本发明属于果蔬采后保鲜生物防治技术领域，尤其是一种红提葡萄生物防霉保鲜方法。
背景技术：
葡萄采后极易受到微生物病害，尤其是由灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)引起的灰霉病，交链孢霉引起的(Alternaria spp.)引起的黑斑病，黑曲霉(Aspergillus niger)引起的黑粉病以及由青霉(Penicillus spp.)引起的蓝霉病，匍枝根霉(Rhizopus spp.)引起的窝巢状腐烂。灰霉葡萄抱引起的灰霉病是世界范围内各种果蔬上最常见和普遍发生的病害，是鲜食葡萄上最具毁灭性的病害，灰霉菌能够在低温条件下(0℃)生长，靠产生大量的灰色分生孢子进行传播，与其它采后病原真菌相比，具有潜伏侵染和低温致病的优势。同时，其还具有繁殖快、遗传变异大和适合度高的特点。
我国鲜食葡萄年产量多，但贮藏量仅为产量的3.8～4.5％，远低于全国水果的平均贮藏指数，葡萄属于多汁柔软的浆果，极易在采收、运输、贮藏和销售的过程中受到机械伤害，发生微生物病害，因此，鲜食葡萄的采后损耗也极为严重。鲜食葡萄保鲜差距和潜力巨大，具有广阔的发展空间。目前，葡萄保鲜主要依靠低温与化学药剂防腐，化学防腐剂的施用导致致病菌的抗药性增加以及造成的残留安全性问题受到权威机构的质疑与限制。因此，亟待开发一种新型的保鲜方法与配套技术。
本发明采用生理病理与温度、湿度、气体、生物防腐剂五大因素联控防腐。
技术实现要素：
本发明是为了克服现有技术的不足之处，提供一种保鲜时间长，方法简单的高生防拮抗菌剂的红提葡萄防霉保鲜方法。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种葡萄生物防霉保鲜方法，包括葡萄的分选、SO2熏蒸、防霉剂施用、CA贮藏，步骤如下：
⑴葡萄的分选：
采收成熟度较高，全红色，并且含糖量14％以上的葡萄，用果剪剔除有机械伤、破损、霉腐变质的果粒，0℃±1℃库体贮藏间内预冷12h；
⑵SO2熏蒸：
采用SO2低剂量首次300ppm熏蒸10小时，杀灭田间病原菌，葡萄霉菌量低于100spores/kg；
⑶表面喷施，在葡萄表面喷施生物保鲜剂，生物保鲜剂的配方如下：重量份数
100份无菌水中加入海藻糖1～3份、甘油4～5份、环氧大豆油3～4份和壳聚糖0.2～0.4份，5～10份的几丁质酶、5～8份的角质酶、8～10份的纤维素酶。
生物保鲜剂复性剂的制备方法：
100份无菌水中加入海藻糖1～3份、甘油4～5份、环氧大豆油3～4份和壳聚糖0.2～0.4份，并500～600r/min搅拌1-1.5小时，使其完全溶解，5～10份的几丁质酶、5～8份的角质酶、8～10份的纤维素酶，500～600r/min搅拌20～30分钟混匀，所制备生物保鲜剂置于0℃～4℃条件下保存；
复性剂为：将0.5～0.6份Mg2+、0.3～0.5份的Mn2+，并用10份的0.1mol/L磷酸缓冲液，充分混匀，调节pH 7.2～7.9，以提升酶活性；使用时活化保鲜剂后喷施于果蔬表面，自然晾干后于适宜温度、湿度和气体条件下贮藏。
⑷贮藏：
采用厚度为0.03mm葡萄PVC专用透湿保鲜袋，将保鲜袋扎口于0℃±1℃贮藏；包装袋内O2浓度2％～3％，CO2浓度1％～5％，湿度控制在90％～95％。
而且，所述生物保鲜剂的制备方法如下：
⑴由苏云金芽孢杆菌CICC 23702产生几丁质酶：
采用磁化水代替蒸馏水制备培养基，培养基中加0.8～1.0％的Mg2+、0.3％～0.5％的Mn2+以及0.2～0.3wt％的几丁质配成高产几丁质酶的诱导培养液；在红光条件下，加入30～40mL的增殖诱导培养基培养4d，复合诱导苏云金芽孢杆菌高产几丁质酶，培养液采用超声频率为15KHz-20KHz的超声波进行细胞破碎并纯化以敲除几丁质酶杂基，然后5000r/min低温离心20min后收集上清液，调节pH5.5～5.8至该几丁质酶等电点，沉淀提取分离；
⑵由从葡萄中分离的灰霉诱导产生角质酶、纤维素酶
诱导条件：将108spore/mL灰霉菌孢子加5mL霉菌增殖培养基中，其中培养基中加入0.8％～1.2％的角质酶和2.0％～2.5％的纤维素酶以诱导霉菌高产角质酶和纤维素酶，28℃培养4d后，5000r/min冷冻低温离心10min～20min，以除去菌体和培养基残渣，取上清液调节上清液pH6.2-6.9至两酶等电点，沉淀提取生物活性物质角质酶和纤维素酶；
⑶防霉保鲜剂配方：重量份数
100份无菌水中加入海藻糖1～3份、甘油4～5份、环氧大豆油3～4份和壳聚糖0.2～0.4份，并500～600r/min搅拌1-1.5小时，使其完全溶解，5～10份的几丁质酶、5～8份的角质酶、8～10份的纤维素酶，500～600r/min搅拌20～30分钟混匀，所制备拮抗菌素防霉剂置于0℃～4℃条件下保存；
⑷保鲜剂使用前首先进行抗菌酶复性
复性加入复性剂，复性剂为：将0.5～0.6份Mg2+、0.3～0.5份的Mn2+，并用10份的0.1mol/L磷酸缓冲液，混匀，调节pH 7.2～7.9；
所述步骤⑴的诱导培养液成分为：蛋白胨5.0g，牛肉浸膏3.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1L，pH7.0，121℃灭菌20min备用；
所述霉菌增殖培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。
而且，所述防霉保鲜剂：复性剂重量分数比为：1-10：100。
而且，所述生物保鲜剂的应用系统如下：包括库体贮藏间，高压空气发生器，保鲜剂配液罐，一次压力雾化器，二次压力喷器，在库体内的一侧放置保鲜剂配液罐，配液罐的出口通过管道连接一次雾化器，高压空气发生器通过管道分别给一次压力雾化器和二次压力喷器供压缩空气，一次压力雾化器的进液口通过管道与保鲜剂配液罐连接，为一次压力雾化器提供液体；
在一次压力雾化器的外部密封安装一外罩，外罩通过管道连接二次压力喷器进液口，将一次雾化后的微小液体输送至二次压力喷器，作为二次雾化的液体来源，一次压力雾化器和二次压力雾化器与现有的压力雾化器结构相同，本申请首次将其进出串联，使液体进行二次雾化，得到颗粒更小，分散度更加均匀的粒径小于1μm的气相粒子；在库体另一侧连通一个压力平衡装置，排气管端部延伸至水槽中；所述保鲜剂配液罐内放置权利要求1所述的生物保鲜剂。
本发明的优点和积极效果如下：
本发明提供的保鲜方法中结合了生物保鲜剂、温度湿度协同保鲜，以及新颖的保鲜装置进行组合保鲜，经过试验发现，本发明提供的方法能够大幅度延长葡萄的保险周期，可以达到120-150天。
本发明采用高产几丁质酶的菌种以及高效生产培养基来生产几丁质酶，能够大幅提高产率。
本发明的保鲜剂生产后形成干燥的粉末，非常容易保藏，常温保存即可，不需要特殊条件，使用时直接喷洒至葡萄表面，延长果蔬尤其是葡萄的保存期限。
本发明通过在培养基中增加诱导离子，同时辅以红光诱导，能够使几丁质的产量增加20％左右。经过高频超声的震荡，不仅能劈碎细胞，还能将几丁质上的杂基团震荡下去，提高几丁质酶的活性，保证生物保鲜剂的有效性。
本申请在保鲜剂的使用上首次使用了雾化器，雾化器采用二次雾化的方式来进行，通过使用对比发现，由于本保鲜剂的成分较多，经过一次雾化后，其分散效果不理想，二次雾化获得的气相粒子尺寸进一步减小，保证保鲜剂雾化颗粒在空间中的漂浮时间和空间范围，能够抑制果萼部位藏匿致病菌生长繁殖，立体全方位长时效地保证了葡萄贮藏品质和商业价值。
附图说明
图1是本发明中保鲜剂的使用设备及保鲜库的结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
一种高生防拮抗菌剂的红提葡萄防霉保鲜方法，主要包括：红提葡萄的分选、SO2熏蒸、生物保鲜剂的施用、CA贮藏，步骤如下：
⑴红提葡萄的分选：
采收成熟度较高，全红色，并且含糖量14％以上的葡萄，用果剪剔除有机械伤、破损、霉腐变质的果粒，0℃±1℃预冷库中预冷12h；
⑵SO2熏蒸:
采用SO2低剂量首次300ppm熏蒸10小时，杀灭田间病原菌，使葡萄霉菌量低于100spores/kg；
⑶表面喷施，在红提葡萄表面喷施生物保鲜剂，生物保鲜剂的配方如下：(重量份数)
100份无菌水中加入海藻糖1～3份、甘油4～5份、环氧大豆油3～4份和壳聚糖0.2～0.4份，5～10份的几丁质酶、5～8份的角质酶、8～10份的纤维素酶。
生物保鲜剂复性剂的制备方法：
100份无菌水中加入海藻糖1～3份、甘油4～5份、环氧大豆油3～4份和壳聚糖0.2～0.4份，并500～600r/min搅拌1-1.5小时，使其完全溶解，5～10份的几丁质酶、5～8份的角质酶、8～10份的纤维素酶，500～600r/min搅拌20～30分钟混匀，所制备生物保鲜剂置于0℃～4℃条件下保存；
复性剂为：将0.5～0.6份Mg2+、0.3～0.5份的Mn2+，并用10份的0.1mol/L磷酸缓冲液，充分混匀，调节pH 7.2～7.9，以提升酶活性；使用时活化保鲜剂后喷施于果蔬表面，自然晾干后于适宜温度、湿度和气体条件下贮藏。
复性剂的使用方法：
100重量份数复性剂可以复性1-10重量份生物保鲜剂。然后喷施于红提葡萄表面，进行贮藏。
⑷贮藏：
采用厚度为0.03mm葡萄PVC专用透湿保鲜袋，每袋装入红提葡萄4串容量；将保鲜袋扎口于0℃±1℃贮藏；包装袋内O2浓度2％～3％，CO2浓度1％～5％，湿度控制在90％～95％；间隔5-7天可喷施生物保鲜剂的复性剂，可进一步激活生物保鲜剂，延长保鲜时间，喷施保鲜剂时，将葡萄保险袋的袋口打开。
本发明涉及的生物保鲜剂主要作用成分为几丁质酶、角质酶、细胞壁降解酶，具体制备过程如下：
⑴几丁质酶由产几丁质酶的苏云金芽孢杆菌(CICC 23702)产生的，其为高生防拮抗菌素的主要成分。
该菌株采用磁化水代替蒸馏水制备培养基(培养基成分：蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0)，培养基中加0.8～1.0％的Mg2+、0.3％～0.5％的Mn2+以及0.2％～0.3％的几丁质配成高产几丁质酶的诱导培养液；红光条件下加入30～40mL的增殖诱导培养基培养4d，复合诱导苏云金芽孢杆菌高产几丁质酶，培养液采用超声频率为15KHz-20KHz的超声波细胞破碎后5000r/min低温离心20min后收集上清液，调节pH5.5～5.8至该几丁质酶等电点，沉淀提取分离。
其中，菌种苏云金芽孢杆菌(CICC 23702)于2016年5月30日购买于中国食品发酵工业研究院，发票号：17576933。
诱导培养液：蛋白胨5.0g，牛肉浸膏3.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1L，pH7.0，121℃灭菌20min备用。
⑵角质酶、纤维素酶由从葡萄中分离的灰霉诱导产生
诱导条件：将108spore/mL灰霉菌孢子加5mL霉菌增殖培养基中，其中培养基中加入0.8％～1.2％的角质酶和2.0％～2.5％的纤维素酶以诱导灰霉菌高产角质酶和纤维素酶，28℃培养4d后，5000r/min冷冻低温离心10min～20min，以除去菌体和培养基残渣，取上清液调节上清液pH6.2-6.9至两酶等电点，沉淀提取生物活性物质角质酶和纤维素酶。
本步骤中使用的灰霉菌(孢子)又叫做灰葡萄孢霉，分离于葡萄。英文：Botrytis cinerea公开文献：Botrytis：Biology Pathology and Control,Edited by Y.Elad,B.Williamson,P.Tudzynskiand N.Delen。
霉菌增殖培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。
⑶防霉保鲜剂配方：重量份数
100份无菌水中加入海藻糖1～3份、甘油4～5份、环氧大豆油3～4份和壳聚糖0.2～0.4份，并500～600r/min搅拌1-1.5小时，使其完全溶解，5～10份的几丁质酶、5～8份的角质酶、8～10份的纤维素酶，500～600r/min搅拌20～30分钟混匀，所制备拮抗菌素防霉剂置于0℃～4℃条件下保存；
本申请同时提供一种生物保鲜剂的应用系统，包括库体贮藏间3(气调库或相温库)，高压空气发生器8，保鲜剂配液罐7，一次压力雾化器6，二次压力喷器2，在库体内的一侧放置保鲜剂配液罐，配液罐的出口通过管道连接一次雾化器，高压空气发生器通过管道1分别给一次压力雾化器和二次压力喷器提供压缩空气，一次压力雾化器的进液口通过管道与保鲜剂配液罐连接，为一次压力雾化器提供液体，可以采用输液泵等现有技术。
本申请在一次压力雾化器的外部密封安装一外罩，外罩通过管道连接二次压力喷器进液口，将一次雾化后的微小液体输送至二次压力喷器，作为二次雾化的液体来源，一次压力雾化器和二次压力雾化器与现有的压力雾化器结构相同，本申请首次将其进出串联，使液体进行二次雾化，得到颗粒更小，分散更加均匀的喷雾颗粒。
为了保证库体内气压的平衡，在库体另一侧连通一个压力平衡装置，由一排气管4和水槽5构成，排气管端部延伸至水槽5中，依靠水压力保持库体贮藏间的气密性，一方面能够保证库体贮藏间不进气体，另一方面也能够保证库体内气压过大时，保鲜雾气能够有效排出并被回收，气密安全且环保。