大菱鲆s11单核苷酸多态性标记的检测方法
【专利摘要】一种大菱鲆S11单核苷酸多态性标记的检测方法，属于分子遗传标记研究技术，首先提取大菱鲆基因组DNA并稀释备用；再根据高通量转录组测序获得SNP位点，采用人工筛查的方法筛选出候选SNP位点的序列，利用小片段法在其两端设计特异引物，长度在20bp左右，目的片段在40-80bp；同时设计高低温内标；然后进行PCR反应，变性时添加高低温内标；将产物置于LightScanner上检测熔解曲线并分析，获得大菱鲆的遗传多态性图谱。本发明适用于大菱鲆群体遗传标记、系谱认证、遗传连锁图谱构建等检测技术；可快捷的获得大菱鲆的S11SNP标记的遗传变异图谱，方便、快捷、准确，可直观地检测出大菱鲆每个个体的基因型。
【专利说明】大菱鲆S11单核苷酸多态性标记的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子遗传标记研究技术，具体涉及一种检测大菱鲆Sll单核苷酸多态 性标记（single nucleotide polymorphism, SNP)的方法。
【背景技术】
[0002] 单核苷酸多态性（SNP)分子标记是基因组中最丰富的突变类型，因它数量多，覆 盖密度大，位点丰富，几乎分布于整个基因组，具有片段短易于扩增、遗传稳定性强等特点； 易于高通量、自动化分析，易于遗传机制的研究等优势，所以它是遗传育种研究中的热门领 域。
[0003] 本发明做出之前，SNP位点信息的获得主要是通过基因组测序，伴随序列拼接比 对而产生，但是这种方法成本较高。而对于大菱鲆没有基因组信息，多利用已知的EST序 列自行筛选，如西班牙 Manuel Vera 等（Aquaculture2011)发表的 Validation of single nucleotide polymorphism(SNP)markers froman immune Expressed Sequence Tag(EST) turbot, Scophthalmus maximus, database，曾报道基于EST序列开发大菱鲆SNP标记的方 法，他运用基于四种可能核苷酸两步反应法对候选SNP荧光检测进行基因分型验证，共筛 选出77个大菱鲆SNP标记；但是EST序列与实际序列有一定差异，所以这种方法前期准备 工作比较艰巨，开发效率比较低，覆盖率不够广，目的性不够强。高分辨率熔解曲线分析技 术（High Resolution Melting, HRM)，是近年来兴起的一种SNP检测的新工具，可以迅速的 检测出DNA片段中碱基的突变，但在本发明之前，大菱鲆均采用非标记探针基因分型技术， 刘庆明等发表的"应用高分辨率溶解曲线（HRM)开发大菱鲆（Scophthalmus maximus) SNP 标记的研究"，但是探针设计常有误差，而且不对称PCR的操作复杂，成本较高，效率较低。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种大菱鲆Sll单核苷酸多态性标记的检测 方法，该方法费用低、特异性准确性高、重复性好、操作简便，可快速高通量地检测大菱鲆 SllSNP 标记。
[0005] 本发明是按如下技术方案实现的：
[0006] 一种大菱鲆Sll单核苷酸多态性标记的检测方法，包括：1)、基因组DNA提取；2)、 候选SNP筛选；3)、小片段引物设计；4)、PCR扩增；5)、数据采集和6)、基因分型；
[0007] 所述的候选SNP筛选；通过高通量转录组测序获得SNP位点，采用人工筛查：①因 为客观上测序错误的存在，因而只在含有不少于20个reads的contig中寻找SNP。②从突 变频率大于20 %的SNP位点中挑选，但当reads数大于500时，选择突变频率大于10 %的 3即位点。筛查出候选5115即位点，其位点所在的〇〇1^11^为(：〇111?32333_(31_8691，部分基 因序列为：AAAAGTTGTTTTAATACTGATACAAGGAGGACAGAAGAGTCACAACACAACCATGTGTTCTCCTGAGA ccmtggttacgaatagacgaggccccattcagtggtttcaggcactgacaaaaagmtgaaaaaagaaaacagAag CTCAGAAACCATACTCCTCCGTTAGGTCGGAAAAGGTAAA GTCATAGTCATCAACGTCGTCATCGTCATCACCACT GAGAAGGGTCATGGCTATGAAAAAATTAAGTAGATCTAAGCCATCGTAGTCGTCTTCATCTTCTGTAGGATATGTAA ATGATCTGCGACGTGTAGAITTATCATGTCGATAAAGGCACTCCGITITGAAGGGGCAGCAT，其中加粗、加下 划线的碱基即为SllSNP位点；
[0008] 所述的小片段引物设计：利用软件primerf.O进行引物设计，小片段法引物设计 要求：①引物长度20bp左右；②目的片段控制在40bp-80bp ;③引物内部不能包含SNP位 点；@6(：含量40%-60%，1'111值在401：-601：，两条引物之间1'111值相差不超过21：;?引物 3'末端不能够有连续超过4个碱基的错配或者自身配对；⑥目的产物只含有一个待测SNP 位点。通过软件01ig〇7.0检查引物质量，不能有严重错配、引物二聚体和发夹结构等。高 低温内标为两段长度50bp的DNA片段，提供独立于PCR产物的大约68°C和88°C的熔解曲 线，有效的去除混杂变量，减少Tm值对反应体积的依赖，增加基因分型的敏感性，内标序列 分别为
[0009] F：5-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3,
[0010] -CTGAGCGTCACGCAGTGCCGCAGCTGGCTACCGCTAGGCCGACTGACCGC-3'；
[0011] 和 F:5' -ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3'
[0012] R:5, -AAAATGAAATTATTAATGCCAACTACTTAGATAACTATAGAAATCACGAT-3，。
[0013] 一种大菱鲆Sll单核苷酸多态性标记的检测方法，包括：1)、基因组DNA提取；2)、 候选SNP筛选；3)、小片段引物设计；4)、PCR扩增；5)、数据采集和6)、基因分型，具体步骤 如下：
[0014] 1)基因组DNA提取：提取大菱鲜基因组DNA，将其稀释为20ng/ul ;
[0015] 2)候选SNP筛选；通过高通量转录组测序获得SNP位点，采用人工筛查：①因为客 观上测序错误的存在，因而只在含有不少于20个reads的contig中寻找SNP ;②从突变频 率大于20%的SNP位点中挑选，但当reads数大于500时，选择突变频率大于10%的SNP 位点；
[0016] 筛查出候选5115即位点，其位点所在的(：〇1^11^为(3〇1即32333_(31_8691，部分基因 序列为：AAAAGTTGTTTTAATACTGATACAAGGAGGACAGAAGAGTCACAACACAACCATGTGTTCTCCTGAGACC AATGGTTACGAATAGACGAGGCCCCATTCAGTGGTTTCAGGCACTGACAAAAAGAATGAAAAAAGAAAACAG AAGC TCAGAAACCATACTCCTCCGTTAGGTCGGAAAAGGTAAA GTCATAGTCATCAACGTCGTCATCGTCATCACCACTG AGAAGGGTCATGGCTATGAAAAAATTAAGTAGATCTAAGCCATCGTAGTCGTCTTCATCTTCTGTAGGATATGTAAA TGATCTGCGACGTGTAGAITTATCATGTCGATAAAGGCACTCCGITITGAAGGGGCAGCAT，其中加粗、加下划 线的碱基即为SllSNP位点；
[0017] 3)小片段引物设计：利用软件primerf. 0进行引物设计，小片段法引物设计要求： ①引物长度20bp左右；②目的片段控制在40bp-80bp ;③引物内部不能包含SNP位点；④GC 含量40% -60%，Tm值在40°C -60°C，两条引物之间Tm值相差不超过2°C ;⑤引物3'末端 不能够有连续超过4个碱基的错配或者自身配对；⑥目的产物只含有一个待测SNP位点。通 过软件01ig〇7. 0检查引物质量，不能有严重错配、引物二聚体和发夹结构等。高低温内标 为两段长度50bp的DNA片段，提供独立于PCR产物的大约68°C和88°C的熔解曲线，有效的 去除混杂变量，减少Tm值对反应体积的依赖，增加基因分型的敏感性；内标序列分别为F : 5-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3，R : 5, -CTGAGCGTCACGCAGT GCCGCAGCTGGCTACCGCTAGGCCGACTGACCGC-3，；和 F : 5' -ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTT GGCATTAATAATTTCATTTT-3,，R : 5, -AAAATGAAATTATTAATGCCAACTACTTAGATAACTATAGAAATCA CGAT-3，。
[0018] 4)PCR 扩增：PCR 反应 IOii I 体系，包括 4. 5 ii I 2XES Taq Master Mix，其中包 括热启动酶，Mg2+，buffer及其它组分；0.5 ill IOii M上游引物；0.5 ill IOii M下游引物； I. 0 ill 40ng/ UlDNA模板；3. 5 ill 7jC ;每个样品孔内力口 15矿物油，离心去除气泡并使矿物 油置于样品上层；PCR反应程序为：95°C预变性5min ;94°C变性30s，复性温度Tm值44°C， 退火30s，72°C延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸7min，4°C保存；反应结束后，进行变 性，变性的反应体系为：高温内标和低温内标的正负向引物各加0. 25 iil，LC Green染料加 入I. 0 ;变性反应程序：95°C 5min ;在PCR前每个样品孔内加15矿物油，离心去除气泡 并使矿物油置于样品上层；
[0019] 5)数据采集：将PCR产物置于Light Scanner分析仪上进行高分辨率熔解曲线采 集，采集曲线的温度范围为45°C至97°C，每摄氏度获得10个点，升温速度为0. 1°C /s ;
[0020] 6)基因分型：数据的检索和分析运用Light Scanner分析软件，确定每个个体的 基因型，并获得大菱鲆的遗传多态性图谱。
[0021] 本发明与现有技术相比的有益效果：
[0022] 本发明通过高通量测序的方法获得大量候选SNP位点，人工筛查位点，开发准确 度及效率较高，覆盖率广，目的性强;而且小片段溶解的基因分型方法，设计引物时，引物长 度在20bp左右，使目的片段尽可能的小，在40_80bp，有效避免了内含子的出现，以及提供 更好的纯合子检测，因此小片段基因分型发比目前使用较多的非标记探针基因分型技术更 加简单、高效。
[0023] 本发明应用高分辨率熔解曲线分析快速检测大菱鲆每个个体在SNP位点的遗传 变异情况，可快捷获得该引物对大菱鲆多态性图谱，所得结果可直观地检测出大菱鲆每个 个体的基因型，以期找到与该SNP位点连锁的性状，为以后与传统方法结合进行育种工作 奠定基础。
[0024] 本发明运用的是新一代高通量测序技术获得大量SNP位点，人工筛查位点，开发 准确度及效率较高，覆盖率广，目的性强，而且运用高分辨率熔解曲线技术以及小片段溶解 分型方法进行SNP基因分型，操作更加简单，而且避免了内含子的出现造成的假阳性现象， 同时也提供了纯合子检测，效率更高。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 下面通过实施例结合附图详细叙述本发明高通量转录组测序获得SNP，人工筛选 后，通过高分辨率溶解曲线技术进行小片段溶解分型方法，检测大菱鲆SllSNP遗传标记的 方法。
[0026] 图I :S11SNP引物对大菱鲆96个个体高分辨率熔解曲线图谱：
[0027] A :SIISNP引物对大菱鲆96个个体标准化的熔解曲线图；
[0028] B =SllSNP弓丨物对大菱鲆96个个体衍生的基因分型峰图；
【具体实施方式】
[0029] -种大菱鲆Sll单核苷酸多态性标记的检测方法，包括：1)基因组DNA提取；2)候 选SNP筛选；3)小片段引物设计；4) PCR扩增；5)数据采集；6)基因分型，
[0030] 具体步骤如下：
[0031] 1)基因组DNA提取：
[0032] 本实验样品来源于烟台天源水产有限公司8个家系10个不同性状群体的42个个 体，运用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型，TIANGEN)法提取DNA。a、取新鲜 样品的肌肉组织20mg，放入装有200 ii LGA缓冲液的离心管中，涡旋振荡15s。b、加入20 ii L 蛋白酶K(20mg/ml)溶液，涡旋混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。在56°C放置，直至组 织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。c、加入200 y L缓冲液GB，充分颠倒混匀， 70°C放置lOmin，溶液变得清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。d、加入200iiL无水乙 醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。e、将所得 溶液和絮状沉淀均加入吸附柱CB3中，（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，倒掉 废液，将吸附柱CB3放回收集管中。f、向吸附柱CB3中加入500 ii L缓冲液⑶，12000rpm离 心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。g、向吸附柱CB3中加入700 ii L漂洗液PW， 12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。h、向吸附柱CB3中加入500ul 漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液。i、将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心 2min，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。j、 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加60 y L洗脱缓冲液 TE，室温放置4min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，将其定量稀释成20ng/ul 备用。
[0033] 2)候选SNP筛选通过高通量转录组测序获得SNP位点，采用人工筛查：①因为客 观上测序错误的存在，因而只在含有不少于20个reads的contig中寻找SNP。②从突变频 率大于20%的SNP位点中挑选，但当reads数大于500时，选择突变频率大于10%的SNP 位点。筛查出候选SllSNP位点，其位点所在的conting为comp32333_cl_seql，部分基因序 列为：AAAAGTTGTTTTAATACTGATACAAGGAGGACAGAAGAGTCACAACACAACCATGTGTTCTCCTGAGACCAA TGGTTACGAATAGACGAGGCCCCATTCAGTGGTTTCAGGCACTGACAAAAAGAATGAAAAAAGAAAACAG AAGCTC AGAAACCATACTCCTCCGTTAGGTCGGAAAAGGTAAA GTCATAGTCATCAACGTCGTCATCGTCATCACCACTGAG AAGGGTCATGGCTATGAAAAAATTAAGTAGATCTAAGCCATCGTAGTCGTCTTCATCTTCTGTAGGATATGTAAATG ATCTGCGACGTGTAGAITTATCATGTCGATAAAGGCACTCCGITITGAAGGGGCAGCAT，其中加粗、加下划线 的碱基即为SllSNP位点；
[0034] 3)小片段引物设计：利用软件primerf. 0进行引物设计，小片段法引物设计要求： ①引物长度20bp左右；②目的片段控制在40bp-80bp ;③引物内部不能包含SNP位点；④GC 含量40% -60%，Tm值在40°C -60°C，两条引物之间Tm值相差不超过2°C ;⑤引物3'末端 不能够有连续超过4个碱基的错配或者自身配对；⑥目的产物只含有一个待测SNP位点。 通过软件01ig〇7. 0检查引物质量，不能有严重错配、引物二聚体和发夹结构等。高低温内 标为两段长度50bp的DNA片段，提供独立于PCR产物的大约68°C和88°C的熔解曲线，有效 的去除混杂变量，减少Tm值对反应体积的依赖，增加基因分型的敏感性。内标序列分别为 5-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3 和 5，-ATCGTGATTTCTATAG TTATCTAAGTAGITGGCATTAATAATITCAITIT-3，及各自的反向互补序列。
[0035] 4)PCR 扩增：PCR 反应 IOii 1 体系，包括 4. 5 ii I 2XES Taq Master Mix (包括热 启动酶，Mg2+，buffer及其它组分）；0.5iil上游引物（IOiiM) ;0.5iil下游引物（IOiiM); LOiil DNA模板（40ng/yl) ;3.5iil水。为防止样品在PCR扩增过程中挥发，在PCR前每 个样品孔内加15矿物油，离心去除气泡并使矿物油置于样品上层。PCR反应程序为：95°C 预变性5min ;94°C变性30s，复性温度Tm值44°C，退火30s，72°C延伸30s，共35个循环；最 后72 °C延伸7min，4°C保存。反应结束后，进行变性，变性的反应体系为：高温内标和低温内 标的正负向引物各加〇. 25iU，LC Green染料加入I. OiU。变性反应程序：95°C 5min。在 PCR前每个样品孔内加15矿物油，离心去除气泡并使矿物油置于样品上层。
[0036] 5)数据采集：将PCR产物置于Light Scanner分析仪上进行高分辨率熔解曲线采 集，采集曲线的温度范围为45°C至97°C，每摄氏度获得10个点，升温速度为0. 1°C /s ;
[0037] 6)基因分型：数据的检索和分析运用Light Scanner分析软件，确定每个个体的 基因型，并获得大菱鲆的遗传多态性图谱。
【权利要求】
1. 一种大菱鲆si 1单核苷酸多态性标记的检测方法，包括：1)、基因组DNA提取；2)、候 选SNP筛选；3)、小片段引物设计；4)、PCR扩增；5)、数据采集和6)、基因分型；其特征在于 所述的候选SNP筛选，通过高通量转录组测序获得SNP位点，采用人工筛查：①只在含有不 少于20个reads的contig中寻找SNP ;②从突变频率大于20%的SNP位点中挑选，但当 reads数大于500时，选择突变频率大于10%的SNP位点； 筛查出候选S11SNP位点，其位点所在的conting为comp32333_cl_seql，部分基因序列 为：AAAAGTTGTTTTAATACTGATACAAGGAGGACAGAAGAGTCACAACACAACCATGTGTTCTCCTGAGACCAAT GGTTACGAATAGACGAGGCCCCATTCAGTGGTTTCAGGCACTGACAAAAAGAATGAAAAAAGAAAACAGAAGCTCAG AAACCATACTCCTCCGTTAGGTCGGAAAAGGTAAA GTCATAGTCATCAACGTCGTCATCGTCATCACCACTGAGAA GGGTCATGGCTATGAAAAAATTAAGTAGATCTAAGCCATCGTAGTCGTCTTCATCTTCTGTAGGATATGTAAATGAT CTGCGACGTGTAGAITTATCATGTCGATAAAGGCACTCCGITITGAAGGGGCAGCAT，其中加粗、加下划线的 碱基即为S11SNP位点； 所述的小片段引物设计：利用软件primer5. 0进行引物设计，小片段法引物设计要求： ①引物长度20bp左右；②目的片段控制在40bp-80bp ;③引物内部不能包含SNP位点；④GC 含量40% -60%，Tm值在40°C -60°C，两条引物之间Tm值相差不超过2°C ;⑤引物3'末端 不能够有连续超过4个碱基的错配或者自身配对；⑥目的产物只含有一个待测SNP位点，通 过软件01ig〇7.0检查引物质量，不能有严重错配、引物二聚体和发夹结构等；高低温内标 为两段长度50bp的DNA片段，提供独立于PCR产物的大约68°C和88°C的熔解曲线，有效的 去除混杂变量，减少Tm值对反应体积的依赖，增加基因分型的敏感性，内标序列分别为 F：5-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3, -CTGAGCGTCACGCAGTGCCGCAGCTGGCTACCGCTAGGCCGACTGACCGC-3/ ； 和 F : 5' -ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTTGGCATTAATAATTTCATTTT-3' R:5, -AAAATGAAATTATTAATGCCAACTACTTAGATAACTATAGAAATCACGAT-3'。
2. 根据权利要求1所述的一种大菱鲆SI 1单核苷酸多态性标记的检测方法，包括：1)、 基因组DNA提取；2)、候选SNP筛选；3)、小片段引物设计；4)、PCR扩增；5)、数据采集和6)、 基因分型，其特征在于它的具体步骤如下： 1) 基因组DNA提取：提取大菱鲆基因组DNA，将其稀释为20ng/ul ; 2) 候选SNP筛选；通过高通量转录组测序获得SNP位点，采用人工筛查：①因为客观上 测序错误的存在，因而只在含有不少于20个reads的contig中寻找SNP ;②从突变频率大 于20 %的SNP位点中挑选，但当reads数大于500时，选择突变频率大于10 %的SNP位点； 筛查出候选S11SNP位点，其位点所在的conting为comp32333_cl_seql，部分基因序列为： AAAAGTTGTTTTAATACTGATACAAGGAGGACAGAAGAGTCACAACACAACCATGTGTTCTCCTGAGACCAATGGTT ACGAATAGACGAGGCCCCATTCAGTGGTTTCAGGCACTGACAAAAAGAATGAAAAAAGAAAACAGAAGCTCAGAAAC CATACTCCTCCGTTAGGTCGGAAAAGGTAAA GTCATAGTCATCAACGTCGTCATCGTCATCACCACTGAGAAGGGT CATGGCTATGAAAAAATTAAGTAGATCTAAGCCATCGTAGTCGTCTTCATCTTCTGTAGGATATGTAAATGATCTGC GACGTGTAGAITTATCATGTCGATAAAGGCACTCCGITITGAAGGGGCAGCAT，其中加粗、加下划线的碱基 即为S11SNP位点； 3) 小片段引物设计：利用软件primerf. 0进行引物设计，小片段法引物设计要求：①引 物长度20bp左右；②目的片段控制在40bp-80bp ;③引物内部不能包含SNP位点；④GC含 量40% -60%，Tm值在40°C -60°C，两条引物之间Tm值相差不超过2°C ;⑤引物3'末端不 能够有连续超过4个碱基的错配或者自身配对；⑥目的产物只含有一个待测SNP位点通过 软件01ig〇7.0检查引物质量，不能有严重错配、引物二聚体和发夹结构等；高低温内标为 两段长度50bp的DNA片段，提供独立于PCR产物的大约68°C和88°C的熔解曲线，有效的 去除混杂变量，减少Tm值对反应体积的依赖，增加基因分型的敏感性；内标序列分别为F : 5-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3，R : 5, -CTGAGCGTCACGCAGT GCCGCAGCTGGCTACCGCTAGGCCGACTGACCGC-3，；和 F : 5' -ATCGTGATTTCTATAGTTATCTAAGTAGTT GGCATTAATAATTTCATTTT-3,，R : 5, -AAAATGAAATTATTAATGCCAACTACTTAGATAACTATAGAAATCA CGAT-3，； 4. PCR扩增：PCR反应10ia体系，包括4?5ia2XESTaqMasterMix，其中包括热启 动酶，Mg2+，buffer及其它组分；0.5iU 10iiM上游引物；0.5iU 10iiM下游引物；l.Oiil 40ng/iil DNA模板；3. 5 ill水；每个样品孔内加15矿物油，离心去除气泡并使矿物油置 于样品上层；PCR反应程序为：95°C预变性5min ;94°C变性30s，复性温度Tm值44°C，退火 30s，72°C延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸7min，4°C保存；反应结束后，进行变性， 变性的反应体系为：高温内标和低温内标的正负向引物各加〇. 25 iil，LC Green染料加入
1. 〇以1 ;变性反应程序：95°C 5min ;在PCR前每个样品孔内力口 15矿物油，离心去除气泡并使 矿物油置于样品上层； 5) 数据采集：将PCR产物置于Light Scanner分析仪上进行高分辨率熔解曲线采集， 采集曲线的温度范围为45°C至97°C，每摄氏度获得10个点，升温速度为0. 1°C /s ; 6) 基因分型：数据的检索和分析运用Light Scanner分析软件，确定每个个体的基因 型，并获得大菱鲆的遗传多态性图谱。
【文档编号】C12Q1/68GK104450947SQ201410850337
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月29日 优先权日:2014年12月29日
【发明者】马爱军, 王婷, 黄智慧, 王新安, 马得友, 杨志, 曲江波 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所