一种分离、纯化金钗石斛原生质体的方法和专用试剂配方的制作方法
【专利摘要】一种分离、纯化金钗石斛原生质体的方法和专用试剂配方。专用试剂溶液A和溶液B，A由MES、KCl、Mannitol、CellulaseR10、PectolyaseY-23、MacerozymeR-10、BSA、CaCl2和ddH2O。溶液B由MES、KCl、Mannitol、BSA、CaCl2、ddH2O。该试剂制备原生质体步骤：（1）将金钗石斛植株放黑暗处培养12h，取幼嫩饱满叶片无菌处理后剪碎；（2）在摇床上用溶液A黑暗处理（1）碎片释放出原生质体；（3）将（2）获得的原生质体溶液过200目细胞筛过滤，滤液离心2-8min，用溶液B溶解沉淀物，反复离心；（4）用FDA对（3）纯化的原生质体活力检测。用本法制的原生质体密度大、纯度高、活力强。
【专利说明】-种分离、纯化金紋石解原生质体的方法和专用试剂配方
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物细胞工程领域，具体为用金铁石解的幼嫩叶片分离、纯化原生质 体的方法与相应的专用试剂配方。本发明为一种金铁石解原生质体分离与纯化的方法与专 用试剂。使用包括W下步骤：原生质体的分离、原生质体的纯化、原生质体产量的测定、原生 质体活力率的测定。 技术背景
[000引 金铁石解(化/7血(9如曲/7(9如7e Lindl.)在治疗白内障、益胃生津、抗肿瘤、抗衰 老、抗福射、治疗也血管疾病、提高机体免疫功能、抗疲劳等方面具有显著功效，在国内外具 有广阔的市场，已成为世界各国防病、治病和医疗保健的极品良药。然而，由于金铁石解自 然生长缓慢的自身原因、生长环境被破坏的环境原因和长期被掠夺式采挖的人为原因，导 致其资源日益匿乏，已被列为国家二类保护植物和《国家重点保护野生植物名录》，迫切需 要借助现代生物技术，（1)保护和利用现有的种质资源、（2)创制新的种质资源为选育优良 品种奠定材料基础、（3)利用细胞息浮培养或转基因工程菌方式生产药用成分W缩短有效 成分的获取周期。分离纯化出高活力的原生质体，进一步通过细胞工程方法对金铁石解进 行遗传改良具有重要的研究价值和市场潜力。
[0003] 植物原生质体是指除去了全部细胞壁后质膜包裹的细胞，是开展基础研究的理想 材料。分离纯化的原生质体，可W用于开展植物细胞信息传递、能量转换、细胞壁合成机理、 膜的结构与功能、核质关系、突变体诱导、杂交或自交不亲和的机理、细胞间的相互作用、植 物激素的作用机理、分离各种细胞器、引入细胞器、原生质体转化导入外源基因、生物反应 器构建等方面的研究。
[0004] 本发明人首先搜集了多个金铁石解的种质资源，进行评价后，用源自赤水的金铁 石解种源的种子为外植体，通过植物组培技术进行种子萌发、原球茎诱导和组培再生苗培 养，系统建立起种苗的组培快繁技术体系，再W组培再生苗的叶片为材料，用酶解法分离获 得了原生质体，并进行了纯度和活力检测。进一步W云南瑞丽的一个金铁石解品系和赤水 金铁石解另一个品系的嫩叶为研究材料，W本技术方法和试剂进行原生质体分离纯化，均 能获得纯度高、活力强的原生质体，为金铁石解的种质资源拓展、商业化遗传育种、基因改 良等后续研究奠定了一定的物质基础。
[0005] 国内外迄今检索到的、关于金铁石解原生质体分离的报道有两份。一份是刘运全 等（2010) W金铁石解类原球茎为研究材料，用酶解法获得了（8. 25 + 0. 17) X IO5个/g、活 性为（90. 24+1.84) %原生质体的报道巧リ运全等，2010,热带生物学报1(3) :215-219), 而本专利用采用的材料为金铁石解组培苗或成株的幼嫩叶片，分离原生质体的溶液配方和 操作流程与刘运全等的也基本不同，但本专利获得的原生质体得率可达7. 55 X 1〇7个/g叶 片，远高于该文献报道，且本专利获得的原生质体活力率均达90% W上，最高可达92. 38%， 与该文献比较而言相当或更高。
[0006] 另一份文献是本实验室之前申报的一项专利，"一种赤水金铁石解原生质体分离、 纯化方法及专用试剂"（申报日期为2014年4月17日，专利受理号为201410153412. 9)，原 生质体的得率为3. 72X IO7个/g叶片、活力率达86. 13%。本专利在该文献基础上做了较大 改进，使得原生质体的得率和活力率显著增加。与前一个专利文献比较，本发明专利做了如 下重大改进；（0本专利的使用不仅仅限制于组培苗的叶片，还可应用于田间种植植株的 幼嫩叶片，但田间叶片在酶解前需灭菌处理；（2)本专利增添了简单的预处理步骤，W提高 原生质体的得率和活力，具体为；在酶解叶片分离原生质体前，先将金铁石解再生苗植株或 田间种植的株放置在黑暗条件下培养12 h，取幼嫩饱满叶片在超净工作台中经无菌处理后 将其切割为1 mm左右宽的碎片后置于盛有0.30-0. 95 mol/L甘露醇的培养皿中，在4 C低 温、黑暗条件下质壁分离1 h后倒掉甘露醇溶液；（3)本发明专利中溶液A与溶液B中关键 试剂和实验流程中关键参数巧日温度、转速、处理时间）是一定的幅度范围，而不是像前专利 那样是某一个具体的数值，该使得实验时更便捷和更具有可操作性；（4)本专利的原生质 体得率翻倍，活力也显著提高，分别达7. 55 X IO7个/g和92. 38%。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种简单易行且快速获取能满足细胞器分离与功能鉴定、 转基因受体和生物反应器构建的金铁石解原生质体的方法与专用试剂的配方。
[0008] 为实现本发明的目的，本发明包括原生质体的分离、原生质体的纯化、原生质体产 量的测定、原生质体活力的鉴定等四方面内容。具体内容如下： 原生质体的分离；（0将金铁石解再生苗植株或成株放置在黑暗条件下培养12 h，取 幼嫩饱满叶片在超净工作台中经无菌处理后将其切割为1 mm左右宽的碎片后进行预处理， 即置于盛有0.30-0. 95 mol/L甘露醇的培养皿中，在4 C低温、黑暗条件下质壁分离1 h后 倒掉甘露醇溶液。（2)注入溶液A对预处理后的叶片碎片进行避光酶解，在温度23-28 C、 转速为50-150巧m的恒温摇床上震荡0.5-6 h即可释放出原生质体。本步骤中，注入溶 液A的量根据叶片碎片的多少来决定，W溶液A刚好淹没叶片碎片小段为宜；培养皿需用封 口胶封口 W避免染菌；培养皿在恒温摇床上震荡，使溶液A与叶片碎片充分接触为宜。（3) 溶液A酶解完成后，打开培养皿，用吸头轻轻吹打叶片，即可充分释放出酶解出来的原生质 体。
[0009] 所述溶液A成分如表1。
[0010] 表1溶液A成分及含量（W 10 ml为例）；
【权利要求】
1. 一种分离、纯化金钗石斛原生质体的专用试剂配方，其特征在于：专用试剂溶液A和 溶液 B，A 由 MES、KC1、Mannitol、Cellulase R10、Pectolyase Y-23、Macerozyme R-10、 BSA、CaCl2 和 ddH20 ;溶液 B 由 MES、KCl、Mannitol、BSA、CaCl2、ddH20 ; 溶液A成分及含量以10 ml如下：
所述试剂溶液A各成分浓度为：MES 0.2 mol/L，Mannitol 0.30-0.95 mol/L，KCl 0.08 mol/L, CaCl2 0.l〇-〇. 30 mol/L ； 溶液B成分及含量以IOml如下： :...1_
所述试剂溶液B各成分浓度为：MES 0.2 mol/L，Mannitol 0.30-0.95 mol/L，KCl 0.08 mol/L, CaCl2 0?10-0. 30 mol/L。
2. -种分离、纯化金钗石斛原生质体的方法，其方法步骤和特征在于： 一）原生质体的分离：1)将金钗石斛再生苗植株或成株放置在黑暗条件下培养12 h， 取幼嫩饱满叶片在超净工作台中经无菌处理后将其切割为I mm左右宽的碎片后进行预处 理，即置于盛有0.30-0. 95 mol/L甘露醇的培养皿中，在4 °C低温、黑暗条件下质壁分离1 h后倒掉甘露醇溶液； 2)注入溶液A对预处理后的叶片碎片进行避光酶解，在温度23-28 °C、转速为50-150 rpm的恒温摇床上震荡0. 5-6 h即可释放出原生质体；本步骤中，注入溶液A的量根据叶片 碎片的多少来决定，以溶液A刚好淹没叶片碎片小段为宜；培养皿需用封口胶封口以避免 染菌；培养皿在恒温摇床上震荡，使溶液A与叶片碎片充分接触； 3)溶液A酶解完成后，打开培养皿，用吸头轻轻吹打叶片，即可充分释放出酶解出来的 原生质体； 二） 原生质体的纯化：将酶解0. 5-6 h左右原生质体混合液用200目的细胞筛过滤，再 将滤液置于2 ml离心管中，在100-500 g/min下离心2-8 min，使原生质体沉降，然后弃上 清夜，将溶液B缓慢加入沉降物中进行轻轻重悬，在100-500 g/min的转速下离心2-5次， 每次2-8 min，最终得到纯化的原生质体； 三) 原生质体产量的测定：将纯化后的原生质体转入溶液B中，定量成2 ml，轻轻吹打， 使原生质体分布均匀；取一块干净的血球计数板，盖上盖玻片，用移液枪吸取一滴原生质体 液加在盖玻片一侧边缘，待液体充满计数区，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，每次 重复数三遍，取平均值；根据加入溶液A中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体的 产量，计算结果以每克叶片细胞数表示(个/g); 四） 原生质体活力的鉴定：利用FDA (荧光素双醋酸酯)透过原生质体后，在酯酶的作用 下迅速分解，放出荧光素，使有活力的原生质体发出黄绿色的荧光从而来鉴定原生质体的 活力，计算原生质体活力时需在明视野下观察原生质体总数，然后再转到荧光下记录有活 力的原生质体数，最后计算原生质体活力率。
【文档编号】C12Q1/06GK104357377SQ201410671534
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】徐德林, 储士润, 张 林, 杨璐萍, 钱刚 申请人:遵义医学院