二化螟饲料及其制备和使用方法与流程

本发明大体涉及昆虫饲养领域。更具体而言，本申请涉及二化螟的饲料、饲料制备方法以及使用其饲养二化螟的方法。

背景技术：

二化螟(chilosuppressalis(walker))，俗名钻心虫，蛀心虫，蛀秆虫等，对水稻生长危害很大。二化螟幼虫蛀食茎秆，造成枯心。二化螟具有转株危害习性，一头二化螟幼虫能危害多株水稻，造成枯叶鞘、枯心。

目前，二化螟综合防治措施的研究集中在新型生物农药及转基因抗虫水稻的研发方面，而生物农药的筛选、测定、抗性机制及转基因抗虫水稻的研发均需要大批量的、发育一致的二化螟虫源。

二化螟人工饲养主要采用天然饲料(例如，水稻苗、茭白)或半人工饲料进行饲养。20世纪70年代以来，研究人员开发了利用天然饲料或半人工饲料对二化螟的饲养方法。此外，本领域中对二化螟的人工饲料也有报道，例如韩兰芝等人在第200910080336.2号中国专利申请中公开了二化螟人工饲料。

本领域仍然需要开发新的二化螟人工饲料。

发明概述

第一方面，本申请提供了二化螟饲料，其包含胡萝卜制备物。

在一些实施方案中，二化螟饲料包含冰乙酸。

在一些实施方案中，二化螟饲料包含大豆粉、酵母粉、干酪素、蔗糖或以上的任意组合。

在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含以原料胡萝卜的重量计，7.5-22.5％的胡萝卜制备物。

在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含0.1-1％的 冰乙酸。

在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含4.5-5.5％的大豆粉。

在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含3-4％的酵母粉。

在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含1.5-2％的干酪素。

在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含1.5-2％的蔗糖。

在一些实施方案中，二化螟饲料包含选自以下的组分：琼脂、抗坏血酸、胆固醇、氯化胆碱、威氏盐、复合维生素b、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、甲醛以及以上的任意组合。

第二方面，本申请提供了二化螟饲料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将胡萝卜制成匀浆得到胡萝卜制备物，加入大豆粉、酵母粉、干酪素和蔗糖，搅拌均匀后，进行高压灭菌，得到组分a；

(2)向琼脂中加入水并加热至溶解，与组分a混合，搅拌均匀后冷却，得到组分b；

(3)将抗坏血酸、胆固醇、氯化胆碱、威氏盐、复合维生素b、山梨酸和对羟基苯甲酸甲酯溶解于水，与组分b混合，再与甲醛和冰乙酸溶液混合。

在一些实施方案中，制备方法还包括使从步骤(3)得到的产物冷却凝固的步骤。

第三方面，本申请提供了第二方面所述的方法制备的二化螟饲料。

第四方面，本申请提供了饲养二化螟的方法，包括用第一方面或第三方面所述的二化螟饲料喂养二化螟。

在一些实施方案中，饲养方法包括以下一个或多个步骤：

(1)初孵幼虫至化蛹：将所述二化螟饲料置于饲养盒中，将初孵幼虫置于饲料上，将饲养盒置于培养箱内，每隔2-5天添加或更换饲料，直至幼虫化蛹，所述培养箱内的环境条件为温度28±1℃，相对湿度70-80％，光照时间16l:8d；

(2)化蛹至羽化：当二化螟幼虫发育至6龄时，在另外的饲养盒中添加所述饲料并允许二化螟幼虫化蛹，待化蛹后将蛹挑出，辨别雌雄后，分别放入培养皿中，置于步骤(1)中相同环境条件下饲养，直至成虫羽化；

(3)羽化至产卵：将羽化后的成虫放入移栽有分蘖期水稻苗的产卵笼中进行交配产卵；

(4)卵至初孵幼虫：将产有二化螟卵的稻叶取下，放入培养皿中，然后置于步骤(1)中相同环境条件下发育，直至幼虫孵化。

附图简要说明

图1显示了测试实施例中两种饲料饲养的二化螟幼虫效果对比照片，图1a显示了用实施例1制备的饲料饲养的二化螟幼虫(标尺1mm)；图1b显示了用基于茭白饲料饲养的二化螟幼虫(标尺1mm)。

图2显示了测试实施例中两种饲料饲养的二化螟蛹效果对比照片，图2a显示了用实施例1制备的饲料饲养的二化螟蛹(标尺1mm)；图2b显示了用基于茭白饲料饲养的二化螟蛹(标尺1mm)。根据视觉评价，图2a中的二化螟蛹大于图2b的二化螟蛹。

图3显示了测试实施例中两种饲料饲养的二化螟成虫对比照片，图3a显示了用实施例1制备的饲料饲养的二化螟成虫，图3b显示了用基于茭白饲料饲养的二化螟成虫(其中指型玻璃试管d＝20mm)。

图4显示了测试实施例中两种饲料饲养的二化螟卵块效果对比照片，图4a显示了用实施例1制备的饲料饲养的二化螟卵块，图4b显示了用基于茭白饲料饲养的二化螟卵块(标尺1mm)。根据视觉评价，图4a中的二化螟虫单块卵粒数多于于图4b(标尺1mm)。

图5显示了用于本申请的饲养方法的示例性养虫盒装置的照片(饲养盒规格为d＝75mm，h＝10mm，盖子规格为d＝85mm，h＝42mm，盖子上面的铜丝网规格为d＝60mm)。

发明详细描述

目前的二化螟天然或人工饲料基本均是基于植物类生物质。本申 请的发明人创新式地选用胡萝卜作为二化螟饲料主要原料，并实现了理想的技术效果。此外，本申请的发明人还发现使用冰乙酸作为饲料防腐剂时能够实现较好的防腐效果。因此，本申请提供的二化螟的饲料、饲料制备方法或二化螟饲养方法能够提供下述一种或多种优势：

1.二化螟幼虫对饲料喜食性好，生长发育良好，在成蛹重量、15天幼虫平均存活率、15天幼虫重量、平均历期、化蛹率、羽化率、雌雄比、单雌产卵量、卵孵化率中的一项或多项生物学指标方面效果好。

2.作为主要原料的胡萝卜在全季节都容易获得，价格便宜，保鲜度高，能够降低饲料制造成本，并保证饲料品质。

3.添加冰乙酸作为饲料防腐剂时能够实现较好的防腐效果，在一些实例中能提供2个月以上的饲料保质期。通常情况下，不加冰乙酸在4℃可以保存45天，加入冰乙酸的饲料在4℃保存了75天后昆虫仍能正常取食。

4.本申请的饲料和方法适于大规模二化螟饲养。

第一方面，本申请提供了二化螟饲料，其包含胡萝卜制备物。

本申请所用的术语“胡萝卜制备物”指由胡萝卜经过处理得到的适于制造二化螟饲料的任何类型的基于胡萝卜的物质，包括，但不限于，胡萝卜的水性匀浆、胡萝卜泥、胡萝卜粉碎物、胡萝卜块等。

在一些实施方案中，二化螟饲料包含作为防腐剂的冰乙酸。本领域技术人员能够理解，可以使用的冰乙酸包含任何浓度的冰乙酸配制品，例如50％冰乙酸。

在一些实施方案中，二化螟饲料包含大豆粉、酵母粉、干酪素、蔗糖或以上的任意组合。大豆粉、酵母粉、干酪素、蔗糖是昆虫饲料中常用的组分，本领域技术人员能够容易地确定和获得合适形式的这些组分。

在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含以原料胡萝卜的重量计，7.5-22.5％的胡萝卜制备物。在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含0.1-1％的冰乙酸。在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含4.5-5.5％的大豆粉。在一些实施方 案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含3-4％的酵母粉。在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含1.5-2％的干酪素。在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含1.5-2％的蔗糖。

在一些实施方案中，二化螟饲料包含选自以下的组分：琼脂、抗坏血酸、胆固醇、氯化胆碱、威氏盐、复合维生素b、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、甲醛以及以上的任意组合。上述组分也是昆虫饲料中常用的组分，本领域技术人员能够容易地确定和获得合适形式的这些组分。在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含0.1-1％的抗坏血酸。在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含0.01-0.1％的胆固醇。在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含0.01-0.1％的氯化胆碱。在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含0.01-0.1％的威氏盐。在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含0.001-0.01％的复合维生素b。在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含0.1-1％的山梨酸。在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含0.1-1％的对羟基苯甲酸甲酯。在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含1-5％的琼脂。在一些实施方案中，基于二化螟饲料的重量，饲料包含0.05-0.5％的甲醛。

第二方面，本申请提供了二化螟饲料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将胡萝卜制成匀浆得到胡萝卜制备物，加入大豆粉、酵母粉、干酪素和蔗糖，搅拌均匀后，进行高压灭菌，得到组分a；

(2)向琼脂中加入水并加热至溶解，与组分a混合，搅拌均匀后冷却，得到组分b；

(3)将抗坏血酸、胆固醇、氯化胆碱、威氏盐、复合维生素b、山梨酸和对羟基苯甲酸甲酯溶解于水，与组分b混合，再与甲醛和冰乙酸溶液混合。

在一些实施方案中，制备方法还包括使从步骤(3)得到的产物冷却凝固的步骤。

作为非限制性的制备方法的实例，可以按照以下步骤实施：

a、将胡萝卜切成块，按比例加入水，放入搅拌器中磨碎并匀浆，匀 浆后将其倒入盛有大豆粉、酵母粉、干酪素和蔗糖的容器中，充分搅拌均匀后，置于手提式高压蒸汽灭菌锅中，于125℃下灭菌15min，灭菌完毕后，取出待用作为组分a；

b、琼脂中加入纯净水，加热并煮至沸腾，待完全溶解后，将其倒入组分a中，搅拌均匀，并冷却至60℃左右备用作为组分b；

c、按比例将抗坏血酸、胆固醇、氯化胆碱、威氏盐、复合维生素b、山梨酸和对羟基苯甲酸甲酯放入烧杯中，用少量温开水溶解，然后将其倒入组分b中，再按比例加入浓度40％的甲醛及浓度50％的冰乙酸，搅拌直至完全均匀；

d、将饲料搅拌均匀后，需倒入保鲜盒中，完全冷却凝固后存放于4℃冰箱中，待使用时可切割成小块。

应当理解，在不发生矛盾的情况下，第一方面所述的实施方案和技术特征也适用于第二方面。

第三方面，本申请提供了第二方面所述的方法制备的二化螟饲料。

第四方面，本申请提供了饲养二化螟的方法，包括用第一方面或第三方面所述的二化螟饲料喂养二化螟。

在一些实施方案中，饲养方法包括以下一个或多个步骤：

(1)初孵幼虫至化蛹：将所述二化螟饲料置于饲养盒中，将初孵幼虫置于饲料上，将饲养盒置于培养箱内，每隔2-5天添加或更换饲料，直至幼虫化蛹，所述培养箱内的环境条件为温度28±1℃，相对湿度70-80％，光照时间16l:8d；

(2)化蛹至羽化：当二化螟幼虫发育至6龄时，在另外的饲养盒中添加所述饲料并允许二化螟幼虫化蛹，待化蛹后将蛹挑出，辨别雌雄后，分别放入培养皿中，置于步骤(1)中相同环境条件下饲养，直至成虫羽化；

(3)羽化至产卵：将羽化后的成虫放入移栽有分蘖期水稻苗的产卵笼中进行交配产卵；

(4)卵至初孵幼虫：将产有二化螟卵的稻叶取下，放入培养皿中，然后置于步骤(1)中相同环境条件下发育，直至幼虫孵化。

作为非限制性的制备方法的实例，可以按照以下步骤实施：

a、初孵幼虫至化蛹：将饲料切成长方体放在饲养盒底部，将初孵幼虫放在饲料上，并盖上有铜丝网的盖子，置于植物培养箱内饲养，每隔5天添加或更换1次饲料，直至化蛹，植物培养箱内的环境条件为温度28±1℃，相对湿度70-80％，光照时间16l:8d；

b、化蛹至羽化：当二化螟幼虫发育至6龄时，在新的饲养盒底部加一块饲料并在饲料上端放置有折痕的吸水纸供其化蛹，待化蛹后将蛹挑出，辨别雌雄后，分别放入一次性培养皿中，置于步骤a中相同环境条件下饲养，直至成虫羽化；

c、羽化至产卵：将羽化后的成虫放入移栽有分蘖期水稻苗的产卵笼中进行交配产卵，并饲以10％的蜂蜜水补充营养，每天检查成虫的产卵情况并更换新鲜的水稻苗；

d、卵至初孵幼虫：将产有二化螟卵的稻叶取下，放入铺有湿滤纸的一次性培养皿中，并在上面盖一层湿滤纸保湿，然后置于步骤a中相同环境条件下发育，直至幼虫孵化。

应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。

实施例

提供以下实施例进一步描述本申请，而并非加以任何限制。

制备实施例1：

配制2000g饲料的配方如下：

复合维生素b配方如下：

烟酰胺：0.0060g；盐酸硫胺素(vb1)：0.0016g；核黄素(vb2)：0.0030g；盐酸吡哆醇(vb6)：0.0016g；赖氨肌醇(vb12)：0.00004g；叶酸:0.0016g；泛酸钙：0.0060g；生物素：0.00016g；总计：0.020g。

饲料配制方法：

1、将各组分按配比称重，备用；

2、将胡萝卜切成块，并加入700ml水，放入搅拌器中磨碎并匀浆，匀浆后将其倒入盛有大豆粉、酵母粉、干酪素和蔗糖的容器中，充分搅拌均匀后，置于手提式高压蒸汽灭菌锅中，于125℃下灭菌15min，灭菌完毕后，取出待用作为a组分；

3、琼脂中加入725.28ml纯净水，加热并煮至沸腾，待完全溶解后，将其倒入a组分中，用力搅拌均匀，并冷却至60℃左右备用作为b组分；

4、将称好的抗坏血酸、胆固醇、氯化胆碱、威氏盐、复合维生素b、山梨酸和对羟基苯甲酸甲酯放入烧杯中，用120ml温开水溶解，然后将其倒入b中，再加入1.8ml40％甲醛及40ml50％冰乙酸，搅拌直至完全均匀；

5、将饲料搅拌均匀后，倒入保鲜盒中，完全冷却凝固后存放于4℃冰箱中。

制备实施例2：

配制2000g饲料配方如下：

附复合维生素b配方：

烟酰胺：0.0060g；盐酸硫胺素(vb1)：0.0016g；核黄素(vb2)：0.0030g；盐酸吡哆醇(vb6)：0.0016g；赖氨肌醇(vb12)：0.00004g；叶酸:0.0016g；泛酸钙：0.0060g；生物素：0.00016g；总计：0.020g。

饲料配制方法：

1、将各组分按配比称重，备用；

2、将胡萝卜切成块，并加入700ml水，放入搅拌器中磨碎并匀浆，匀浆后将其倒入盛有大豆粉、酵母粉、干酪素和蔗糖的容器中，充分搅拌均匀后，置于手提式高压蒸汽灭菌锅中，于125℃下灭菌15min，灭菌完毕后，取出待用作为a组分；

3、琼脂中加入480.28ml纯净水，加热并煮至沸腾，待完全溶解后，将其倒入a组分中，用力搅拌均匀，并冷却至60℃左右备用作为b组分；

4、将称好的抗坏血酸、胆固醇、氯化胆碱、威氏盐、复合维生素b、山梨酸和对羟基苯甲酸甲酯放入烧杯中，用100ml温开水溶解，然后将其倒入b中，再加入1.8ml40％甲醛及5ml50％冰乙酸，搅拌直至完全均匀；

5、将饲料搅拌均匀后，倒入保鲜盒中，完全冷却凝固后存放于4℃冰箱中。

测试实施例

本实施例是为了测试本申请的二化螟饲料在饲养二化螟中的效果。作为比较，还一并测试了与按照实施例1的方法制备的基于苹果的饲料(下文简称“苹果饲料”，其中将实施例1中的胡萝卜原料替换为苹果，其余工艺相同)和按照第200910080336.2号中国专利申请中的方法制备的基于茭白的饲料(下文简称“茭白饲料”)。

材料与方法：

供试饲料：

测试实施例l制备的饲料、苹果饲料和茭白饲料。

二化螟的饲养方法：

1、初孵幼虫至化蛹：将人工饲料切成厚0.2mm、长30mm、宽15mm长方体放在饲养盒(d＝7.5cm,h＝10cm)底部，将初孵幼虫放在饲料上，并盖上有铜丝网(d＝6cm)的盖子(d＝8.5cm,h＝4.2cm)，置于植物培养箱内饲养，每隔5天添加或更换1次饲料，直至化蛹，所述植物培养箱内的环境条件为温度28±1℃，相对湿度70-80％，光照时间16l:8d；

2、化蛹至羽化：当二化螟幼虫发育至6龄时，在新的饲养盒底部加一块饲料并在饲料上端放置有折痕的吸水纸供其化蛹，待化蛹后将蛹挑出，辨别雌雄后，分别放入一次性培养皿(d1＝8.5cm,d2＝9cm)中，置于步骤1中相同环境条件下饲养，直至成虫羽化；

3、羽化至产卵：将羽化后的成虫放入移栽有分蘖期水稻苗的产卵笼 (a＝40cm,b＝40cm,c＝80cm)中进行交配产卵，并饲以10％的蜂蜜水补充营养，每天检查成虫的产卵情况并更换新鲜的水稻苗；

4、卵至初孵幼虫：将产有二化螟卵的稻叶取下，放入铺有湿滤纸的一次性培养皿中，并在上面盖一层湿滤纸保湿，然后置于步骤1中相同环境条件下发育，直至幼虫孵化。

5、幼虫孵化后，继续按上述步骤1、2、3、4循环操作继代饲养，不断提供所需虫源，直至饲养结束。

供试虫源：

从湖北孝感实验田采集二化螟幼虫，用茭白饲料饲养至化蛹、成虫羽化、产卵后，取下一代初孵幼虫为供试虫源。

二化螟的饲养方法：

1、初孵幼虫至化蛹：将人工饲料切成厚0.2mm、长30mm、宽15mm长方体放在饲养盒(d＝7.5cm,h＝10cm，如图5所示)底部，将初孵幼虫放在饲料上，并盖上有铜丝网(d＝6cm)的盖子(d＝8.5cm,h＝4.2cm)，置于植物培养箱内饲养，每隔5天添加或更换1次饲料，直至化蛹，所述植物培养箱内的环境条件为温度28±1℃，相对湿度70-80％，光照时间16l:8d；

2、化蛹至羽化：当二化螟幼虫发育至6龄时，在新的饲养盒底部加一块饲料并在饲料上端放置有折痕的吸水纸供其化蛹，待化蛹后将蛹挑出，辨别雌雄后，分别放入一次性培养皿(d1＝8.5cm,d2＝9cm)中，置于步骤1中相同环境条件下饲养，直至成虫羽化；

3、羽化至产卵：将羽化后的成虫放入移栽有分蘖期水稻苗的产卵笼(a＝40cm,b＝40cm,c＝80cm)中进行交配产卵，并饲以10％的蜂蜜水补充营养，每天检查成虫的产卵情况并更换新鲜的水稻苗；

4、卵至初孵幼虫：将产有二化螟卵的稻叶取下，放入铺有湿滤纸的一次性培养皿中，并在上面盖一层湿滤纸保湿，然后置于步骤1中相同环境条件下发育，直至幼虫孵化。

5、幼虫孵化后，继续按上述步骤1、2、3、4循环操作继代饲养，不断提供所需虫源，直至饲养结束。

评价方法：

设实施例l制备的饲料、苹果饲料和茭白饲料3个处理组，每个实验连续饲养1代，供试幼虫200头，在饲养过程中记录幼虫的发育历期、存活率、化蛹率、羽化率、雌蛹重、雄蛹重、雌雄比、产卵量及卵孵化率。每个实验共重复3次。本实验于2015年8月初至2015年10月底在中国种子集团有限公司生命科学技术中心实验室完成。

数据统计：

采用excel对数据进行初步分析，采用sas9.1.3软件对所得数据进行方差分析和显著性测验。

结果：

表1中总结了实验结果。如表1所示，用苹果饲料饲养的二化螟一直保持幼虫阶段，不能正常化蛹、羽化、产卵。实施例l制备的饲料与茭白饲料饲养效果相当，其中在二化螟的雄蛹重量和单雌产卵量两个指标上，实施例l制备的饲料显著优于茭白饲料。图1-4提供了实施例l制备的饲料与茭白饲料饲养中不同阶段的对比照片。如图1-4所示，用实施例l制备饲料饲养的二化螟蛹在体型上更大，产卵更多。

表1、三种饲料饲养二化螟的结果

注：表中数据为三次重复实验的平均数±标准差；*与对照的差异达显著水平(p<0.05)。