本发明涉及一种饲料添加剂，具体涉及的是一种可有效提高饲料蛋白质利用率的复合蛋白酶及其应用。
背景技术：
蛋白酶是催化蛋白质肽键水解的一类酶，它能将蛋白质分解为蛋白胨、多肽及游离的氨基酸。饲料中的大分子蛋白需经过蛋白酶降解成肽和氨基酸后才能被畜禽利用。
饲用蛋白酶根据来源的不同，可以分为动物源性蛋白酶、植物源性蛋白酶、微生物源性蛋白酶。动物源性蛋白酶多从牛、羊、猪等胰脏中提取，生产成本较高。植物源性蛋白酶常见的有木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶。微生物蛋白酶既有通过细菌(如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌)培养提取的，也有通过真菌(如黑曲霉、米曲霉、酵母等)发酵提取的。由于微生物蛋白酶和植物蛋白酶生产成本相对低廉，得到广泛应用。
根据作用的最适ph值，蛋白酶又可分为：酸性蛋白酶(ph2.5-4.0)、中性蛋白酶(ph7.0左右)、碱性蛋白酶(ph8-11)，动植物蛋白质在这几种蛋白酶的内外切作用下被水解为小肽和氨基酸。动物对蛋白质的消化主要依赖于胃蛋白酶(酸性蛋白酶)和胰蛋白酶(碱性蛋白酶)。
幼龄动物由于消化器官发育尚不健全，自身还不能够分泌足够的蛋白酶来消化饲料中的蛋白质。以猪为例，在出生后2周，胃蛋白酶活性很低，两周后活性才逐渐增强；断奶对仔猪的胃酸分泌和各种酶活的发育产生负面影响，断奶后12h内食糜将出现明显蓄积，随后降低，直至50日龄前才明显回升。在这种情况下，在饲料中添加外源蛋白酶，可以有效补充内源蛋白酶的不足，提高饲料中蛋白质等营养物质的消化利用率。
外源蛋白酶还可能通过以下途径提高动物对营养物质的消化利用率：①增强内源蛋白酶的活性；②某些外源蛋白酶可能因作用位点等方面的不同，将一些动物内源蛋白酶难以消化的蛋白质水解为肽和氨基酸，进而提高动物对饲料蛋白质的消化率。
玉米中蛋白质含量6％～8％(干物质基础)，其中醇溶蛋白是胚乳中的主要蛋白，占整个蛋白的60～80％，疏水性残基多，溶解性差，消化率低，且和淀粉以结合体形式存在，影响淀粉的酶解，降低淀粉的消化利用率。研究已经表明，醇溶蛋白含量高的玉米，其体内和体外淀粉消化率明显降低(philippeau,2000；ferraretto,2013；allen,2008)，每增加1％的醇溶蛋白，反刍动物总消化道淀粉消化率降低0.86％(lawton,2002)。
高粱是五大谷类作物之一，可以作为一种动物饲用的基础型日粮。高粱的化学组成和玉米相似，富含丰富的淀粉和蛋白质，因此，高粱已成为畜禽生产中潜在的能量原料。但是实际上高粱的饲料转化率低，主要是由于高梁中大部分是醇溶蛋白，占整个蛋白的60％-80％，醇溶蛋白中疏水性残基多，溶解性差，且缺乏赖氨酸，醇溶蛋白通过二硫键组装成不同的蛋白体，而且高粱胚乳中的淀粉颗粒被嵌埋在密实的蛋白体中，从而影响淀粉的消化，降低淀粉的消化利用率。研究表明，外源添加含有蛋白酶的复合酶可以使高粱淀粉的水解率增加26％(lichtenwalner等，1978)。
技术实现要素：
本发明的目的之一是针对现有单独蛋白酶所存在的上述技术问题而提供一种复合蛋白酶，该复合蛋白酶用以补充内源蛋白酶，增强动物在幼龄阶段、疾病或应激状态下对蛋白质的消化吸收能力，达到改善其肠道健康的目的。
本发明的目的之二在于提供上述复合蛋白酶在饲料中的应用，其可降解玉米高粱中的醇溶蛋白，提高蛋白质利用率，间接提高淀粉消化利用率，节约日粮成本，提高生产性能的目的。
本发明提供的一种复合蛋白酶一方面可以通过补充内源蛋白酶不足，达到增强动物在幼龄阶段、疾病或应激状态下对蛋白质的消化利用能力，改善肠道健康的目的，另一方面可以降解玉米和高粱中的醇溶蛋白，加强蛋白质的消化利用，促进淀粉的消化吸收，节约日粮成本，提高生产性能。
作为本发明第一方面的一种复合蛋白酶，其特征在于包括载体以及添加于载体中的复合蛋白酶，所述复合蛋白酶，是将酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶按照比例配制，其中每克复合蛋白酶中各种单酶的酶活如下：酸性蛋白酶1000-10000u，中性蛋白酶1000-10000u，碱性蛋白酶1000-10000u。
在本发明的一个优选实施例中，所述酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶均由黑曲霉、米曲霉、长柄木霉或枯草芽孢杆菌产，采用液态发酵和固态深层发酵工艺制备而成。
在本发明的一个优选实施例中，所述复合蛋白酶由以下重量百分比的原料配制而成：20％的酸性蛋白酶，20％的中性蛋白酶，10％碱性蛋白酶，50％载体。
作为本发明的一种复合蛋白酶在动物饲料中的应用，以有效提高饲料蛋白质利用率。
在本发明的一个优选实施例中，所述动物饲料为蛋鸡饲料、肉鸡饲料、猪饲料中的一种。
在本发明的一个优选实施例中，所述动物饲料包括核心料、浓缩料或全价料。
在本发明的一个优选实施例中，所述全价料为上述复合蛋白酶的最终添加量为100-1000克/吨全价饲料。
本发明的复合蛋白酶的有益效果为：
1、可以补充内源蛋白酶分泌不足，增强动物在幼龄阶段、疾病或应激状态下对蛋白质的消化吸收能力，改善肠道健康。
2、可以使商品化醇溶蛋白降解30～60％，使高粱中醇溶蛋白含量降低0.5％～2％(干物质)。
3、可以提高肉鸡生产性能、降低饲养成本，增加经济效益。经实验室分析及肉鸡饲养试验可知，本发明的蛋白酶有效酶活高，体内体外试验效果明显，有效促进动物的生长，增加经济效益。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法，若无特殊说明，均为常规方法，所述实验试剂和仪器，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下面实施案例中使用的可提高蛋白质消化利用率的复合蛋白酶，包括载体、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶，其质量比为50:20:20:10。
下面实施案例中使用的各种蛋白酶的制备方法如下：选用作用效果较好的黑曲霉，液态发酵。生产流程如下：冷冻管—摇瓶培养—种子罐—发酵罐—培养罐—喷雾干燥—成品。具体工艺为常规工艺，在此不再赘述。
实施例1
本发明的一种可有效提高蛋白质利用率的蛋白酶与市售进口蛋白酶对醇溶蛋白降解效果的比较
1材料与方法
1.1材料
蛋白酶：蛋白酶a(本发明的蛋白酶产品)、蛋白酶b(进口酶样品1)、蛋白酶c(进口酶样品2)。
玉米醇溶蛋白：于市场购买。
试验试剂：0.0125mol/l含1％sds和0.5％2-巯基乙醇的四硼酸钠溶液、72％三氯乙酸溶液、kh2po4缓冲液等；
试验仪器：振荡器、恒温水浴锅、离心机、分光光度计等。
1.1.2体外法研究蛋白酶对玉米醇溶蛋白的降解
(1)玉米醇溶蛋白的溶解：用含1％sds的四硼酸钠缓冲液(ph10)溶解一定量的玉米醇溶蛋白。
(2)体外模拟鸡胃肠道消化环境研究蛋白酶对玉米醇溶蛋白的降解
分别量取以上玉米醇溶蛋白溶解液(0.06g醇溶蛋白)2ml，加7ml含有胃蛋白酶的kh2po4缓冲液，添加蛋白酶液1ml(按高梁的1％添加)，以蒸馏水代替蛋白酶液作空白对照，ph值调至3.0，于恒温振荡器中120r/min振荡，37℃反应1h，反应结束后，加0.3ml2mol/lnaoh溶液，ph调至6.5，继续放入恒温振荡器反应3h，反应结束后立即取出冷却。分别取上述反应液1ml，利用混浊度分析法测定蛋白质浓度。
(3)体外模拟猪胃肠道消化环境研究蛋白酶对玉米醇溶蛋白的降解
分别量取以上玉米醇溶蛋白溶解液(0.06g醇溶蛋白)2ml，加7ml含有胃蛋白酶的kh2po4缓冲液，添加蛋白酶液1ml(按高梁的1％添加)，以蒸馏水代替蛋白酶液作空白对照，ph值调至2.0，120r/min振荡，37℃反应5h，反应结束后加2mol/lnaoh调ph值至7.0，继续反应16h，反应结束后立即冷却。分别取上述反应液1ml，利用混浊度分析法测定蛋白质浓度。
1.1.3蛋白酶对高梁醇溶蛋白的降解
(1)高梁醇溶蛋白溶解液的制备
称取一定量的高梁，按照一定的比例加入0.0125mol/l含有1％sds和0.5％2-巯基乙醇的四硼酸钠缓冲液溶解，于室温下搅拌抽提2h，制得所需的高梁醇溶蛋白溶液。
(2)蛋白酶对高梁醇溶蛋白的降解
分别取以上高梁醇溶蛋白的抽提液5ml加入4mlph为7.0的kh2po4缓冲液，预热5min，加入蛋白酶液(1000g/t饲料)1ml，37℃反应3h，取上述反应液进行混浊度分析。
(3)混浊度分析法测定蛋白浓度
混浊度分析法测定原理：先用胃蛋白酶除掉可消化的蛋白质，未经消化的蛋白质(即醇溶蛋白)用含有1％sds(w/v)和0.5％的2-巯基乙醇的四硼酸钠溶液解聚成多肽链，用tca浓缩蛋白质，于紫外分光光度计下测定混浊度，通过蛋白标准曲线测得蛋白含量。
本试验中，对混浊度分析法原理的基础上做了改进，首先用胃蛋白酶除掉可消化的蛋白质，未经消化的蛋白质用sds四硼酸钠缓冲液溶解，加入适宜的外源蛋白酶，体外模拟动物胃肠道环境进行水解，反应液中加入tca，浓缩反应剩余的难消化蛋白质，于紫外分光光度计下测定混浊度，通过蛋白曲线计算蛋白浓度，蛋白浓度越低，说明蛋白酶对醇溶蛋白的降解率越高，降解效果越明显。
2结果
2.1体外法研究蛋白酶对玉米醇溶蛋白的降解
由表1可知，在体外模拟猪鸡消化道环境下，蛋白酶a对玉米醇溶蛋白的降解率高达50％，而蛋白酶b和蛋白酶c对醇溶蛋白降解率不足20％。说明蛋白酶a降解醇溶蛋白效率高。
表1蛋白酶对玉米醇溶蛋白的降解
2.2蛋白酶对高梁醇溶蛋白的降解
由表2可知，体外模拟猪消化道环境后，蛋白酶a对高梁醇溶蛋白的降解率为8％，略高于蛋白酶b，蛋白酶c没有降解效果。
表2蛋白酶对高粱醇溶蛋白的降解
3结果与讨论
醇溶蛋白是饲用高梁和玉米胚乳中的主要贮存蛋白，并与胚乳中的淀粉颗粒以结合体形式存在并将其包裹，对动物的淀粉消化率产生负面影响。相关研究已经表明，每增加1％的醇溶蛋白含量，反刍动物总消化道淀粉消化率将降低0.86％。醇溶蛋白不溶于水，不易被内源蛋白酶降解消化。蛋白质的结构特征别是二硫键的存在会影响蛋白质的水解，研究表明，角蛋白、醇溶蛋白特别是γ-醇溶蛋白富含胱氨酸和大量的二硫键，会阻止蛋白酶的水解。研究已指出，链霉蛋白酶、添加有角蛋白酶活性的蛋白酶能够水解醇溶蛋白，增加淀粉的水解率。
本试验体外模拟动物胃肠道消化环境，运用混浊度分析法，以蛋白质降解率为指标，比较评价不同来源的蛋白酶对玉米和高粱醇溶蛋白的降解率。试验结果发现，蛋白酶a对醇溶蛋白的降解效果均好于蛋白酶b和蛋白酶c，对玉米醇溶蛋白的降解率达到50％，而较之对高梁醇溶蛋白降解率低，这可能与玉米和高粱醇溶蛋白结构存在差异有关，如高粱醇溶蛋白二硫键的含量高等。
实施例2
本发明的一种可有效提高蛋白质利用率的蛋白酶与市售进口蛋白酶对aa肉仔鸡生长性能的影响
1材料与方法
1.1试验材料
采用1日龄健康、体重一致的aa肉鸡96只。
蛋白酶：蛋白酶a(本发明的蛋白酶产品)、蛋白酶b(进口酶样品1)、蛋白酶c(进口酶样品2)。
1.2试验设计
选取健康、体重一致的1日龄aa肉鸡随机分为4个处理，每个处理4个重复，每个重复6只。包括对照组(基础日粮组)、处理组t1(基础日粮+蛋白酶a)、处理组t2(基础日粮+蛋白酶b)，处理组t3(基础日粮+蛋白酶c)，试验期25d，分1-10日龄和11-25日龄两个阶段进行。各处理具体试验设计见表3。
表3试验设计
1.3试验日粮
试验日粮参照安伟捷aa商品代肉鸡饲养和料营养成分含量标准配制。
1.4饲养管理及检测指标
1.4.1饲养管理
试验鸡采用我司的禽用正/负压隔离器进行分笼饲养，自由采食和饮水。24h光照，温度和湿度按照常规饲养管理要求进行控制，试验期内每天观察各组鸡只的耗料量，试验开始和结束时分别以笼为单位进行鸡只称重，并计算鸡只平均体增重，为准确计算采食量，定期收集抛撒料称重。以重复笼为单位计算耗料量和料肉比。记录各重复鸡只死淘情况。
1.4.2检测指标
生长性能指标：体重、平均耗料量、平均日增重、料肉比
1.5数据处理与统计分析方法
用excel表对数据进行汇总，采用pasw18.0软件对数据进行单因素方差分析，采用duncan法进行多重比较，p<0.05表示差异显著，p>0.05表示差异显著。
2结果与分析
从本试验的结果可知1-25日龄肉仔鸡饲粮中添加蛋白酶后显著提高了日增重(p<0.05)，显著降低了料肉比(p<0.05)，本发明的蛋白酶产品与进口蛋白酶产品b效果相当。
表4蛋白酶对1-25日龄肉仔鸡生长性能的影响
实施例3
本发明的一种可有效提高蛋白质利用率的蛋白酶与市售进口蛋白酶对三元杂交生长猪生长性能的影响
1材料与方法
1.1试验材料
初始平均体重为23.4kg的健康三元杂交生长猪144头。
蛋白酶：蛋白酶a(本发明的蛋白酶产品)、蛋白酶d(进口酶样品)
1.2试验设计
初始平均体重为23.4kg的健康三元杂交生长猪96头随机分为3个处理，每个处理6个重复，每个重复8只。包括对照组(基础日粮组)、处理组t1(基础日粮+蛋白酶a)、处理组t2(基础日粮+蛋白酶d)，试验期70天，分两个阶段进行，每个阶段35天。各处理具体试验设计见表5。
表5试验设计
1.3试验日粮
参照nrc(2012)猪营养需要推荐营养水平进行高粱-豆粕型基础日粮配制。
1.4饲养管理及检测指标
1.4.1饲养管理
封闭栏舍内水泥地面平养，自由采食，自动饮水器供水，各栏环境一致，按常规管理程序进行驱虫和免疫。在试验期35d和70d以重复为单位进行群体称重并统计。
1.4.2检测指标
生长性能指标：体重(bw)、平均日采食量(adfi)、平均日增重(adg)、料肉比(fcr)。
1.5数据处理与统计分析方法
用excel表对数据进行汇总，采用pasw18.0软件对数据进行单因素方差分析，采用duncan法进行多重比较，p<0.05表示差异显著，p>0.05表示差异显著。
2结果与讨论
蛋白酶对三元杂交生长猪生长性能的影响见表6。由表6可知，无论在试验期的0-35d、36-70d还是0-37d，生长猪高粱-豆粕型日粮中添加本发明蛋白酶产品均能在降低日采食量的同时提高日增重，从而有效降低料肉比。对饲喂高粱-豆粕型日粮的生长猪的效果远好于某进口蛋白酶产品。
表6蛋白酶对三元杂交生长猪生长性能的影响