一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，属于遗传工程领域。本发明是以重组枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS作为出发菌株，通过同源重组敲除α-乙酰乳酸合成酶编码基因和α-乙酰乳酸脱羧酶编码基因，阻断了宿主菌由丙酮酸生成乙偶姻和2,3-丁二醇的途径。在已敲除alsS和alsD的宿主菌内，过量表达来源于酿酒酵母的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因，加强乙酰氨基葡萄糖合成途径，提高了重组枯草芽孢杆菌中乙酰氨基葡萄糖的产量，达到38.46g/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。
【专利说明】一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，尤其是一种通过 同源重组敲除alsS和alsD提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于遗传 工程领域。
【背景技术】
[0002] 乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及 动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软 骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加 来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目 前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污 染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。
[0003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化 学品的生产宿主，其产品被FDA认证为"generally regarded as safe"（GRAS)安全级别。 因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效 途径。
[0004] 本发明通过阻断乙偶姻的合成以减弱糖酵解途径，避免了重组B. subtilis中心 碳代谢溢流造成的乙偶姻、2, 3- 丁二醇等副产物大量积累，进而提高氨糖合成代谢通量以 进一步提高GlcNAc产量。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯 草芽孢杆菌，是以枯草芽孢杆菌BSGN6-P xylA-glmS为出发菌株，同时敲除α -乙酰乳酸合成 酶编码基因（alsS)和α-乙酰乳酸脱羧酶编码基因（alsD)，并表达了氨基葡萄糖乙酰化 酶。
[0006] 所述枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA-glmS是以枯草芽孢杆菌168为基础，基因型作如下 改造：Δ nagP Δ gamP Δ gamA Δ nagA Δ nagB Δ Idh Δ pta: : 1οχ72,并以木糖诱导启动子 PxylAijf 控表达glmS基因。
[0007] 所述枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA_glmS的构建方法参见：Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improvedN-acetyIglucosamine production. Yanfeng Liu, et al. Metabolic Engineering, 23(2014)p42-52.
[0008] 所述a -乙酰乳酸合成酶编码基因如NCBI-Gene ID:936852所示，a -乙酰乳酸 脱羧酶编码基因如NCBI-Gene ID:936857所示。
[0009] 所述氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因（GNAl)来源于酿酒酵母。
[0010] 本发明要解决的另一个技术问题是提供一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的方法， 通过同源重组敲除敲除a-乙酰乳酸合成酶编码基因（alsS)和a-乙酰乳酸脱羧酶编 码基因（alsD)，阻断宿主菌由丙酮酸生成乙偶姻和2, 3- 丁二醇的途径，在已敲除alsS和 alsD的宿主菌内，运用表达载体pP43NMK过量表达酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae S288C)中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因（GNAl)，通过改造代谢途径，实现乙酰氨基葡萄糖 广量的提1?。
[0011] 本发明还提供了一种应用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产氨基乙酰葡萄糖的方 法，是将种子培养液转入发酵培养基，于30-37°C、200-220rpm条件下培养44-52h。
[0012] 所述发酵培养基按g/L计含有：玉米浆干粉20,酵母粉20, Κ2ΗΡ04 · 3H20 12. 5， ΚΗ2Ρ042· 5, CaC035,微量元素 15ml/L ;微量元素溶液（g/L) =MnSO4 · 5H20 L 0, Cocl2 · 6H20 0· 4, NaMoO4 · 2H20 0· 2, ZnSO4 · 7H20 0· 2, Alcl3 · 6H20 0· 1，Cucl2 · H2O 0· 1，H3BO4O. 05,含 5M HCl0
[0013] 本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可提高乙酰氨基葡萄糖在胞外积累，其浓度可达 到38. 46g/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提 供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。
【具体实施方式】
[0014] 种子培养基（g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5, NaCl 10。
[0015] 发酵培养基（g/L):玉米浆干粉 20,酵母粉 20, K2HP04 · 3H20 12. 5，KH2P042. 5， CaC035,微量元素 15ml/L ;微量元素溶液（g/L) =MnSO4 · 5H20 L 0, Cocl2 · 6H20 0· 4， NaMoO4 ·2Η200· 2, ZnSO4 ·7Η20 0· 2, Alcl3 ·6Η20 0.1 ,CuCl2 · H2O 0.1 ,H3BO4O. 05,含 5M HCl。
[0016] 培养条件：将37°C、200rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入发酵培养基，于 37 °C、200rpm条件下培养48h。
[0017] 乙酰氨基葡萄糖的测定方法：高效液相色谱（HPLC)检测法：Agilent 1200,RID检 测器，順2柱（250X4. 6mm，5 μ m)，流动相：70%乙腈，流速0· 75mL/min，柱温30°C，进样体积 为 10 μ L。
[0018] 实施例1敲除α -乙酰乳酸合成酶编码基因（alsS)和α -乙酰乳酸脱羧酶编码 基因（alsD)
[0019] 根据NCBI上公布的枯草芽孢杆菌168 (ATCC No. 27370)的α -乙酰乳酸合成酶编 码基因（alsS)和α-乙酰乳酸脱羧酶编码基因（alsD)上下游序列，设计敲除框同源臂扩 增引物，左臂上下游引物分别为：al sSD-L-F : 5 ' -CCATGTATAGAGTAGGCCATGCTTCTTTAGC-3 ' 和
[0020] alsSD-L-R ：
[0021] 5, -AGGATCCCCGGGTACCGAGCTCCACCCTCACTCCTTATTATGCATTTTAAACGTAAAA-3,；右臂 上下游引物分别为：alsSD-R-F:
[0022] 5' -GTCGACCTGCAGGCATGCAAGCAAGAAAAAAAGAAAGCCCCTTTTAGCAGGG-3' 和 alsSD -R-R:5' -CTACTGCGCTGTCAGAAGCAAAATCAG-3'。运用上述引物从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 168)基因组中扩增敲除框中包含的左臂和右臂。根据NCBI上公布的p7Z6质粒 序列（南京农业大学，闻新博士惠赠 ，NCBI accession no. EU541492)，设计引物，扩增博来 霉素抗性基因（zeo)，上下游引物分别为：alsSD-Z-F:
[0023] 5' -TTTTACGTTTAAAATGCATAATAAGGAGTGAGGGTGGAGCTCGGTACCCGGGGATCCT-3' 和 alsSD-Z-R:5, -
[0024] CCCTGCTAAAAGGGGCTTTCTTTTTTTCTTGCTTGCATGCCTGCAGGTCGAC-3'。通过融合 PCR 方法，将敲除框左、右臂及抗性基因融合为敲除框。通过测序确认alsSD敲除框构建成功， 序列如SEQ ID NO. 9所示。
[0025] 实施例2重组枯草芽孢杆菌的构建
[0026] 将构建好的敲除框转化枯草芽孢杆菌BSGN6-PxylA_glmS，通过博来霉素抗性平板 筛选、菌落PCR验证，确认α-乙酰乳酸合成酶编码基因（alsS)和α-乙酰乳酸脱羧酶编 码基因敲除成功，得到重组枯草芽孢杆菌BSGNlO。
[0027] 根据 NCBI 上公布的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) S288C (ATCC 204508) 中氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因（GNAl)，设计引物GNAl-F :
[0028] 5' -GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGCTTACCCGATGGATTTTATA-3'， GNAl-R :5' -CCCAAGCTTCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACG-3'。使用上述引物从酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae S288C)基因组中扩增氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因（GNAl)。 扩增片段经KpnI和HIndIII双酶切后连接至pP43NMK表达载体。酶切验证并测序，确认重 组质粒PP43-GNA1构建成功。
[0029] 将构建好的表达载体PP43-GNA1转化枯草芽孢杆菌BSGNlO。采用GNAl-F及 GNAl-R引物挑选转化子进行菌落PCR，出现480bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。
[0030] 实施例3发酵生产乙酰氨基葡萄糖
[0031] 将37°C、200rpm下培养12h的种子以5%的接种量转入发酵培养基，于37°C、 200rpm条件下培养48h。发酵48h，发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量达到38. 46g/L，比未 敲除alsS、alsD的对照菌30. 25g/L提高了 27. 1 %。通过敲除α -乙酰乳酸合成酶编码基 因（alsS)和α-乙酰乳酸脱羧酶编码基因（alsD)，并且在已敲除nagP宿主中过量表达氨 基葡萄糖乙酰化酶编码基因（GNAl)，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组枯草芽孢杆菌胞外产量 的提商。
[0032] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1. 一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组枯草芽孢杆菌，是以枯草芽孢杆菌 BSGN6-PxylA-glmS为出发菌株，敲除其a -乙酰乳酸合成酶编码基因和a -乙酰乳酸脱 羧酶编码基因，并表达氨基葡萄糖乙酰化酶。
2. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述出发菌株是以枯草芽 抱杆菌168为基础，基因型作如下改造 ：A nagP A gamP A gamA A nagA A nagB A ldh A pta: : 1〇X72,并以木糖诱导启动子PxylA调控表达氨基葡萄糖合成酶基因 glmS。
3. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述a _乙酰乳酸合成 酶编码基因如NCBI-Gene ID:936852所示，a-乙酰乳酸脱羧酶编码基因如NCBI-Gene ID :936857 所示。
4. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，编码所述氨基葡萄糖乙酰 化酶的基因来源于酿酒酵母。
5. -种构建权利要求1-4任一所述重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，通过同源 重组敲除敲除a-乙酰乳酸合成酶编码基因和a-乙酰乳酸脱羧酶编码基因，阻断宿主菌 由丙酮酸生成乙偶姻和2, 3- 丁二醇的途径，在已敲除alsS和alsD的宿主菌内，运用表达 载体PP43NMK过量表达酿酒酵母来源的氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因。
6. -种应用权利要求1-4任一所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产氨基乙酰葡萄糖的 方法，其特征在于，是将种子培养液转入发酵培养基，于30-37°C、200-220rpm条件下培养 44-52h。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基按g/L计含有：玉米浆 干粉 20,酵母粉 20, K2HP04 ? 3H20 12. 5, KH2P042. 5, CaC035,微量元素 15ml/L ;微量元素溶 液按 g/L 计含有：MnS04 ? 5H20 1. 0, Cocl2 ? 6H20 0? 4, NaMo04 ? 2H20 0? 2, ZnS04 ? 7H20 0? 2， Alcl3 ? 6H20 0? 1，Cucl2 ? H20 0? 1，H3B040. 05,含 5M HC1。
8. 权利要求1-4任一所述重组枯草芽孢杆菌在氨基乙酰葡萄糖生产中的应用。
【文档编号】C12P19/26GK104498394SQ201410709273
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】陈坚, 刘龙, 堵国成, 李江华, 马文龙, 刘延峰, 朱妍萩, 顾洋 申请人:江南大学