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列的上下游同源臂的自杀性质粒，并利用同源重组方法敲除所述核苷酸序列，从而抑制细菌分裂的正常进行，使细菌在两极部位即断开，从而产生微细胞。该方法不含有任何抗性标记，符合疫苗生物安全的要求，能促进微细胞在亚单位疫苗以及抗原递呈载体上的应用。本发明还提供一株在该方法下制备得到的自产微细胞的鼠伤寒沙门氏菌突变体，分类命名为 Salmonellaenterica serovarTyphimuriumiP0002，保藏号为CCTCCNO.M2014474，保藏时间为2014年10月14日。CCTCC NOM201447420141014
【专利说明】使细菌自主产微细胞的方法及一株自产微细胞细菌突变株
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及使细菌自主产微细胞的方法及一株自产微细胞细菌突变株。
【背景技术】
[0002]细菌微细胞是一种当正常分裂活动被干扰之后由杆状细菌两极隔离而产生的无核结构。第一个微细胞产生菌株是由基因组学研究人员在寻找细胞分离突变株时发现的，自从他们发现此种结构之后，各种分子水平以及基因水平的微细胞形成相关内容被更多的报道出来，人们可以根据微细胞的产生机制，对基因与菌株结构背景清楚的菌株进行改造，使微细胞能够更好地作为疫苗载体来运用。微细胞已经被用于转录、翻译、质粒分离、细胞复制、质粒骨架毒力因子表达分析等，由于微细胞不具有复制的特性，但能够递呈细菌内大多数物质，包括蛋白抗原以及质粒DNA，使其能够成为一种高效的疫苗载体平台。
[0003]微细胞具有以下特征:1、由于微细胞可以被认为是不含有遗传物质的细菌颗粒，具有亲本细菌的大部分生物学特性，能够携带外源质粒以及表达外源蛋白，并且可以利用细菌的分泌系统来改造分泌外源蛋白，所以在作为抗原递呈载体方面，有更加广泛的选择优势；2、由于其不具有细菌基因组等使细菌复制的物质，在机体内部不会长期定殖带来潜在危害；3、由于微细胞具有与细菌类似的生物被膜组成，能刺激机体产生高效的免疫反应以及免疫保护力，4、由于微细胞的大小与能够复制的亲本细菌有差别，我们就可以利用简便，传统的分离方法例如梯度离心即可非常高效的将微细胞从亲本细胞中分离出来，纯化方法简便可行。
[0004]目前，虽然可通过一些方法，使得大肠杆菌自产微细胞，但在其他细菌上，特别是在沙门菌上，还没有找到一种使其自产微细胞的较好的方法。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题之一在于提供一种使细菌自产微细胞的方法。该方法包括如下步骤:
1)构建含有SEQID N0.1所示核苷酸序列或与SEQ ID N0.1所示核苷酸序列具有至少80%的序列同一性的核苷酸序列的上下游同源臂的自杀性质粒，所述SEQ ID N0.1所示的核昔酸序列为缺少最后18bp序列的基因序列；
2)将细菌与含有步骤I)所得质粒的λ#>大肠杆菌菌株自然结合，通过同源重组的方法，经过氯霉素抗性筛选以及蔗糖敏感性筛选，得到缺失调控细菌分裂的基因的突变株。
[0006]所述自杀性质粒以pRE112为质粒载体进行构建。
[0007]所述自杀性质粒的构建步骤为:
I)引物设计
NminD-1Y:5’ -TCACAAAAACGCGATTAATTGATG-3’
^minD-m:5’ -ACCTGCAGGATGCGGCCGCGGTTAAAAAGGGATCAATTC-3’
NminD-1Y:5’ -CCGCGGCCGCATCCTGCAGG CAAACGCCTGTTCG-3’
/^minD-2R:5’ -GTTGCAGGAGTATCCGCTTTAACG-3’
2)提取处于对数生长期的细菌基因组DNA作为模板，分别用左右同源臂引物进行扩增，得到其左右同源臂的扩增产物，回收产物进行融合PCR扩增，即用引物以及A?i/^-2R进行扩增，得到融合好的左右同源臂扩增产物；
3)再用+A反应试剂盒在片段末端进行+A碱基处理，并与用I酶切后得到PRE112酶切产物在T4连接酶的作用下进行连接并转化入Xpir大肠杆菌中，得到含调控细菌分裂的基因的上下游同源臂的自杀性质粒pRE112-minD。
[0008]重组自杀质粒由于不能在沙门氏菌复制存活，将转入有重组质粒的入如> 大肠杆菌菌株与沙门氏菌自然接合，使同源片段导入沙门氏菌基因组，并且通过同源重组，经过第一次交换和抗性筛选(Cm抗性)，得到阳性克隆，然后培养阳性克隆，使其发生自发突变产生二次交换，用含有蔗糖的培养基筛选，得到对抗生素敏感而对蔗糖抗性的克隆，最后PCR的方法筛选得到突变菌株。
[0009]如将基因全部敲除，会影响minE的正常工作，极容易导致细菌不产生微细胞。只敲除SEQ ID N0.1所示核苷酸序列或与SEQ ID N0.1所示核苷酸序列具有至少80%的序列同一性的核苷酸序列，可以使得细菌自产微细胞。
[0010]本发明的另一个目的是提供一株自产微细胞的enterica serovartyphimuriumi P002突变体。该突变体染色体DNA中缺少了 minD基因中除最后18bp序列之外的所有序列，分类命名为enterica serovar Typhimuriumi P0002,保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉市武昌珞珈山，武汉大学，邮编:430072)，保藏号为CCTCCN0.M2014474，保藏时间为2014年10月14日。该突变体可自产微细胞，可为作为一种高效的抗原递呈载体以及亚单位疫苗的应用提供前提条件。
[0011]本发明的有益效果是:
1、本发明能使得细菌自产微细胞，微细胞由于其具有不可复制性，其作为亚单位疫苗以及抗原递呈载体的话对机体不会产生持久的伤害，本发明能促进微细胞在亚单位疫苗以及抗原递呈载体上的应用；
2、本发明提供的方法，不含有任何抗性标记，符合疫苗生物安全的要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1:本发明方法示意图；
图2:含有缺少最后18bp序列的minD基因的上下游同源臂的自杀性质粒的质粒图谱；图3:是本发明构建的自杀性质粒的鉴定结果，图中M:DNA marker III I:minD图4:自产微细胞的不同血清型沙门菌突变体的PCR检测电泳结果，图中M:DNA markerIII 1:亲本 minD ；
图5:自产微细胞的鼠伤寒沙门菌突变株产生的微细胞的活性验证；
图6:自产微细胞的鼠伤寒沙门菌突变株产生的微细胞的电子显微镜照相结果；
图7:完全敲除minD基因序列的鼠沙门菌突变株的电子显微镜照相结果，箭头所指部分为长丝状细菌；
图8:敲除与与SEQ ID N0.1所示核苷酸序列具有80%的序列同一性的核苷酸序列的 Yersinia enterocolitica产生的微细胞的电子显微镜照相结果。
【具体实施方式】
[0013]下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0014]实施例1
I)含有缺少最后18bp序列的基因的上下游同源臂的自杀性质粒的构建根据已报到的鼠伤寒沙门氏菌UK-1株序列(参照GenBank序列号为CP002614.1)设计两对融合PCR引物分别扩增缺少最后18bp序列的基因的上游同源臂以及下游同源臂，扩增片段大小分别为420bp和360bp，上述引物均由北京华大基因公司合成，引物序列如下:
NminD-YY:5’ -TCACAAAAACGCGATTAATTGATG-3’
/^minD-1R:5’ -ACCTGCAGGATGCGGCCGCGGTTAAAAAGGGATCAATTC-3’
^minD-1V:5’ -CCGCGGCCGCATCCTGCAGG CAAACGCCTGTTCG-3?:5’ -GTTGCAGGAGTATCCGCTTTAACG-3’
将冻干的鼠伤寒沙门氏菌UK-1株接至LB平板中过夜培养，第二天挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37°C 180 r/min培养8_12h提取细菌的基因组，提取基因组利用的是天根生化的细菌基因组抽提试剂盒，按照说明书的操作步骤进行基因组的抽提。
[0015]PCR的扩增反应在50 μ L的体系中进行，反应体系如下:模板DNA I μ L，2Χ高保真DNA酶预混液，购自宝生物(大连)有限公司25 μ L，上游引物I μ L，下游引物I μ L，ddH2022 μ L0
[0016]扩增条件为:94°C变性5min后进入循环，循环参数为94°C 10 sec，55°C 15 sec,72°C 10 sec。35个循环后，72°C延伸lOmin。扩增的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增两个片段大小分别为420bp和360bp，与预期大小相当。
[0017]上下游同源臂的融合:将上下游同源臂按照摩尔数1:1的比例，总模板量为2yL作为PCR扩增模板，利用引物Δ minD-lF和Δ minD-2R在与之前相同体系以及扩增条件下进行扩增，得到大小为800bp左右的融合片段。
[0018]将之前得到的融合片段进行+A处理，利用天根生化的plus A反应试剂盒，反应体系为:模板15 μ L，plus A buffer 4 μ L，Taq酶I μ L ;反应条件为:72°C 30min，反应完成后待用。
[0019]自杀质粒pREl12酶切片段的准备:利用/酶切PRE112质粒，将质粒片段酶切出T克隆位点，回收载体pRE112，然后用T4 DNA Iigase连接，16°C水浴过夜，转化λ
大肠杆菌感受态细胞，待其长出后进行PCR鉴定，从而获得自杀质粒。鉴定结果证实构建的自杀质粒是正确的，如说明书附图3所示，自杀质粒的构建流程图如说明书附图图2所示。
[0020]2)自产微细胞的鼠伤寒沙门氏菌突变体的构建
将构建好的自杀质粒转化至大肠杆菌Xpir大肠杆菌菌株中(该质粒缺失了 ast/基因，需要DAP才能够生长，能够很好的用于后续接合转移的筛选)，将携带有自杀质粒的Xpir大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌enterica serovar Typhimuriumi UK-1),猪霍乱沙门氏菌iSalmonella Choleraesuis),肠炎沙门氏菌iSaJmorwllB Enteritidis),鸡伤寒沙门氏菌Gallinarium),都柏林沙门氏菌(5^7^0/7(9773 Dublin)以及甲型副伤寒沙门氏菌QSaln1nella paratyphi A)等菌株进行接合转移,在氯霉素抗性的LB平板上筛选阳性菌落，将阳性菌落在不含氯霉素抗性的LB液体培养基中培养增殖，在10%蔗糖平板上筛选耐蔗糖菌落，并挑取单菌落进行PCR鉴定。
[0021 ] PCR鉴定:提取minD突变菌株ΔMinD~\K~\基因组DNA，用引物Δ minD-lF和AminD-2R扩增上下游同源臂片段，同时用引物AminD-1R和AminD_2F扩增基因,看能否扩增出大小约为700bp左右的特异性缺失的基因片段，如果不能扩增出相应片段，则表明结果与预期相符，本实施例突变株鉴定构建成功，如说明书附图图4所示。
[0022]实施例2
除构建同源臂的自杀性质粒的构建时，同源臂的自杀性质粒含有的是如SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列的上下游同源臂，以及引物序列为:minD—lF:atcatcaacacgcctgtcc
minD—lR:cgcggccgccctgcagggaaatggattccttgtcaaaag
minD_2F:tccctgcagggcggccgcgggggataaaccatggctttg
minD_2R:ggattttcttgttttggctg
之外，其余步骤与实施例1 一样。
[0023]实施例3
微细胞的纯化和活性检测:培养500ml的实施例1中的沙门氏菌突变株至低氧环境直到OD值A600达到1.1。通过连续两次的低速离心(2000Xg，1mins)除去细菌菌体杂质，收集上清,微细胞富集于上清中，通过离心(10000Xg，30mins)收集微细胞，并用IX的DPBS重悬，并利用密度梯度离心得到纯化的微细胞，密度梯度模式为:连续的5-20%的1dixanol (OptiPrep, Axis-Shield PLC, Scotland),分别将密度离心剂浓度由高到低加至离心管中，微细胞置于最顶层，装好密度离心后离心(2000X g，20min)，离心完成后收集不同层次的离心液于1.5ml离心管中，用18000Xg收集微细胞，并用适合的溶剂重悬微细胞，未被污染的微细胞可用16微细胞中只含有一个细菌来判断其未被污染。
[0024]将含有红色突光蛋白的报告质粒pUC-Mcherry通过电转化的方法转入沙门氏菌突变株中，并按照上面所述方法将微细胞纯化出来，通过荧光电子显微镜可以看到纯化出来的微细胞纯度高，并且能够表达红色荧光蛋白，显出红色，如说明书附图图5所示。
[0025]实施例4
自发产生的微细胞的电镜观察:对于实施例1和实施例2的突变株，在培养至对数期的微细胞产生突变菌株菌液培养基中取I ml培养液，以4000 Xg离心收集菌体，用PBS清洗2遍，用glutardialdehyde (2.5% in PBS), 4度固定2个小时,用相同buffer润洗3遍,用ethylalcohol and isoamyl acetate solut1ns逐级脱水，放于银喷支架上，用干冰完全脱水后，喷一层银粉增加样品的敏感性，用Hitachi S-4800扫描电镜观察微细胞突变体产生微细胞的情况，同时可取纯化后的微细胞进行如上步骤的处理后电镜观察，结果如说明书附图图6和图8所示。
[0026]对比实施例1
构建自杀性质粒时，除上下同源臂含有整个minD基因序列，以及引物序列为:
MinD-1F:TCACAAAAACGCGATTAATTGATG
MinD-1R:ACCTGCAGGATGCGGCCGCGG TTAAAAAGGGATCAATTC
MinD-2F: CCGCGGCCGCATCCTGCAGGTATGGCATTACTGG
MinD-2R: GTTGCAGGAGTATCCGCTTTAACG
之外，其余步骤与实施例1 一致。
[0027] 如说明书附图7所示，将MinD基因完全敲除，会影响MinE的功能，从而形成箭头所指处的长丝状细菌，并不会有细菌在分裂时在两极断开的情况，从而不会形成Minicells。
【权利要求】
1.一种使细菌自产微细胞的方法，其特征在于:所述方法包括以下步骤: 1)构建含有SEQID N0.1所示核苷酸序列或与SEQ ID N0.1所示核苷酸序列具有至少80%的序列同一性的核苷酸序列的上下游同源臂的自杀性质粒，所述SEQ ID N0.1所示的核昔酸序列为缺少最后18bp序列的基因序列； 2)将目的细菌与含有步骤I)所得质粒的λ#>大肠杆菌菌株自然结合，通过同源重组的方法，经过氯霉素抗性筛选以及蔗糖敏感性筛选，得到缺失调控细菌分裂的基因的突变株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤I)所述自杀性质粒以PRE112为质粒载体进行构建。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述自杀性质粒的构建步骤为: 1)引物设计
NminD-1Y:5’ -TCACAAAAACGCGATTAATTGATG-3’:5’ -ACCTGCAGGATGCGGCCGCGGTTAAAAAGGGATCAATTC-3’
^minD-1V:5’ -CCGCGGCCGCATCCTGCAGG CAAACGCCTGTTCG-3’:5’ -GTTGCAGGAGTATCCGCTTTAACG-3’ 2)提取处于对数生长期的细菌基因组DNA作为模板，分别用左右同源臂引物进行扩增，得到其左右同源臂的扩增产物，回收产物进行融合PCR扩增，即用引物以及A?i/^-2R进行扩增，得到融合好的左右同源臂扩增产物； 3)再用+A反应试剂盒在片段末端进行+A碱基处理，并与用I酶切后得到PRE112酶切产物在T4连接酶的作用下进行连接并转化入Xpir大肠杆菌中，得到含调控细菌分裂的基因的上下游同源臂的自杀性质粒。
4.一株由权利要求1-3任一方法制备得到的自产微细胞的Salmonella en tericaserovar Typhimuriumi P0002突变体，其特征在于:所述突变体染色体DNA中缺少了 基因的大部分序列,但保留其中的最后18bp序列,分类命名为entericaserovar Typhimuriumi P0002,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCN0.M2014474，保藏时间为2014年10月14日，保藏时间为2014年10月14日。
【文档编号】C12N15/74GK104388459SQ201410589298
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】孔庆科, 刘琼, 刘青, 赵新新 申请人:四川农业大学