基于指数级非酶扩增及电化学发光原理的microRNA痕量检测方法
【专利摘要】本发明公开一种基于指数级非酶扩增及电化学发光原理的microRNA痕量检测方法。本发明采用非酶扩增及杂交链式反应体系，针对检测目标microRNA序列设计特异性的DNA发卡探针H1、H2、H3、H4序列；当扩增体系中含有待测microRNA，由H1+H2双链复合结构触发后续的杂交链式反应过程，杂交链式反应过程由H3和H4共同完成；经链霉亲和素磁珠捕捉，将扩增产物捕捉，并由电化学检测系统产生并检测电化学发光信号。该方法全过程不需要酶的参与，原理简单且检测成本低；具有恒温扩增、高灵敏度、操作简单、易于普及等优点。该方法适用于核酸检测，也可以结合蛋白适配体相关技术用于蛋白检测。
【专利说明】基于指数级非酶扩增及电化学发光原理的microRNA痕量 检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸电化学痕量检测【技术领域】，特别涉及一种基于指数级信号增强非 酶扩增平台、并结合电化学发光原理的microRNA痕量检测方法。
【背景技术】
[0002] microRNA(miRNA)是一类长度在19?25个核苷酸范围内的非编码、内源性微小 RNA，其广泛分布于真核生物细胞中，并参与重要的生命历程。近年来，随着分子生物学及相 关学科的进步，研究者已发现了数百种miRNA，并确定了其中部分miRNA的主要功能。此类 RNA主要行使基因调控功能，由非编码序列转录成初级转录物后，初级转录物经过不同核酸 酶的剪切、加工而产生。据研究者推测，动物基因组内30%左右的编码基因都受到了 miRNA 的直接或者间接调控。研究表明，miRNA参与众多重要的生化调节途径，主要包括发育过程、 病毒防御、器官发育与形成、细胞增殖和凋亡等。
[0003]作为经典的miRNA检测手段，Northern杂交（Northern blotting)方法已取得了 显著的成果，但其耗时、灵敏度不高、且需要专业人员操作，这大大降低了该方法的推广及 普及。近年来，研究者提出了基于毛细管电泳、核酸扩增检测技术、纳米信号放大系统、表 面等离子共振技术等方法。这些方法有着较高的检测灵敏度，耗时短，但是所需要的操作繁 琐，属技术密集型，并且需要昂贵的仪器设备作为这些技术的支撑点。因此，发展一种高灵 敏、高特异、并且经济、快速安全的检测miRNA的方法已成为了近年来广大研究者关注的热 点之一。近年来，随着非酶扩增技术的普及，新型的miRNA扩增方法也随之出现，对于miRNA 检测领域具有重大意义。目前，中国专利201310294770. 7公开了一种基于非酶扩增及电化 学发光原理的microRNA检测方法，该方法实现了恒温的、非酶扩增的microRNA检测方式， 但是，该方法的灵敏度较低。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于指数级非酶扩 增及电化学发光原理的microRNA痕量检测方法。该检测方法是基于指数信号增强非酶扩 增平台及电化学发光原理相结合的microRNA痕量检测方法。该方法灵敏度高、特异性好、 准确、快速、操作简单，且整个扩增过程不需要酶的参与。因此，本发明在降低了检测成本的 基础上，为microRNA检测技术体系提供了一种全新的microRNA检测方法。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于指数级非酶扩增及电化学发光原 理的microRNA痕量检测方法，包括以下步骤：
[0006] (1)设计用于非酶扩增体系的发卡探针
[0007] 根据非酶扩增原理及microRNA序列设计非酶扩增体系所需的发卡探针H1及发卡 探针H2序列；发卡探针H1采用双头标记策略，其5'端和3'段都标记有6碳氨基，用于后 续连接电化学发光基团；H2的3'端标记生物素，作为磁捕捉过程中链霉亲和素磁珠的靶 点；其中，HI包含桥序列（编号5、6区段），用于连接后续的杂交链式反应过程；
[0008] (2)设计用于杂交链式反应体系的发卡探针
[0009] 在非酶扩增体系的基础上，并结合杂交链式反应原理，设计了杂交链式反应体系， 以获得持续性增强的信号扩增；用于杂交链式反应体系的发卡探针H3、以及H4的序列是在 桥序列的基础上设计的，该反应体系能特异的识别2*、5、6区段；当非酶扩增体系被触发， 产生的单链状态的2*区段，并配合5、6区段即可作为杂交链式反应的扩增触发器，以产生 杂交链式反应扩增信号；在没有目标microRNA时，发卡探针H1的2*区段是发卡茎部的组 成部分，为双链结构，因此，发卡探针H1、H2、H3及H4能相互共存，并不发生扩增；因而特异 性得到了有效的保证；
[0010]⑶电化学发光基团标记
[0011] 在所有发卡探针中，H2探针的3'端标记生物素，而HI、H3、H4的5'及3'端标 记6碳氨基，用以连接电化学发光基团；HI、H3、H4探针之所以采用"两端"标记的策略，是 为了提_灵敏度；
[0012] 电化学发光基团标记主要包括以下步骤：
[0013] a、取2. 50D发卡探针H1、H3、H4,离心5min，使粘在管壁的DNA落入管底，分别加入 75iiL 0. 1M硼酸钠，立即盖上管盖，充分上下振荡5min;
[0014] b、离心，并加入30 iiL 11. 2mM的电化学发光基团，充分混匀后避光孵育12小时； 然后，加入lmL预冷的无水乙醇，放入超低温冰箱中2小时；
[0015] c、离心，倒去浅黄色溶液，向DNA沉淀中加入lmL预冷体积分数80%乙醇水溶液洗 涤，放入超低温冰箱lh;
[0016] d、离心，倒去溶液，收集沉淀，加入lmL预冷体积分数80%乙醇水溶液洗涤，放入 超低温冰箱中lh;
[0017] e、离心，倒去溶液，收集沉淀，加20 iiL水稀释，分别获得HI、H3、H4探针溶液， 放-20°C保存；
[0018] (4)发卡探针预处理
[0019]为了使发卡探针H1、H2、H3、H4充分形成发卡结构，向H2及步骤（3)中得到的H1、 H3、H4探针溶液中分别加入磷酸盐缓冲液（PBS)，并将PBS终浓度设置为IX ;随后，加热至 95°C之后，使其充分变性；最后，梯度降温，每分钟降5°C、降至常温为止，分别得到发卡探 针111、112、113、114的预处理产物，产物保存于41：或-201：环境中备用 ；
[0020] (5)基于指数信号增强非酶扩增检测体系构建
[0021] 取一定量步骤（4)中得到的发卡探针H1、H2、H3、H4(终浓度皆为50nM)的预处理 产物，并加入PBS缓冲液（终浓度1 X)，再加入RNA酶抑制剂（终浓度1U/ y L)，最后加DEPC 水至100 y L ;充分混匀后，加入待测microRNA，37°C温浴2小时；
[0022] (6)产物清洗及分离
[0023] 向步骤（5)中加入链霉亲和素磁珠，37°C温浴30min后，用磁分离器分离，去除溶 液后，再加入1〇〇 U L的PBS缓冲液（终浓度1 X)溶解磁珠，再进行磁分离，并清洗，由此反 复清洗三次；
[0024] (7)信号检测
[0025]将步骤（6)中的产物，放入电化学发光全自动免疫分析仪中检测电化学发光信 号，并记录数据。
[0026] 步骤（1)中所述的DNA发卡探针为自身可以形成特定双链"茎环"结构DNA，其序 列可根据待测microRNA的序列改变而做相应改变；检测体系存在靶microRNA时，DNA发卡 探针H1的前端单链部结构通过碱基互补原则与靶microRNA结合，使DNA发卡探针的双链 茎部结构由于刚性作用而解链、结构发生变化，从而达到DNA发卡探针识别靶microRNA的 目的。发卡探针H1被打开后形成的单链部分可与发卡探针H2相作用，使H2打开发卡结构， 并使H1和H2形成互补的双链结构，并将目标microRNA与H1分离，达到循环扩增的目的； 由此，H1探针产生的单链状态的2*区段、以及本身为单链结构的5、6区段，将触发后续的 HCR过程；
[0027] 在本发明中，所涉及的DNA产品均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
[0028] 步骤（1)中所述的桥序列为CCTAATGGTGTGGC;
[0029] 步骤（3)中所述的超低温冰箱的温度优选为-60°C以下，更优选为-80°C;
[0030] 步骤（3)b中所述的离心的条件优选为12000rpm离心5min;
[0031] 步骤（3) c中所述的离心的条件优选为12000rpm离心20min;
[0032] 步骤（3) d和步骤（3) e中所述的离心的条件优选为12000rpm，4°C离心20min;
[0033]步骤（4)中所述的梯度降温的程序为 95°C 5min、90°C 5min、85°C 5min、80°C 5min、 75°C 5min、70°C 5min、65°C 5min、60°C 5min、55°C 5min、50°C 5min、45°C 5min、40°C 5min、 35°C 5min,30〇C 5min,25〇C 5min ；
[0034] 步骤（4)中所述的磷酸盐缓冲液（PBS)由生工生物工程有限公司提供，浓度为 20X;该缓冲液经过DEPC处理；
[0035] 所述的DEPC水为经过高温高压灭菌的0. 1%(v/v) DEPC水；DEPC是焦磷酸酸二乙 醋；
[0036] 步骤（5)中所述的RNA酶抑制剂由宝生物工程有限公司提供；37°C恒温环境可由 PCR仪或者水浴锅维持；
[0037] 步骤（5)中所述的待测microRNA优选为microRNA21,其序列为 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA；
[0038]所述的发卡探针 H1 的序列为 TCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTGTAGATAGCTTATCAG ACTCCTAATGGTGTGGC;其5'端和3'段都标记有6碳氨基；
[0039]所述的发卡探针 H2 的序列为 ATAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGTGTAG A;其3'端标记生物素（biotin);
[0040]所述的发卡探针 H3 的序列为 CCTAATGGTGTGGCCCATGITITGCCACACCATTAGGAGTCTG; 其5'端和3'段都标记有6碳氨基；
[0041]所述的发卡探针 H4 的序列为 ACATGGGCCACACCATTAGGITTCAGACTCCTAATGGTGTGGC; 其5'端和3'段都标记有6碳氨基；
[0042] 步骤（6)中所述的链霉亲和素磁珠是指链霉亲和素包被的磁珠，购自NEWENGLAND BioLabs公司，其终浓度0. 2mg/mL;
[0043]所述的电化学发光基团优选为三联吡啶钌；所述三联吡啶钌在中国专利 201310721893. 4、基于聚合物电化学发光信号放大的核酸检测方法中公开；
[0044]步骤（7)中所述的电化学发光全自动免疫分析仪优选为罗氏EleCSys2010电化学 发光全自动免疫分析仪；
[0045] 进一步地，所述的基于指数级非酶扩增及电化学发光原理的microRNA痕 量检测方法，所选用的microRNA为与人类癌症紧密相关的micr 〇RNA21时，其序列 为：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA，具体步骤如下：
[0046] ①设计DNA发卡探针H1、H2、H3、H4探针：首先，根据micr〇RNA21序列设计非酶扩 增体系的序列（发卡探针H1和H2)，并根据桥序列及杂交链式反应原理设计后续的杂交链 式反应扩增体系的序列（发夹探针H3和H4);
[0047] ②HI、H3及H4探针标记电化学发光基团，实验步骤如前所述；标记完成后，先加热 至95°C，使其充分变性，而后再梯度降温，每分钟降5°C、直至常温为止，产物保存于4°C环 境中备用；
[0048]③H2溶解于1 X磷酸盐缓冲液（PBS)，终浓度为10 ii M，并执行梯度降温过程；
[0049] ④基于指数信号增强非酶扩增检测体系的构建：100UL体系由发卡探针 HI (50nM)、H2 (50nM)、H3 (50nM)、H4 (50nM)、PBS 缓冲液（终浓度 1 X)，RNA 酶抑制剂（1U/ U L);最后，加入DEPC水体积补至100 ii L，充分混匀；
[0050] ⑤加入待测microRNA21 ;
[0051] ⑥37°C温浴2小时；
[0052]⑦向反应体系中加入链霉亲和素磁珠（终浓度0? 2mg/mL)，37°C温浴30min后，用 磁分离器分离，去除溶液后，再加入100 u L的PBS缓冲液（终浓度1X)溶解，再用磁分离 器分离，由此反复清洗三次；
[0053] ⑧电化学发光信号检测，将步骤⑦中的产物，放入罗氏EleCSys2010电化学发光 全自动免疫分析仪中检测电化学发光信号，并记录数据。
[0054] 本发明的基本原理如图1所示：本发明的扩增过程由非酶扩增及杂交链式反应构 成，"信号给出"步骤采用电化学发光模式。首先，针对检测目标microRNA序列设计特异 性的DNA发卡探针HI、H2、H3、H4序列；当扩增体系不存在待测microRNA时，扩增反应不 会被激活，发卡探针之间不能发生反应，因此，不会产生扩增产物。当扩增体系中含有待测 microRNA,待测microRNA可与发卡探针H1结合，导致H1莖部打开，由此产生的部分单链结 构与H2相作用，导致发卡探针H2茎部打开，并与H1形成H1+H2双链复合结构，并由H1+H2 双链复合结构触发后续的杂交链式反应过程。杂交链式反应过程由H3和H4共同完成。经 链霉亲和素磁珠捕捉，将扩增产物捕捉，并由电化学检测系统（Ele CSys2010)产生并检测 电化学发光信号。
[0055] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0056] (1)本发明采用非酶扩增及杂交链式反应体系：全过程不需要酶的参与，原理简 单且检测成本低。
[0057] (2)恒温扩增：在恒温条件下进行，只需37°C反应2h就能得到理想的实验结果。 反应装置简单，用水浴锅加热亦可。
[0058](3)高灵敏度：电化学发光实验的灵敏度已达到了lamol。实现了microRNA痕量 检测的目的。
[0059] (4)操作简单、易于普及。
[0060] (5)适用于核酸检测，也可以结合蛋白适配体相关技术用于蛋白检测：该实验原 理可用于DNA及RNA的检测，只要根据目标序列合理设计发卡探针序列即可。
【专利附图】
【附图说明】
[0061] 图1是基于指数信号增强非酶扩增平台的microRNA痕量检测方法的原理图。
[0062] 图2是发夹探针二维结构图；图2A为发夹探针H1的二维结构图，图2B为发夹探 针H2的二维结构图，图2C为发夹探针H3的二维结构图，图2D为发夹探针H4的二维结构 图。
[0063] 图3是非酶扩增体系扩增效率验证电泳图；其中，泳道H1为发夹探针H1的电泳 图；泳道H2为发夹探针H2的电泳图；泳道H3为发夹探针H3的电泳图；泳道H4为发夹探 针H4的电泳图；泳道对照组为发夹探针HI、H2、H3、H4无micr 〇RNA21的扩增效率电泳图； 泳道实验组为发夹探针HI、H2、H3、H4并加入micr〇RNA21的扩增效率电泳图。
[0064] 图4是非酶扩增/电化学发光检测平台灵敏度的结果图。
[0065] 图5是非酶扩增/电化学发光检测平台特异性的结果图。
[0066] 图6是肿瘤细胞检测灵敏度的结果图；A为HepG2细胞系；B为A549细胞系；C为 MCF7细胞系；D为HepG2细胞系、A549细胞系和MCF7细胞系相对于L02细胞系的相对电化 学发光强度的结果图。
[0067] 图7是肿瘤组织检测实验的结果图；A为肝癌组织，B为肺癌组织，C为乳腺癌组 织。
【具体实施方式】
[0068] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0069] 实施例1指数信号增强非酶扩增平台的构建及其可行性验证
[0070] 根据上述的指数信号增强非酶扩增平台原理、针对miCr〇RNA21序列设计非酶扩 增体系所需的发卡探针H1、H2、H3、H4,其序列如表1所示，其二维结构如图2所示。发卡探 针H1、H3、H4的5'及3'端标记有六碳氨基，相应的H2的3'端标记有生物素。发卡探针 均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，H1、H3、H4需标记电化学发光基团，而H2用TE缓 冲液溶解即可（终浓度10 U M，保存于-20冰箱）。H1、H3、H4标记过程如下：取2. 50D发卡 探针，离心5min,使粘在管壁的DNA落入管底，加入75ii L 0. 1M硼酸钠,立即盖上管盖，充分 上下振荡5min ;离心（12000rpm，5min)收集，加入30ii L 11. 2mM的三联批陡钌，避光孵育 12小时；加入lmL预冷的无水乙醇，放入超低温冰箱（-80°C )中2小时，离心（12000rpm， 2〇1^11);倒去浅黄色溶液，加入11^预冷80%乙醇洗涤，放入超低温冰箱（-80°〇111 ;离心 (12000rpm，4°C，20min);倒去溶液，加入lmL预冷80%乙醇洗涤，放入超低温冰箱（_80°C ) 中111，离心（12000印111，41：，201^11)，倒去溶液，收集沉淀，加201^水稀释，获得发卡探针 HI、H3、H4探针溶液，放-20°C保存。
[0071] 所述的三联吡啶钌在中国专利201410076390. 0、pH值依赖的三联吡啶钌重复结 晶合成法及其应用中公开；
[0072] 表1实施例中所用到的序列
[0073]
【权利要求】
1. 一种基于指数级非酶扩增及电化学发光原理的microRNA痕量检测方法，其特征在 于包括以下步骤： (1) 设计用于非酶扩增体系的发卡探针 根据非酶扩增原理及microRNA序列设计非酶扩增体系所需的发卡探针H1及发卡探针 H2序列；发卡探针H1的5'端和3'段都标记有6碳氨基；H2的3'端标记生物素；其中， H1包含桥序列； (2) 设计用于杂交链式反应体系的发卡探针 在非酶扩增体系的基础上，并结合杂交链式反应原理，设计了用于杂交链式反应体系 的发卡探针H3、以及发卡探针H4的序列；其中，发卡探针H3及H4的5'端和3'段都标记 有6碳氨基；发卡探针HI、H2、H3及H4能相互共存，并不发生扩增； (3) 电化学发光基团标记 电化学发光基团标记主要包括以下步骤： a、 取2. 50D发卡探针HI、H3、H4,离心5min，使粘在管壁的DNA落入管底，分别加入 75iiL 0. 1M硼酸钠，立即盖上管盖，充分上下振荡5min ; b、 离心，并加入30 yL 11. 2mM的电化学发光基团，充分混匀后避光孵育12小时；然后， 加入lmL预冷的无水乙醇，放入超低温冰箱中2小时； c、 离心，倒去浅黄色溶液，向DNA沉淀中加入lmL预冷体积分数80%乙醇水溶液洗涤， 放入超低温冰箱lh ; d、 离心，倒去溶液，收集沉淀，加入lmL预冷体积分数80%乙醇水溶液洗涤，放入超低 温冰箱中lh ; e、 离心，倒去溶液，收集沉淀，加20 y L水稀释，分别获得H1、H3、H4探针溶液，放-20°C 保存； (4) 发卡探针预处理 为了使发卡探针H1、H2、H3、H4充分形成发卡结构，向H2及步骤（3)中得到的H1、H3、H4 探针溶液中分别加入磷酸盐缓冲液，并将PBS终浓度设置为1 X ;随后，加热至95°C之后，使 其充分变性；最后，梯度降温，每分钟降5°C、降至常温为止，分别得到发卡探针HI、H2、H3、 H4的预处理产物，产物保存于4°C或_20°C环境中备用； (5) 基于指数信号增强非酶扩增检测体系构建 取一定量步骤（4)中得到的发卡探针HI、H2、H3、H4的预处理产物，使其终浓度皆为 50nM，并加入PBS缓冲液，使其终浓度为1 X，再加入RNA酶抑制剂，使其终浓度为1U/ y L， 最后加 DEPC水至100 ii L ;充分混匀后，加入待测microRNA，37°C温浴2小时； (6) 产物清洗及分离 向步骤（5)中加入链霉亲和素磁珠，37°C温浴30min后，用磁分离器分离，去除溶液后， 再加入100 y L的PBS缓冲液，使其终浓度为1 X，溶解磁珠，再进行磁分离，并清洗，由此反 复清洗三次； (7) 信号检测 将步骤￠)中的产物，放入电化学发光全自动免疫分析仪中检测电化学发光信号，并 记录数据； 所述的发卡探针的序列根据待测microRNA的序列改变而做相应改变。
2. 根据权利要求1所述的microRNA痕量检测方法，其特征在于： 步骤（1)中所述的桥序列为CCTAATGGTGTGGC。
3. 根据权利要求1或2所述的microRNA痕量检测方法，其特征在于： 步骤（5)中所述的待测 microRNA 为 microRNA21，其序列为 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。
4. 根据权利要求3所述的microRNA痕量检测方法，其特征在于： 所述的发卡探针 H1 的序列为 TCAACATCAGTCTGATAAGCTACCATGTGTAGATAGCTTATCAGACTC CTAATGGTGTGGC;其5'端和3'段都标记有6碳氨基； 所述的发卡探针 H2 的序列为 ATAAGCTATCTACACATGGTAGCTTATCAGACTCCATGTGTAGA ;其 3'端标记生物素； 所述的发卡探针 H3 的序列为 CCTAATGGTGTGGCCCATGITITGCCACACCATTAGGAGTCTG ;其 5'端和3'段都标记有6碳氨基； 所述的发卡探针 H4 的序列为 ACATGGGCCACACCATTAGGITTCAGACTCCTAATGGTGTGGC ;其 5'端和3'段都标记有6碳氨基。
5. 根据权利要求1、2或4所述的microRNA痕量检测方法，其特征在于： 步骤（4)中所述的梯度降温的程序为95°C 5min、90°C 5min、85°C 5min、80°C 5min、 75°C 5min、70°C 5min、65°C 5min、60°C 5min、55°C 5min、50°C 5min、45°C 5min、40°C 5min、 35°C 5min、30°C 5min、25°C 5min。
6. 根据权利要求1、2或4所述的microRNA痕量检测方法，其特征在于： 骤（6)中所述的链霉亲和素磁珠是指链霉亲和素包被的磁珠，其终浓度0.2mg/mL。
7. 根据权利要求1、2或4所述的microRNA痕量检测方法，其特征在于： 所述的电化学发光基团为三联吡啶钌。
8. 根据权利要求1、2或4所述的microRNA痕量检测方法，其特征在于： 步骤（3)b中所述的离心的条件为12000rpm离心5min ; 步骤（3)c中所述的离心的条件为12000rpm离心20min。
9. 根据权利要求1、2或4所述的microRNA痕量检测方法，其特征在于： 步骤（3)d和步骤（3)e中所述的离心的条件为12000rpm，4°C离心20min。
10. 根据权利要求1、2或4所述的microRNA痕量检测方法，其特征在于： 步骤（7)中所述的电化学发光全自动免疫分析仪为罗氏EleCSys2010电化学发光全自 动免疫分析仪。
【文档编号】C12Q1/68GK104450920SQ201410768156
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月11日 优先权日:2014年12月11日
【发明者】周小明, 邢达, 廖玉辉 申请人:华南师范大学