一种燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物生物【技术领域】，具体公开了一种燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法，利用一个SSR(Simple Sequence Repeats，简单重复序列)分子标记在不同倍性燕麦属植物中大小与拷贝数不同的特性，结合PCR扩增技术和凝胶电泳技术，通过扩增产物片段数目的不同，快速鉴定出燕麦属植物的染色体倍性。本发明的优点为能够在事先不清楚燕麦属植物倍性的条件下，快速地鉴定出该植物的倍性，燕麦属植物皆可适用于本方法。
【专利说明】一种燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物【技术领域】，具体涉及一种燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的 方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 燕麦广泛分布于世界各地，是重要的粮食和饲草饲料作物。燕麦营养丰富，与 小麦、水稻、玉米等作物相比，燕麦籽粒中的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质元素 等营养指标均位居前列，此外，燕麦中还含有丰富的可溶性膳食纤维。国内外大量研 究证明燕麦能够降血脂和胆固醇且无副作用，具有调节人体免疫功能，增强抵抗力和 抑制糖尿病等作用[RipsinCM,KeenanJM,JacobsDR,ElmerPJ,WelchRR,VanHorn LjLiuKjTurnbullWHjThyeFWjKestinMjHegstedMjDavidsonDMjDavidsonMHjDugan LDjDemark-WahnefriedWjBelingS.Oatproductsandlipidlowering.JAmMed Assoc. 1992, 267 (24) : 3317-3325]，是谷物中最好的全价营养食品之一。
[0003] 在植物学分类上，燕麦属于禾本科燕麦属草本植物，前人通过对燕麦不同种 进行远缘杂交并对亲本及杂种染色体进行观察分析，将燕麦属植物分为二倍体、四倍 体和六倍体3个种群，约30个种[郑殿升.中国燕麦的多样性.植物遗传资源学 报.2010, 11 (3) :249-252]。栽培种普通燕麦（Avenasativa)为六倍体，而野燕麦多为二倍 体和四倍体，分布广泛，并且有些野生种和栽培种十分相似，单从形态上难以区分，对栽培 燕麦的种子生产和品种纯度有着不良影响。
[0004]另一方面，单倍体及其加倍后的多倍体在植物细胞学、作物遗传及育种研究上具 有重要作用，可加速育种进程，提高选育效益，因而倍性育种是现代育种的一个重要组成部 分。倍性鉴定是倍性育种及其应用的重要环节，如何应用最简便、有效且尽可能早期鉴定出 植株的倍性水平，可以大大减少育种的工作量及盲目性，降低成本，加速育种进程，在农作 物倍性育种中具有重要意义[陶抵辉，李小红，王利群，周杰良，陈涌，霍稳根.植物染色体 倍性鉴定方法研究进展.生命科学研究.2009, 13 (5) :453-458]。
[0005]目前对生物染色体倍性鉴定的方法主要有两大类型：直接鉴定法和间接鉴定法 [李懋学，张柿方.植物染色体研究技术.东北林业大学出版社.1991]。
[0006] 直接法是利用一定时期一定部位的组织细胞对进行染色体染色、计数，是最直接、 最准确的倍性鉴定方法。其流程包括：培养材料一取材预处理一细胞固定一细胞解离一染 色剂染色，最后通过显微镜下观察对染色体进行计数。虽然染色体计数为最直接、最准确的 倍性鉴定方法，但其制片要达到理想的计数结果技术要求高，对某些植物有一定难度。制片 过程中的各种处理方式方法、步骤影响因素多，要达到理想真实结果需进行大量深入的研 究和总结。
[0007] 间接法包括形态指标鉴定法，流式细胞分析法，杂交鉴定法，分子鉴定法等。形 态指标法利用不同倍性的种间形态差异来区分倍性，这种方法受环境影响大且依赖鉴定 人员的实践经验。流式细胞分析法利用流式细胞仪检测细胞DNA含量判定倍性，快速准 确方便，不受外界环境影响，但需要有较昂贵的专门设备，并且维护人员需较高的专业水 平以及仪器操作复杂。杂交鉴定法通过与已知倍性的种杂交，通过后代存活率及育性 判定物种倍性，更加费时费力。分子鉴定法指利用RFLP[SaikiRK，ScharfS，Faloona F,MullisKB,ErlichHA,ArnheimN.Enzymaticamplificationofbeta-globingenomic sequencesandrestrictionsiteanalysisfordiagnosisofsicklecellanemia. Science. 1985,230(4732) :1350-1354],AFLP[VosP1HogersR1BleekerM1Reijans M,vandeLeeT,HornesM,FrijtersA,PotJ,PelemanJ,KuiperM.AFLP:anew techniqueforDNAfingerprinting.NucleicAcidsRes. 1995, 23(21):4407-4414]、 RAPD[WilliamsJG,KubelikAR,LivakKJ,RafalskiJA,TingeySV.DNApolymorphisms amplifiedbyarbitraryprimersareusefulasgeneticmarkers.NucleicAcids Res. 1990, 18(22):6531-6535]>SSR[Jarne,PandLagoda,PJ.Microsatellites,from moleculestopopulationsandback.TrendsEcolEvol. 1996, 11 (10) :424-429]等分 子标记技术对物种进行倍性鉴定的方法。前人利用AFLP标记对不同倍性西瓜分子遗传变 异进行了比较，鉴定出了 2倍体、3倍体和4倍体西瓜的特异标记[刘文革，王鸣，阎志 红.西瓜二倍体及同源多倍体遗传差异的AFLP分析.果树学报.2004, 21 (I) :46-49];而 利用RAH)标记对金鱼草的研究也表明不同倍性金鱼草基因组DNA存在有分子差异[吴 福川，胡秀，郑思乡.不同倍性金鱼草基因组DNA随机扩增多态性研究.云南农业大学学 报.2005, 20 (4) : 482-485]。这些研究表明不同倍性的种间基因组DNA存在分子差异，可以 通过现代分子生物学技术将其区分开来。
[0008] 综上所述，作为倍性鉴定的直接方法，染色体制片法虽然直观可信，但操作过程比 较繁琐，工作量大，费时费力且需要较高的细胞学操作技术，难以大规模量化，所以人们一 直在探索简便、快速、准确鉴定染色体倍性的方法。现代生物技术的发展能根据不同倍性种 间基因组DNA的不同，利用分子标记鉴别出这些差异，从而达到倍性鉴定的目的，但在燕麦 中尚无此类研究的报道，因而发展一种能够快速鉴定燕麦属植物倍性的方法对于燕麦种质 资源的鉴定利用、分子育种、品种纯度检测以及燕麦属植物的起源进化研究具有十分重要 的意义。
【发明内容】
[0009] 本发明依据不同倍性燕麦属植物以特异引物对进行PCR扩增后电泳得到的扩增 产物大小与拷贝数不同的特性，提供一种燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法及其应 用。
[0010] 本发明的燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法，其为利用SSR分子标记的特异 引物对，对燕麦属植物的DNA样品进行PCR扩增和电泳，通过电泳条带显示的扩增产物片段 数目的不同，鉴定出燕麦属植物样品的染色体倍性；
[0011] 所述特异引物对的核苷酸序列为：
[0012] 上游引物：5' -AGCGTCTGCTTCAAAATCTGTT-3'（如SEQIDNO. 1 所示）
[0013]下游引物：5' -TTTCTTCCTGCCGCGTTAAGTT-3'（如SEQIDNO. 2 所示）。
[0014] 所述PCR扩增，其反应体系如下：
[0015] 特异引物对 2μ1 DNA样品 0.1-1 1〇χ PCR Buffer 5 μ? IOmM的dNTP 1 μ? Taq酶 1 μ? ddH20 36μ1
[0016] 反应体系总体积为50μ1。
[0017] 所述PCR扩增，其反应条件为：94°C预变性5min;94°C变性20sec，55°C复性 30sec，72°C延伸lmin，35 个循环；72°C延伸 7min。
[0018] 所述电泳为凝胶电泳，优选为聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0019] 所述DNA样品为基因组DNA样品。
[0020] 所述鉴定出燕麦属植物样品的染色体倍性，其标准为：按照电泳条带显示的扩增 产物片段的数量鉴定，数量为一条的是二倍体，数量为两条的是四倍体，数量为三条的是六 倍体。
[0021] 本发明还提供用于所述燕麦属植物染色体倍性快速鉴定方法的特异引物对，其核 苷酸序列为：
[0022]上游引物：5' -AGCGTCTGCTTCAAAATCTGTT-3'（如SEQIDNO. 1 所示）
[0023]下游引物：5' -TTTCTTCCTGCCGCGTTAAGTT-3'（如SEQIDNO. 2 所示）。
[0024] 本发明还提供所述燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法在燕麦属植物中的应 用。
[0025] 本发明的燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法，利用一个SSR(Simple SequenceR印eats，简单重复序列）分子标记在不同倍性燕麦属植物中大小与拷贝数不同 的特性，结合PCR扩增技术和凝胶电泳技术，通过扩增产物片段大小及数目的不同，快速鉴 定出燕麦属植物的染色体倍性。本发明的优点为能够在事先不清楚燕麦属植物倍性的条件 下，快速地鉴定出该植物的倍性，燕麦属植物皆可适用于本方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为本发明实施例3对不同倍性燕麦属植物DNA扩增产物的电泳结果照片。
[0027]图2为本发明实施例4燕麦二倍体植物的细胞染色体照片及核型图。
[0028]图3为本发明实施例4燕麦四倍体植物的细胞染色体照片及核型图。
[0029]图4为本发明实施例4燕麦六倍体植物的细胞染色体照片及核型图。
[0030] 其中，图1中PCR产物电泳条带序号代表的依次为M:20bp ladder Takara ;1-3:Α· strigosa；4-6:A. hispanica；7-9:A. brevis；10-12:A. nudabrevis；13-15:A. maroccana； 16-18:A. murphy；19-21:A. magna；22-24:A. sativa；25-27:A. fatua；28-30:A. sterilis； 31_33:A. chinensis。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中，燕麦属植物材料均取自国家作物种质 库，所用的液氮购自北京绿氧天罡科技开发有限公司、CTAB缓冲液购自北京鼎国昌盛生物 技术有限责任公司、氯仿购自北京化学试剂公司（分析纯）、异戊醇购自北京化学试剂公 司（分析纯）、异丙醇购自北京化学试剂公司（分析纯）、乙醇购自北京化学试剂公司（分 析纯）、无菌水购自大连宝生物工程有限公司、TE缓冲液购自大连宝生物工程有限公司、 PCRBuffer购自大连宝生物工程有限公司、dNTP购自大连宝生物工程有限公司、Tag酶 购自大连宝生物工程有限公司、CldH2O购自大连宝生物工程有限公司、特异引物对由上海 invitrogen生物技术有限公司合成、TBE缓冲液购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公 司、Acr-Bis购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司、四甲基二乙胺（TEMED)购自北京 鼎国昌盛生物技术有限责任公司、过硫酸铵（APS)购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公 司、琼脂糖购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司（分析纯）、冰醋酸购自北京化学试剂 公司（分析纯）4 8勵3购自北京化学试剂公司（分析纯）、NaOH购自北京化学试剂公司（分 析纯）、甲醛购自北京化学试剂公司（分析纯）。
[0032] 实施例1燕麦属植物基因组DNA的提取
[0033]本实施例以燕麦属植物A.strigosa(砂燕麦）、A.hispanica(西班牙燕麦）、 A.brevis(短燕麦）、A.nudabrevis(小粒裸燕麦）、A.maroccana(马罗卡燕麦）、 A.murphy(墨菲燕麦）、A.magna(大燕麦）、A.sativa(普通栽培燕麦）、A.fatua(普通野燕 麦）、A.sterilis(野红燕麦）和A.chinensis(莜麦）作为实验对象。
[0034]以上述燕麦属植物的幼嫩叶片分别作为材料，利用CTAB法提取燕麦DNA，具体方 法如下：取材料0.lg，加液氮后迅速研磨。将研磨好的材料转入I. 5ml离心管中，立即加入 600μ1预热的2XCTAB缓冲液，颠倒混匀，65°C下保温10_20min，其中不时摇动。加入等体 积的氯仿/异戊醇（体积比1/1，下同），轻缓颠倒混勻，室温下12,OOOr/min离心10-20min。 取上清转至另一离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇，轻缓颠倒混匀，室温下12,OOOr/min 离心10_20min。取上清，加入等体积异丙醇，_20°C下放置30min。3, 500-4,OOOr/min离心 5-10min，去上清，体积百分含量70%的乙醇溶液洗沉淀，干燥后，加入30μITE缓冲液溶 解沉淀（可以无菌水替代）。
[0035] 实施例2对燕麦属植物基因组DNA的PCR扩增
[0036] 对实施例1中提取的各种燕麦基因组DNA进行PCR扩增，方法如下：
[0037] 取一支干净无菌的0.21111离心管，向其中加入以下试剂：(1(1!1 20,36 4 1;10\?〇1? Buffer，5yI;dNTP(10mMeach)，ly1 ;特异引物对的上游引物（SPl)/下游引物（SP2)， 2μ1 ;燕麦基因组DNA，0. 1_1μg;Taq酶，1μ1。
[0038] 特异引物对的核苷酸序列为：
[0039]上游引物（SPl) :5' -AGCGTCTGCTTCAAAATCTGTT-3'（如SEQIDNO. 1 所示）
[0040]下游引物（SP2) :5' -TTTCTTCCTGCCGCGTTAAGTT-3'（如SEQIDNO. 2 所示）。
[0041]按如下反应条件进行扩增：94°C5min;94°C20sec, 55°C30sec, 72°Clmin, 35cycle s;72°C7min。
[0042] 实施例3扩增结果的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
[0043] 对实施例2得到的扩增产物进行电泳检测，具体方法如下：
[0044]胶的制备：取IOOml烧杯，向其中加入ddH20 18ml，5XTBE6ml，40 %Acr-Bis 6ml，TEMED30μ1，10%APS300μ1，混合均匀备用。将玻璃板装配好，用质量百分比10% 的琼脂糖封底，待琼脂糖凝住，把配好的胶沿缝隙轻轻灌进两玻璃板间，防止出现气泡。插 入梳子静置半个小时以待胶凝结。
[0045] 电泳：将制好的板拔去梳子后，组装到电泳槽上，上、下槽缓冲液为1.0ΧΤΒΕ。在 扩增样品中加入3μIloadingbuffer,混勻，吸入2. 5μ1的样加入点样孔中，恒电压220V 电泳120min。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，将胶剥离下来，等待银染。
[0046] 显影：将剥离下的胶放入在塑料盒中，加入200mlCldH2O漂洗胶块后倒弃，加入 90mlddH20、10ml乙醇和500μ1冰醋酸固定，轻摇3-5min，加入Iml的质量百分含量20% AgNO3溶液染色7-10min，倒掉染色液，用CldH2O快速洗2次，倒掉ddH20。在塑料盒中加入 IOOml的质量百分含量3%NaOH溶液和500μ1甲醛显影，轻摇直至条带显示清楚，倒掉显 影液，加入CldH2O清洗，取出胶平铺照相。
[0047] 电泳结果见图1，其中PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带序号代表的依次是： M:20bpladderTakara；1-3:A.strigosa；4-6:A.hispanica；7-9:A.brevis；l〇-12:A. nudabrevis；13-15:A.maroccana；16-18:A.murphy；19-21:A.magna；22-24:A.sativa； 25_27:A.fatua;28_30:A.sterilis;31_33:A.chinensis。
[0048]可从电泳结果中判读出A.strigosa、A.hispanica、A.brevis和A.nudabrevis有 一条清晰的条带，为二倍体，A.maroccana、A.murphy和A.magna有两条清晰的条带，为四倍 体，A.sativa、A.fatua、A.sterilis和A.chinensis有三条清晰的条带，为六倍体。
[0049] 实施例4燕麦属植物染色体倍性的观察鉴定
[0050] 参考刘伟等的方法[刘伟，张宗文，吴斌.加拿大引进的二倍体燕麦种质的核型鉴 定.植物遗传资源学报.2013, 14 (1) : 141-145]，对实施例1-3所涉及的燕麦属植物的染色 体倍性进行观察鉴定，具体方法如下：
[0051] 取籽粒饱满的燕麦种子放在洁净的培养皿中，加水浸没种子，置于2 3 °C恒温培养 箱中培养直到露白，将露白种子放在洁净的垫有已灭菌浸水滤纸的培养皿中，置于4°C冰箱 48h，然后置于23°C恒温培养箱中长根，待根长至I. 0-2.Ocm时，剪取新生粗壮根尖于冰水 中预处理48h，接着将根尖转入卡诺氏固定液（无水乙醇：冰乙酸=3 : 1，V/V)中在4°C 下进行固定24h，然后用lmol/L盐酸在60°C下解离10min，最后用改良的苯酚品红进行染 色10min，进行常规压片，制好的片子在光学显微镜下观察并拍照，具体见图2、图3、图4 : A.strigosa、A.hispanica、A.brevis和A.nudabrevis为二倍体，A.maroccana、A.murphy 和A.magna为四倍体，A.sativa、A.fatua、A.sterilis和A.chinensis为六倍体。
[0052] 结果显示，实施例1-3的方法鉴定得到的燕麦属植物染色体倍性与使用实施例4 的方法鉴定得到的结果相一致，说明实施例1-3的方法可准确鉴定燕麦属植物染色体倍 性，且其具有所得到的条带清晰、判断方法简单的优点。
[0053] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法，其特征在于，其为利用SSR分子标记 的特异引物对，对燕麦属植物的DNA样品进行PCR扩增和电泳，通过电泳条带显示的扩增产 物片段数目的不同，鉴定出燕麦属植物样品的染色体倍性； 所述特异引物对的核苷酸序列为： 上游引物：5' -AGCGTCTGCTTCAAAATCTGIT-3'（如 SEQ ID NO. 1 所示） 下游引物：5' -TITCTTCCTGCCGCGTTAAGIT-3'（如 SEQ ID NO. 2 所示）。
2. 如权利要求1所述的燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法，其特征在于，所述PCR 扩增，其反应体系如下：
反应体系总体积为50 ii 1。
3. 如权利要求1所述的燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法，其特征在于，所述PCR 扩增，其反应条件为：94°C预变性5min ;94°C变性20sec，55°C复性30sec，72°C延伸lmin， 35个循环；72°C延伸7min。
4. 如权利要求1所述的燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法，其特征在于，所述电 泳为凝胶电泳。
5. 如权利要求1所述的燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法，其特征在于，所述电 泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳。
6. 如权利要求1所述的燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法，其特征在于，所述DNA 样品为基因组DNA样品。
7. 如权利要求1所述的燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法，其特征在于，所述鉴 定出燕麦属植物样品的染色体倍性，其标准为：按照电泳条带显示的扩增产物片段的数量 鉴定，数量为一条的是二倍体，数量为两条的是四倍体，数量为三条的是六倍体。
8. 用于权利要求1-7任一项所述燕麦属植物染色体倍性快速鉴定方法的特异引物对， 其特征在于，其核苷酸序列为： 上游引物：5' -AGCGTCTGCTTCAAAATCTGIT-3'（如 SEQ ID NO. 1 所示） 下游引物：5' -TITCTTCCTGCCGCGTTAAGIT-3'（如 SEQ ID NO. 2 所示）。
9. 权利要求1-7任一项所述的燕麦属植物染色体倍性快速鉴定的方法在燕麦属植物 鉴定中的应用。
10. 权利要求8所述的特异引物对在燕麦属植物鉴定中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104357577SQ201410709524
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】吴斌, 张宗文 申请人:中国农业科学院作物科学研究所