一种采用实时定量反转录pcr法鉴定抗黄曲霉花生种子的方法
【专利摘要】本发明涉及一种采用实时定量反转录PCR法鉴定抗黄曲霉花生种子的方法。采用的技术方案是：将检测花生种子和比照花生种子灭菌：侵染黄曲霉；取样并合成cDNA；分别取cDNA样品1μl，并分别加入相应的引物，采用实时定量PCR仪，在每次扩增的退火阶段从62到95℃每隔0.2℃测定荧光强度。本发明确认了参与抗性机制的基因，为进一步鉴定花生种子的抗黄曲霉特性提供了方法。应用本发明可在非田间实验条件下，将前期田间试验期的90天缩短为试验室条件下周期为7天的侵染试验，在较短的周期内鉴定出抗黄曲霉花生品种，大大缩短了检测时间，提高了效率，准确性高。
【专利说明】-种采用实时定量反转录PCR法鉴定抗黄曲霉花生种子的 方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生理病变与检测领域，特别涉及一种采用实时定量反转录PCR方 法，通过对感染黄曲霉的花生基因的三个应激反应过程的检测，进一步定性的鉴定花生种 子对黄曲霉的抗性。
【背景技术】
[0002] 黄曲霉毒素（aflatoxin)是由产毒的黄曲霉菌（Aspergillusflavus)和寄生曲 霉菌（Aspergillusparasitis)等腐生半知菌类产生的次生代谢产物，是迄今发现的真菌 毒素中稳定性最强、毒性最大的一类。黄曲霉毒素常见于粮食和饲料中，被黄曲霉毒素污染 的饲料一旦被家畜摄入，经食物链的作用，延伸到人类，不同毒素的低剂量就对高等脊椎动 物和其他动物具有急毒性或慢毒性，其中AFB1毒性最强，强烈致癌，主要诱发肝癌。黄曲霉 毒素污染可广泛性的发生在多种食品上，其中以玉米、花生和棉籽油最易受到污染。
[0003]目前花生真菌病害十分严重，不仅造成巨大的损失，更严重到危害人的生命健康。 对于田间生长阶段，各花生产区、花生各生育期均可感染花生黄曲霉菌等真菌病害，一般田 间的发病率约为10 %?20 %，严重可达50 %?60 %;发病后，减产15 %，严重时减产50 %。 该病除对产量影响外，出仁率和出油率也显著下降。而对于保藏阶段顽固、易感染的黄曲霉 菌产生的黄曲霉菌毒素更是危害巨大，由于污染严重而失去营养和经济价值。因此，筛选抗 黄曲霉花生种子具有极其重要的经济效益及环境效益。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种可在非田间实验条件下，在较短的周期内鉴定出具有抗 黄曲霉特性的花生品种。
[0005] 本发明采用的技术方案是：一种采用实时定量反转录PCR法鉴定抗黄曲霉花生种 子的方法，方法如下：
[0006] 1)将检测花生种子和比照花生种子灭菌：将种子浸在0. 75%的次氯酸钠溶液中 灭菌，用无菌水冲洗，并在无菌去离子水中，室温浸泡到含水量为30%。所述的比照花生种 子是阜花11花生种子或红崖子四粒红花生种子；
[0007] 2)侵染：将检测花生种子和比照花生种子浸入含有黄曲霉的溶液中l-3min，然 后将样品取出移入培养皿中，相同条件下培养1-7天；所述的含有黄曲霉的溶液是：含有 4X106CFU/mL的黄曲霉的孢子悬液，孢子悬液用0. 05 %的曲拉通X-100溶液配制；优选的， 黄曲霉是黄曲霉NRRL3357 ;
[0008] 3)取样并合成cDNA:分别在侵染的第1天、2天、3天、4天、5天和6天取侵染的检 测花生种子和比照花生种子，并分别制备花生种子的总RNA并合成cDNA;
[0009] 4)测定：分别取cDNA样品1iil，并分别加入相应的引物，引物加入的方法是：
[0010] 于第1天的cDNA样品中加入引物P3、P8和P11各0. 3iil;
[0011] 于第2天的cDNA样品中加入引物P3、P8和P11各0. 3iil ;
[0012] 于第3天的cDNA样品中加入引物PI、P4、P5和P13各0. 3 ill ;
[0013] 于第4天的cDNA样品中加入引物P1和P13各0. 3iil;
[0014] 于第5天的cDNA样品中加入引物P9和P10各0. 3iil;
[0015] 于第6天的cDNA样品中加入引物P4、P5、P9和P10各0. 3iil;
[0016]然后，采用实时定量PCR仪，在每次扩增的退火阶段从62到95°C每隔0. 2°C测定 荧光强度；
[0017] 引物和参比引物actin的序列是：
【权利要求】
1. 一种采用实时定量反转录PCR法鉴定抗黄曲霉花生种子的方法，其特征在于方法如 下： 1) 灭菌：将检测花生种子和比照花生种子灭菌； 2) 侵染：将检测花生种子和比照花生种子浸入含有黄曲霉的溶液中l_3min，然后将种 子取出移入培养皿中，相同条件下培养1-7天； 3) 取样并合成cDNA :分别在侵染的第1天、2天、3天、4天、5天和6天取侵染的检测花 生种子和比照花生种子，并分别制备花生种子的总RNA并合成cDNA ; 4) 测定：分别取cDNA样品1 yl，并分别加入相应的引物，引物加入的方法是： 于第1天的cDNA样品中加入引物P3、P8和P11各0. 3iil ; 于第2天的cDNA样品中加入引物P3、P8和P11各0. 3iil ; 于第3天的cDNA样品中加入引物P1、P4、P5和P13各0. 3iil ; 于第4天的cDNA样品中加入引物P1和P13各0. 3 ill ; 于第5天的cDNA样品中加入引物P9和P10各0. 3 ill ; 于第6天的cDNA样品中加入引物P4、P5、P9和P10各0. 3 ill ; 然后，采用实时定量PCR仪，在每次扩增的退火阶段从62到95°C每隔0. 2°C测定荧光 强度； 引物和参比引物actin的序列是： PI ：F:acaccaaccgtctttttaccaaa ；R:ggccaattgggaacacaaac P3 ：F:tgtttgggtgattgctcatgag ；R:aaccaaccatgtcatcaacaagtt P4：F:catgaagctctatgttggtctcaag ；R:atggccttcatggcttcaaa P5 ：F:caagtgcaatgtcgttggt ；R:ccatggaggttagagggtttga P8 ：F:acatcactcacaggaccatgct ；R:gccactggccattgagttaag P9 ：F:tcggcatgcgaattgtagtc ；R:caaacggatgaaccttcacaca P10 ：F:atggcataactgaaggcagtct ；R:ttgtattgtgtctttgaacaccttg Pll ：F:gccactggccattgagctaa ；R:cactcacaggaccatgctcttc P13 ：F:gggtggtaaggccgactgt ；R:tgaatgggagctggctcaa actin ：F:gttccactatgttcccaggca ；R:cttcctctctggtggtgctaca PCR扩增体系： 20 yl反应体系：cDNA 1 yl ;引物；2倍缓冲液10 yl ;ddH20余量； 20. ii 1 参比体系：cDNA 1 ii 1 ;引物 actin 0? 3 ii 1 ;2 倍缓冲液 10 ii 1 ;ddH20 8. 7 ii 1 ; PCR扩增条件：95°C初始变性10s，然后45个循环如下：95°C 10s，60°C 10s，72°C20s。
2. 如权利要求1所述的一种采用实时定量反转录PCR法鉴定抗性花生种子的方法，其 特征在于：所述的灭菌是：将花生种子浸在0. 75%的次氯酸钠溶液中灭菌，用无菌水冲洗， 并在无菌去离子水中，室温浸泡到含水量为30%。
3. 如权利要求1所述的一种采用实时定量反转录PCR法鉴定抗性花生种子的方法，其 特征在于：所述的比照花生种子是阜花11花生种子或红崖子四粒红花生种子。
4. 如权利要求1所述的一种采用实时定量反转录PCR法鉴定抗性花生种子的方法，其 特征在于所述的含有黄曲霉的溶液是：含有4X 106CFU/mL的黄曲霉的孢子悬液，孢子悬液 用0.05%的曲拉通X-100溶液配制。
5.如权利要求4所述的一种采用实时定量反转录PCR法鉴定抗性花生种子的方法，其 特征在所述的黄曲霉是黄曲霉NRRL 3357。
【文档编号】C12Q1/68GK104328191SQ201410620042
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月5日 优先权日:2014年11月5日
【发明者】张慧丽, 陈林, 张丽男, 蒋坤 申请人:辽宁大学