一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的方法
【专利摘要】一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的方法，它涉及反硝化脱硫细菌的筛选方法。本发明的方法：首先采集污泥，然后对污泥样品进行高通量测序，分析其菌群丰度波动和空间生态分布信息，根据群落组成与结构特点，采取不同的筛选方法。在不同的筛选方法下，对目标菌属采用夹层培养基进行厌氧培养，挑取单菌落进行分离培养，反复多次后，得单一菌落。共筛选到两类反硝化脱硫菌株，一类为自养反硝化脱硫菌即硫杆菌属；一类为异养反硝化脱硫菌，分别属于索氏菌属、固氮弧菌属、弓形杆菌属、苍白杆菌属。菌株筛选结果与高通量测序结果所显示的群落结构信息一致，为强化废水生物处理效能提供了微生物资源。此外，还对这些菌株的代谢特征进行了鉴定。
【专利说明】一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境微生物学领域，涉及反硝化脱硫细菌的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着我国化工、制药、食品加工、石油精炼等行业的迅速发展，高浓度、难 降解有机废水排放量逐年增多。其中，相当一部分是含硫含氮有机废水。此类废水中含硫 含氮化合物浓度高、毒性大、污染重、严重威胁环境和人体健康，成为导致我国水体灾难性 生态破坏的主要污染源之一。目前，此类废水处理普遍存在着"适用性处理技术缺乏、工艺 系统复杂、工程投资巨大、运行成本高昂、达标排放困难"等问题，尤其是硫系物难以有效去 除导致的环境污染隐患更为突出。因此，治理含硫含氮有机废水，遏制其对水体环境的恶劣 影响对生态安全和社会经济可持续发展意义重大。
[0003] 生物法普遍用于治理含硫含氮有机废水。将硫系污染物转化为生物硫的过程可 以强化氮、硫去除，并彻底消除含硫化合物的环境隐患。在上个世纪70年代，Bisogni等 人利用富集培养的脱氮硫杆菌进行了小试的自养反硝化实验，以硫代硫酸盐和硫化物作为 电子供体，实验结果显示：在厌氧条件下，脱氮硫杆菌能够以硝酸盐作为电子受体并获得能 量。此后，国内外报道了大量的关于自养脱硫反硝化细菌的研究工作。2004年，王爱杰、 杜大仲等人分离筛选出了一株自养的脱氮硫杆菌（Thiobacillus denitrificans)，并利用 它研究DSR工艺的可行性及影响因素。2006年，王爱杰等人从土壤中分离筛选出一株自 养脱硫反硝化的细菌，属于红球菌属（Rhodococcus sp. )。2007年，陈川从已在EGSB反应 器中驯化了半年的颗粒污泥里分离筛选出一株高效反硝化脱硫异养菌株，属于假单胞菌属 (Pseudomonas sp.)，打破了只有自养反硝化菌才能在反硝化脱硫过程中累积单质硫的传 统理念。同时，陈川等人提出了自养-异养微生物联合反硝化脱硫的技术思路，大幅提高了 污水处理负荷及对污染物的转化率。传统理论认为自养-异养微生物联合反硝化脱硫系统 中自养菌进行脱硫反硝化，但效率低下；异养菌只能起到去除有机物的作用。然而近年来我 们在对反硝化脱硫研究中发现一类新的功能微生物：即一类能够高效同步代谢有机物并进 行脱硫反硝化的微生物。过去已有研究证实了在废水反硝化脱硫处理过程中有兼性自养菌 /异养菌群的存在，能够在反硝化脱硫的同时还能将部分有机物去除。但是至今未有在以硫 化物和有机物同时作为电子供体，以硝酸盐作为电子受体的培养基中筛选得到这类菌株的 报道。因此该功能微生物的获得将提出新的反硝化脱硫机制，对废水处理工艺中硫、氮、碳 的同步脱除研究提供了新思路，同时也为生物脱硫脱氮处理工艺的开发与工程应用提供了 微生物学依据。然而，由于传统的微生物筛选方法的盲目性以及筛选条件缺乏特异的针对 性，难以在稳定运行的反硝化脱硫系统中筛选到菌群丰度及空间生态分布不同的功能微生 物。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种反硝化脱硫菌的筛选方法，即基于高通量测序技术提供 的生物多样性信息制定针对不同菌属的特异性的筛选方法。
[0005] 本发明的一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的方法，它是按照以下步 骤进行的：
[0006] -、从稳定运行的进行生物脱硫脱氮的膨胀颗粒污泥床反应器采集污泥样品；
[0007] 二、采用的高通量测序技术对污泥样品进行群落空间结构与丰度分析，获得生物 学多样性信息；其中，所述的生物学多样性信息是指：菌群丰度波动和空间生态分布信息； 同时将步骤一中采集的污泥按体积比为1:5的比例加入无菌水，同时放入玻璃珠，在转速 为220转/分钟的条件下振荡培养24小时，得各菌属的悬液；
[0008] 三、对步骤二各菌属的菌液稀释后，涂布于与各菌属对应的固体培养基上，然后在 其上浇盖与该菌属对应的固体培养基，制成各菌属的厌氧夹层培养基，在恒温培养箱温度 为30°C的条件下进行厌氧培养至培养基夹层中产生气泡；
[0009] 四、剥离步骤三中各菌属的厌氧夹层培养基的覆盖部分，挑取气泡内的各菌属的 单菌落，转入各菌属对应的液态分离培养基中，进行扩大培养，在恒温培养箱30°C，培养周 期为14天；
[0010] 五、取步骤四培养后各菌属的菌液，在各菌属对应的固体培养基上进行平板划线 培养；然后置于恒温培养箱中，在30°c条件下进行培养至出现单菌落，挑取各菌属的单菌 落转入各菌属对应的液态培养基中培养；
[0011] 六、重复步骤三至步骤五的操作3次，分离出各菌属的单一菌落后，即完成从有机 废水生物脱硫脱氮系统中分离反硝化脱硫功能微生物的筛选；其中，步骤二中悬液中包含 以下菌属：索氏菌属（Thauera sp.)、固氮弧菌属（Azoarcus sp.)、弓形杆菌属（Arcobacter sp.)、苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.)、硫杆菌属（Thiobacillus sp.)、硫螺旋菌属 (Sulfurimonas sp.)、产喊杆菌属（Alkaliflexus sp.)、脱硫弧菌属（Desulfofutls sp.) 和地杆菌属（Geoalkalibacter sp.)。
[0012] 本发明包含以下有益效果：
[0013] 本发明分离纯化出两类脱硫反硝化功能微生物，一类为自养反硝化脱硫微生物， 能够利用无机碳源，以硫代硫酸盐作为电子供体，硝酸盐作为电子受体，将硝酸盐或亚硝酸 盐还原为氮气同时产生单质硫；另一类为异养反硝化脱硫微生物，即在以有机碳作为电子 供体将亚硝酸盐或者硝酸盐转化为氮气的同时还能将硫化物氧化为硫单质。因此具备了高 效同步代谢有机碳，硝酸盐和硫化物的特征，是一种超常规的生物脱硫现象。因此异养反硝 化脱硫微生物功能微生物的获得将提出新的碳氮硫共脱除机制，对废水处理工艺中硫、氮、 碳的同步脱除研究提供了新思路，同时也为生物脱硫脱氮处理工艺的开发与工程应用提供 了微生物学依据，为强化废水生物处理效能提供了微生物资源。
[0014] 由于采用了夹层培养基的分离方法，可以肉眼判断单菌落的产气情况，从而为有 效快速得到异养反硝化脱硫菌的纯培养提供了有力的保障。本发明依据从污泥样品中筛选 出的菌群丰度波动和空间生态分布信息根据这些生物学多样性信息，确立所要分离筛选的 目标菌属，针对不同的目标菌属制定不同的筛选方案，本发明提出的基于菌群丰度波动和 空间生态分布制定筛菌方案，避免了传统筛菌的盲目、低效等弊端，提高了筛选效率与成功 率。对自然微生物群落或人工体系内难培养功能微生物的筛选具有重要的实际意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1为进行生物脱硫脱氮的膨胀颗粒污泥床反应器中微生物菌群空间分布与 丰度图；其中，A为苍白杆菌HS4 (Ochrobactrum)菌群空间分布与丰度图，B为弓形杆 菌HS3(Arcobacter)菌群空间分布与丰度图，C为索氏菌HSl(Thauera)，D为硫杆菌属 ASl(Thiobacillus)菌群空间分布与丰度图，E为固氮弧菌HS2 (Azoarcus)菌群空间分布与 丰度图；
[0016] 图2为索氏菌属HS1 (Thauera sp.)的电镜图；
[0017] 图3为固氮弧菌属HS2 (Azoarcus sp.)的电镜图；
[0018] 图4为弓形杆菌HS3 (Arcobacter sp.)的电镜图；
[0019] 图5为苍白杆菌属HS4 (Ochrobactrum sp.)的电镜图；
[0020] 图6为硫杆菌属AS1 (Thiobacillus sp.)的电镜图；
[0021] 图7为实施例一的加六氢吡啶前单质硫的定性鉴定图；
[0022] 图8为实施例一的加六氢吡啶后单质硫的定性鉴定图。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0023] 一：本实施方式的一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的 方法，它是按照以下步骤进行的：
[0024] -、从稳定运行的进行生物脱硫脱氮的膨胀颗粒污泥床反应器采集污泥样品；
[0025] 二、采用的高通量测序技术对污泥样品进行群落空间结构与丰度分析，获得生物 学多样性信息；其中，所述的生物学多样性信息是指：菌群丰度波动和空间生态分布信息； 同时将步骤一中采集的污泥按体积比为1:5的比例加入无菌水，同时放入玻璃珠，在转速 为220转/分钟的条件下振荡培养24小时，得各菌属的悬液；
[0026] 三、对步骤二各菌属的菌液稀释后，涂布于与各菌属对应的固体培养基上，然后在 其上浇盖与该菌属对应的固体培养基，制成各菌属的厌氧夹层培养基，在恒温培养箱温度 为30°C的条件下进行厌氧培养至培养基夹层中产生气泡；
[0027] 四、剥离步骤三中各菌属的厌氧夹层培养基的覆盖部分，挑取气泡内的各菌属的 单菌落，转入各菌属对应的液态分离培养基中，进行扩大培养，在恒温培养箱30°C，培养周 期为14天；
[0028] 五、取步骤四培养后各菌属的菌液，在各菌属对应的固体培养基上进行平板划线 培养；然后置于恒温培养箱中，在30°C条件下进行培养至出现单菌落，挑取各菌属的单菌 落转入各菌属对应的液态培养基中培养；
[0029] 六、重复步骤三至步骤五的操作3次，分离出各菌属的单一菌落后，即完成从有机 废水生物脱硫脱氮系统中分离反硝化脱硫功能微生物的筛选；其中，步骤二中悬液中包含 以下菌属：索氏菌属（Thauera sp.)、固氮弧菌属（Azoarcus sp.)、弓形杆菌属（Arcobacter sp.)、苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.)、硫杆菌属（Thiobacillus sp.)、硫螺旋菌属 (Sulfurimonas sp.)、产喊杆菌属（Alkaliflexus sp.)、脱硫弧菌属（Desulfofutls sp.) 和地杆菌属（Geoalkalibacter sp.)。
[0030] 本申请步骤二中根据获得的生物学多样性信息，确立所要分离的目标菌属，针对 不同的目标菌属制定不同的筛选方案。
【具体实施方式】 [0031] 二：本实施方式与一不同的是：步骤一中从稳定运行 的进行生物脱硫脱氮的膨胀颗粒污泥床反应器采集污泥样品，是指从对有机废水中碳、氮、 硫污染物去除率均达到99%的稳定运行的进行生物脱硫脱氮的膨胀颗粒污泥床反应器采 集污泥样品。其它与一相同。
【具体实施方式】 [0032] 三：本实施方式与一不同的是：步骤一中采集污泥是 从不同高度的稳定运行的进行生物脱硫脱氮的膨胀颗粒污泥床反应器采集得到的。其它与 一相同。
【具体实施方式】 [0033] 四：本实施方式与一不同的是：步骤二中获得的生物 学多样性信息是指获得了有机废水生物脱硫脱氮系统的生物学多样性信息。其它与具体实 施方式一相同。
【具体实施方式】 [0034] 五：本实施方式与一不同的是：所述的各菌属对应的 固体培养基、液态分离培养基和液态培养基组分如下：
[0035] 索氏菌属（Thauera sp.)的固体培养基、液态分离培养基和液态培养基的组分均 包含：浓度为1. 5g/L的Na2S ? 9H20溶液、浓度为1. Og/L的acetate溶液、浓度为0. lg/L 的MgS04 ? 7H20溶液、浓度为0. 5g/L的NaHC03溶液、浓度为1. Og/L的NH4C1溶液、浓度为 0. 75g/L的KN03溶液、浓度为1. 8g/L的KH2P04溶液和浓度为1. 2g/L的K2HP04溶液；其中， 索氏菌属（Thauera sp.)的各培养基的pH均为8. 0 ;
[0036] 固氮弧菌属（Azoarcus sp.)的固体培养基、液态分离培养基和液态培养基的组分 均包含：浓度为1. 5g/L的Na2S *9H20溶液、浓度为0. 68g/L的acetate溶液、浓度为0. 63g/ L的KN03溶液、浓度为50mg/L的K2HP04溶液和浓度为50mg/L的NH 4C1溶液；其中，固氮弧 菌属（Azoarcus sp.)的各培养基的pH均为8. 0 ;
[0037] 弓形杆菌属（Arcobacter sp.)的固体培养基、液态分离培养基和液态培养基的组 分均包含：浓度为1. 5g/L的Na2S *9H2溶液、浓度为1. 0g/L的acetate溶液、浓度为0. lg/ L的MgS04 ? 7H20溶液、浓度为0. 5g/L的NaHC03溶液、浓度为1. 0g/L的NH4C1溶液、浓度为 0. 75g/L的KN03溶液、浓度为1. 8g/L的KH2P04溶液和浓度为1. 2g/L的K2HP04溶液；其中， 弓形杆菌属（Arcobacter sp.)的各培养基的pH均为8. 0 ;
[0038] 苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.)的固体培养基、液态分离培养基和液态培养基 的组分均包含：浓度为1. 5g/L的Na2S ? 9H20溶液、浓度为10mg/L的C3H5Na03溶液、浓度 为0. lg/L的MgS04 ? 7H20溶液、浓度为1. 0g/L的NH4C1溶液、浓度为1. 0g/L的KN03溶 液、浓度为1. 8g/L的KH2P04溶液和浓度为1. 2g/L的K2HP04 ? 3H20溶液；其中，苍白杆菌属 (Ochrobactrum sp.)的各培养基的pH均为8. 0 ;
[0039] 硫杆菌属（Thiobacillus sp.)的固体培养基、液态分离培养基和液态培养基的 组分均包含：浓度为5. 0g/L的Na2S203 ? 5H20溶液、浓度为2g/L的K2HP04溶液、浓度为2g/ L的KN0 3溶液、浓度为0. 6g/L的MgS04 ? 7H20溶液、浓度为0. 5g/L的NH4C1溶液和浓度为 0? 01g/L的FeS04 ? 7H20溶液；其中，硫杆菌属（Thiobacillus sp.)的各培养基的pH均为 7. 6。其它与【具体实施方式】一相同。
[0040]
【具体实施方式】六：本实施方式与【具体实施方式】一不同的是：步骤三中对步骤二各 菌属的菌液稀释后，涂布于与各菌属对应的固体培养基上是指：取lmL对步骤三分析后的 各菌液稀释至1(T 4后，吸取〇. lmL涂布于各菌属的固体培养基上。其它与【具体实施方式】一 相同。
[0041] 下面通过实施例对本发明进行进一步详细的说明。
[0042] 实施例一
[0043] 本实施例按照如下程序进行筛选异养反硝化脱硫菌株：
[0044] 1 ?采样
[0045] 本次筛菌所用的污泥样品全部来自进行生物脱硫脱氮的膨胀颗粒污泥床反应器， 在采样时，用50mL离心管收集反应器上、中、下等不同高度的污泥，并将其混合均匀。
[0046] 2.根据目标功能菌的特性确定特异性筛选条件
[0047] 本发明为反硝化脱硫菌属的筛选方法，根据反硝化脱硫反应器污染样品的高 通量测序结果得知，反应器的微生物群落的分布主要分为两类：自养微生物和异养微生 物。其中丰度较高的菌属分别为：固氮弧菌（Azoarcus)、索氏菌（Thauera)、弓形杆菌 (Arcobacter)、硫杆菌（Thiobacillus)以及苍白杆菌（Ochrobactrum)等（如图 1 所不）。 因此针对以上特征菌属，本发明设计了二类筛选方法：
[0048] (1)自养反硝化脱硫功能微生物：
[0049] 硫杆菌属（Thiobacillus sp.)的固体培养基、液态分离培养基和液态培养基的 组分均包含：浓度为5. 0g/L的Na2S203 ? 5H20溶液、浓度为2g/L的K2HP04溶液、浓度为2g/ L的KN0 3溶液、浓度为0. 6g/L的MgS04 ? 7H20溶液、浓度为0. 5g/L的NH4C1溶液和浓度为 0. 01g/L的FeS04 ? 7H20溶液；其中，培养温度30°C，硫杆菌属（Thiobacillus sp.)的各培 养基的pH均为7.6。
[0050] (2)异养反硝化脱硫功能微生物：
[0051] 基于群落结构信息，进行生物脱硫脱氮的膨胀颗粒污泥床反应器中异养微生物较 多，因而针对不同的菌属设计了不同的筛选方法：
[0052] ①对于索氏菌属（Thauera sp.)的液体培养基组成为：浓度为1. 5g/L的 Na2S ? 9H20溶液、浓度为1. 0g/L的acetate溶液、浓度为0. lg/L的MgS04 ? 7H20溶液、浓度 为0. 5g/L的NaHC03溶液、浓度为1. 0g/L的NH4C1溶液、浓度为0. 75g/L的KN03溶液、浓度 为1. 8g/L的KH2P04溶液和浓度为1. 2g/L的K2HP04溶液；培养温度30°C，pH = 8. 0。
[0053] ②针对于固氮弧菌属（Azoarcus sp.)的液体培养基组成为：浓度为1. 5g/L的 Na2S ? 9H20溶液、浓度为0. 68g/L的acetate溶液、浓度为0. 143g/L的KN03溶液、浓度为 50mg/L的K2HP04溶液和浓度为50mg/L的NH 4C1溶液；培养温度30°C，pH = 7. 5。
[0054] ③针对于弓形杆菌属（Arcobacter sp.)的液体培养基组成为：浓度为1. 5g/L的 Na2S ? 9H2溶液、浓度为1. 0g/L的acetate溶液、浓度为0. lg/L的MgS04 ? 7H20溶液、浓度 为0. 5g/L的NaHC03溶液、浓度为1. 0g/L的NH4C1溶液、浓度为0. 75g/L的KN03溶液、浓度 为1. 8g/L的KH2P04溶液和浓度为1. 2g/L的K2HP04溶液；培养温度30°C，pH = 8. 0。
[0055] ④针对苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.)的液体培养基组成为：浓度为1. 5g/L的 Na2S ? 9H20溶液、浓度为10mg/L的C3H5Na03溶液、浓度为0? lg/L的MgS04 ? 7H20溶液、浓度 为1. 0g/L的NH4C1溶液、浓度为1. 0g/L的KN03溶液、浓度为1. 8g/L的KH2P04溶液和浓度 为 1. 2g/L 的 K2HP04 ? 3H20 溶液；培养温度 30°C，pH = 7. 5。
[0056] 3?细菌分离筛选过程
[0057] (1)从稳定运行的进行生物脱硫脱氮的膨胀颗粒污泥床反应器的不同高度采集污 泥。将各高度采集的污泥样品50mL放入500mL灭菌的锥形瓶中，加入无菌水稀释至250mL， 放入玻璃珠20至25个，在摇床中以220转/分钟振荡24小时。将菌胶团或土壤颗粒震碎， 制成菌悬液。
[0058] (2)均匀混合后，吸取lmL的污泥样品用无菌水稀释至1(T4倍，吸取稀释后菌悬液 0. lmL，在固体分离培养基（培养基组分详见第2部分）上进行涂布后，浇盖固体分离培养 基（培养基组分详见第2部分）制成厌氧夹层培养基，保持菌种的厌氧状态，在恒温培养箱 30°C培养14天，在培养基夹层中出现气泡。
[0059] (3)剥离厌氧夹层培养基的覆盖部分，挑取气泡内的单菌落，转入液态分离培养 基，进行扩大培养，在恒温培养箱30°C，培养周期为14天左右，培养基出现混浊为宜。
[0060] (4)用取菌针粘取液态培养基的菌种，在固态培养基上进行平板划线培养。在恒 温培养箱30°C下进行培养，然后挑取单菌落转入液态培养基中。
[0061] (5)重复分离步骤（3)、（4)、（5)五个周期，至分离出单一菌落。
[0062] 由自养反硝化脱硫功能微生物筛选方法中分离得到1株自养反硝化功能菌，命名 为AS1。由异养反硝化功能微生物筛选方法共筛选得到4株异养反硝化功能菌，分别命名为 HS1-HS4(菌株形态见图2至6所示）。
[0063] 4. 16S rRNA 鉴定：
[0064] 首先，采用天根生化科技（北京）有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取细 菌DNA，具体操作步骤详见产品说明书。之后，将所提的DNA进行聚合酶链式反应（PCR)。
[0065] 16S rRNA扩增引物如下：
【权利要求】
1. 一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的方法，其特征在于它是按照以下步 骤进行的： 一、 从稳定运行的进行生物脱硫脱氮的膨胀颗粒污泥床反应器采集污泥样品； 二、 采用的高通量测序技术对污泥样品进行群落空间结构与丰度分析，获得生物学多 样性信息；其中，所述的生物学多样性信息是指：菌群丰度波动和空间生态分布信息；同时 将步骤一中采集的污泥按体积比为1:5的比例加入无菌水，同时放入玻璃珠，在转速为220 转/分钟的条件下振荡培养24小时，得各菌属的悬液； 三、 对步骤二各菌属的菌液稀释后，涂布于与各菌属对应的固体培养基上，然后在其 上烧盖与该菌属对应的固体培养基，制成各菌属的厌氧夹层培养基，在恒温培养箱温度为 30°C的条件下进行厌氧培养至培养基夹层中产生气泡； 四、 剥离步骤三中各菌属的厌氧夹层培养基的覆盖部分，挑取气泡内的各菌属的单菌 落，转入各菌属对应的液态分离培养基中，进行扩大培养，在恒温培养箱30°C，培养周期为 14天； 五、 取步骤四培养后各菌属的菌液，在各菌属对应的固体培养基上进行平板划线培养； 然后置于恒温培养箱中，在30°C条件下进行培养至出现单菌落，挑取各菌属的单菌落转入 各菌属对应的液态培养基中培养； 六、 重复步骤三至步骤五的操作3次，分离出各菌属的单一菌落后，即完成从有机废 水生物脱硫脱氮系统中分离反硝化脱硫功能微生物的筛选；其中，步骤二中悬液中包含以 下菌属：索氏菌属（Thauera sp.)、固氮弧菌属（Azoarcus sp.)、弓形杆菌属（Arcobacter sp.)、苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.)、硫杆菌属（Thiobacillus sp.)、硫螺旋菌属 (Sulfurimonas sp.)、产喊杆菌属（Alkaliflexus sp.)、脱硫弧菌属（Desulfofutls sp.) 和地杆菌属（Geoalkalibacter sp.)。
2. 根据权利要求1所述的一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的方法，其特 征在于步骤一中从稳定运行的进行生物脱硫脱氮的膨胀颗粒污泥床反应器采集污泥样品， 是指从对有机废水中碳、氮、硫污染物去除率均达到99%的稳定运行的进行生物脱硫脱氮 的膨胀颗粒污泥床反应器采集污泥样品。
3. 根据权利要求1所述的一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的方法，其特 征在于步骤一中采集污泥是从不同高度的稳定运行的进行生物脱硫脱氮的膨胀颗粒污泥 床反应器采集得到的。
4. 根据权利要求1所述的一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的方法，其特 征在于步骤二中获得的生物学多样性信息是指获得了有机废水生物脱硫脱氮系统的生物 学多样性信息。
5. 根据权利要求1所述的一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的方法，其特 征在于所述的各菌属对应的固体培养基、液态分离培养基和液态培养基组分如下： 索氏菌属（Thauera sp.)的固体培养基、液态分离培养基和液态培养基的组分均包 含：浓度为1. 5g/L的Na2S ? 9H20溶液、浓度为1. Og/L的acetate溶液、浓度为0. lg/L的 MgS04 *7H20溶液、浓度为0. 5g/L的NaHC03溶液、浓度为1. Og/L的NH4C1溶液、浓度为0. 75g/ L的KN03溶液、浓度为1. 8g/L的KH2P04溶液和浓度为1. 2g/L的K2HP04溶液；其中，索氏菌 属（Thauera sp.)的各培养基的pH均为8. 0 ; 固氮弧菌属（Azoarcus sp.)的固体培养基、液态分离培养基和液态培养基的组分均包 含：浓度为1. 5g/L的Na2S *9H20溶液、浓度为0. 68g/L的acetate溶液、浓度为0. 63g/L的 KN03溶液、浓度为50mg/L的K2HP04溶液和浓度为50mg/L的NH 4C1溶液；其中，固氮弧菌属 (Azoarcus sp.)的各培养基的pH均为8. 0 ; 弓形杆菌属（Arcobacter sp.)的固体培养基、液态分离培养基和液态培养基的组分 均包含：浓度为1. 5g/L的Na2S ? 9H2溶液、浓度为1. Og/L的acetate溶液、浓度为0. lg/L 的MgS04 ? 7H20溶液、浓度为0. 5g/L的NaHC03溶液、浓度为1. Og/L的NH4C1溶液、浓度为 0. 75g/L的KN03溶液、浓度为1. 8g/L的KH2P04溶液和浓度为1. 2g/L的K2HP04溶液；其中， 弓形杆菌属（Arcobacter sp.)的各培养基的pH均为8. 0 ; 苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.)的固体培养基、液态分离培养基和液态培养基的组分 均包含：浓度为1. 5g/L的Na2S ? 9H20溶液、浓度为10mg/L的C3H5Na03溶液、浓度为0. lg/L 的MgS04 *7H20溶液、浓度为1. 0g/L的NH4C1溶液、浓度为1. 0g/L的KN03溶液、浓度为1. 8g/ L的KH2P04溶液和浓度为1. 2g/L的K2HP04 ? 3H20溶液；其中，苍白杆菌属（Ochrobactrum sp.)的各培养基的pH均为8. 0 ; 硫杆菌属（Thiobacillus sp.)的固体培养基、液态分离培养基和液态培养基的组分均 包含：浓度为5. 0g/L的Na2S203 *5H20溶液、浓度为2g/L的K2HP04溶液、浓度为2g/L的KN0 3溶液、浓度为〇. 6g/L的MgS04 *7H20溶液、浓度为0. 5g/L的NH4C1溶液和浓度为0. 01g/L的 FeS04 ? 7H20溶液；其中，硫杆菌属（Thiobacillus sp.)的各培养基的pH均为7. 6。
6.根据权利要求1所述的一种基于生物多样性信息分离反硝化脱硫细菌的方法，其 特征在于步骤三中对步骤二各菌属的菌液稀释后，涂布于与各菌属对应的固体培养基上是 指：取lmL对步骤三分析后的各菌液稀释至KT4,吸取0. lmL涂布于各菌属的固体培养基 上。
【文档编号】C12Q1/68GK104450592SQ201410850374
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】王爱杰, 马晓丹, 高灵芳, 远野, 黄聪, 谭文博, 赵友康, 陈川 申请人:哈尔滨工业大学