一种提高蛋白质利用率的多肽生产方法
【专利摘要】一种多肽生产方法，依次包括如下步骤：（1）取含蛋白质的原料，加水浸泡后得到第一料液；（2）对第一料液搅拌并均质；（3）用碱性蛋白酶对第一料液酶解；（4）步骤（3）得到的酶解液灭酶并离心，得到上清液A和沉淀A；（5）沉淀A加水，得到第二料液；用中性蛋白酶对第二料液酶解；（6）步骤（5）得到的酶解液灭酶并离心，得到上清液B和沉淀B；（7）沉淀B加水，得到第三料液；用酸性蛋白酶对第三料液酶解；（8）步骤（7）得到的酶解液灭酶，离心后得到上清液C；（9）上清液A、上清液B和上清液C混合，得到多肽混合液；（10）除去多肽混合液中的水，得到多肽。本发明能提高对原料的蛋白质利用率，并获得品质优良的多肽产品。
【专利说明】一种提高蛋白质利用率的多肽生产方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及肽的制备方法，具体涉及一种提高蛋白质利用率的多肽生产方法。
【背景技术】
[0002]多肽通常是指其肽链中具有2 - 50个氨基酸残基的物质。与大分子的蛋白质相t匕，不同的多肽具有不同的生理功能，例如:延缓机体的衰老，减少各种老年性疾病的发生；抑制皮肤老化；降血压，降血脂，提高免疫力。多肽除了具有各种生理功能外，还可提高食品的稳定性，延长食品的储藏期，并具有溶解性好、加工性能好、不过敏、容易吸收等特点。因此，多肽是食品、保健品和营养品的重要配料。
[0003]多肽的来源包括:(I)从天然生物体中提取；(2)在胃肠道消化蛋白质的过程中产生，或通过体外酶解蛋白质产生；(3)化学合成、酶法合成或重组DNA技术合成。由于含量很少或提取困难，从天然生物体中提取的多肽不能满足人类大规模的需求。药理级多肽常用的化学合成法有副反应发生，这些副产物对人体有害。酶法生产多肽因其具有生产条件温和、安全性高、价格低廉等优点，是生产多肽的主流方法。
[0004]生产多肽的原料包括植物蛋白、动物蛋白和藻类蛋白。植物蛋白包括大豆蛋白、麦胚蛋白、玉米醇溶蛋白、菜籽蛋白、花生蛋白、油茶籽蛋白、葵花籽蛋白等；动物蛋白包括乳蛋白、鱼类蛋白、卵白蛋白、胶原蛋白等；藻类蛋白包括裂壶藻蛋白、螺旋藻蛋白、寇氏隐甲藻蛋白、吾肯氏藻蛋白等。
[0005]现有多肽生产方法一般采用一种蛋白酶或多种蛋白酶的组合，进行一次酶解，其缺陷是蛋白质利用率较低，一般在40%(重量)以下。为了提高得率或蛋白质利用率，通常采取增加酶的用量、延长反应时间等方式来满足，然而，实际上，酶的用量、反应时间等酶解参数是相互制约的，在一定的条件下，靠延长反应时间来提高得率或蛋白质利用率，其效果并不明显，而且会产生大量的游离氨基酸，影响产品的品质。
[0006]另外，多肽的生产过程中，面临的问题之一是脱盐，因为酶解过程中反复调节pH值，酶解液中盐的含量较高。虽然酶解可使原先埋藏在蛋白质分子内部的疏水性氨基酸暴露出来，从而使蛋白酶解物从水相通过疏水作用吸附到树脂的疏水表面，并可利用不同浓度洗脱剂的不同极性对蛋白酶解物进行分级纯化，而酶解物中的无机盐则因不被树脂吸附而在水洗脱时去除，但这些方法工艺复杂，成本很高。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种提高蛋白质利用率的多肽生产方法，这种多肽生产方法通过相对独立的三次连续酶解，既能提高对原料的蛋白质利用率，又能获得品质优良的多肽产品。采用的技术方案如下:
一种提高蛋白质利用率的多肽生产方法，其特征在于依次包括如下步骤:
(1)原料预处理:取含蛋白质的原料，加水浸泡后得到第一料液；
(2)均质处理:将步骤(1)得到的第一料液搅拌均匀后进行均质处理；(3)碱性蛋白酶酶解:将均质处理后的第一料液灭菌后调整其温度至37- 50°C，并调节其pH值至7.5 — 9.5，然后加入占原料重量I 一 5%的蛋白酶，在搅拌的情况下酶解I 一3小时；
本步骤所用的蛋白酶是碱性蛋白酶、胰蛋白酶和Protamex复合蛋白酶中的一种或其中两种的组合；
(4)第一次灭酶、离心分离:将步骤(3)得到的酶解液灭酶，然后以3000- 4500转/分钟的转速离心10 - 15分钟，得到上清液A和沉淀A ；
(5)中性蛋白酶酶解:将沉淀A加水并搅拌均匀，得到第二料液；然后将第二料液的温度调整到37 - 50°C，并调节其pH值至7.0-7.5，再加入占沉淀A重量2 — 8%的蛋白酶，在搅拌的情况下酶解I 一 3小时；
本步骤所用的蛋白酶是中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味酶中的一种或其中两种的组合；
(6)第二次灭酶、离心分离:将步骤(5)得到的酶解液灭酶，然后以3000- 4500转/分钟的转速离心10 - 15分钟，得到上清液B和沉淀B ；
(7)酸性蛋白酶酶解:将沉淀B加水并搅拌均匀，得到第三料液；然后将第三料液的温度调整到37 - 50°C，并调节其pH值至3 — 5，再加入占沉淀B重量I 一 5%的蛋白酶，在搅拌的情况下酶解I 一 2小时； 本步骤所用的蛋白酶是酸性蛋白酶和胃蛋白酶中的一种或两者的组合；
(8)第三次灭酶、离心分离:将步骤(7)得到的酶解液灭酶，然后以3000- 4500转/分钟的转速离心10 - 15分钟，弃去沉淀，得到上清液C ；
(9)将上清液A、上清液B和上清液C混合并将其混合液的pH值调节到6.5 — 7.0，得到多肽混合液；
(10)除去多肽混合液中的水，得到多肽。
[0008]优选步骤(1)中，所用原料的蛋白质含量>35%(重量)。
[0009]优选步骤(1)中，所加入的水的重量是原料的8 — 10倍；浸泡时间为30 - 60分钟。
[0010]优选步骤(2)中，均质处理在温度为45 — 60°C、压力为10 — 20MPa的条件下进行。
[0011]优选步骤(3)中，将均质处理后的第一料液在85 - 95°C下灭菌15 — 30分钟，然后冷却至37 — 50。。。
[0012]优选步骤(4)中，将步骤(3)得到的酶解液于85 - 95°C下灭酶10 — 15分钟。
[0013]优选步骤(5)中，所加入的水的重量是沉淀A的6 — 8倍。
[0014]优选步骤(6)中，将步骤(5)得到的酶解液于85 - 95°C下灭酶10 — 15分钟。
[0015]优选步骤(7)中，所加入的水的重量是沉淀B的6 — 8倍。
[0016]优选步骤(8)中，将步骤(7)得到的酶解液于85 - 95°C下灭酶10 — 15分钟。
[0017]步骤(10)中，将多肽混合液真空浓缩后喷雾干燥(真空浓缩、喷雾干燥均为除去水的处理过程)，得到多肽。
[0018]本发明对原料中组成底物蛋白的氨基酸种类、数量及序列没有特别要求，可用于生产多肽的原料包括大豆脱脂后的豆柏(含植物蛋白)、菜籽柏(油菜籽提油后的副产物，含植物蛋白)、小麦胚芽、花生柏(花生仁经压榨提炼油料后的副产物，富含植物蛋白)、葵花籽柏(葵花籽经预压榨或直接浸出法榨取油脂后的副产物)、裂壶藻提油后的裂壶藻柏(含藻类蛋白)、螺旋藻、寇氏隐甲藻或其提油后的藻柏(含藻类蛋白)、吾肯氏藻或其提油后的藻柏(含藻类蛋白)、乳清浓缩蛋白(含动物蛋白)、鱼鳞、猪皮等。
[0019]本发明根据不同酶对蛋白质的酶解位点不同的原理，采用三次酶解的方式，达到提高蛋白利用率的目的，即:首先在碱性条件下采用碱性蛋白酶、Protmex和胰蛋白酶中的一种或其中两种的组合进行酶解；之后在中性条件下采用中性蛋白酶、风味酶和木瓜蛋白酶中的一种或其中两种的组合进行酶解；最后在酸性条件下，采用酸性蛋白酶和胃蛋白酶中的一种或两者的组合进行酶解。通过三次不同条件下的酶解，使原料中所含的蛋白质得到充分利用，蛋白质利用率>80%，并且得到的产品多肽含量高。
[0020]本发明通过采用合适的酶解时间，来控制合适的酶解程度(水解度)，以减少游离氨基酸的产生。而且，三次酶解是相对独立的，在每次酶解后分离出上清液，然后对沉淀继续酶解(即碱性蛋白酶酶解后分离出上清液，再用中性蛋白酶对其产生的沉淀酶解；中性蛋白酶酶解后分离出上清液，再用酸性蛋白酶对其产生的沉淀酶解)，以进一步减少游离氨基酸的产生，将最终产品中的游离氨基酸含量降低。
[0021]本发明是在适当调整pH值的前提下，通过合理控制酶解时间、合理控制酶解顺序的方式对含盐量进行控制，酶解时只需调整每种酶解液的最初PH值，最后形成的产品调回中性即可，无需脱盐，从而简化工艺并降低成本。
[0022]本发明得到的多肽产品水溶性好，蛋白质含量达70%(重量)以上，可作为食品、保健品和营养品的配料使用，特别适合对溶解度和低过敏性要求较高的产品中。
【具体实施方式】
[0023]实施例1
本实施例中，提高蛋白质利用率的多肽生产方法依次包括如下步骤:
(O原料预处理:取含蛋白质的原料(原料为大豆脱脂后的豆柏，其蛋白质含量>45% (重量))，加水浸泡后得到第一料液；
本步骤(1)中，所加入的水的重量是原料的8倍；浸泡时间为60分钟。
[0024](2)均质处理:将步骤(1)得到的第一料液搅拌均匀后进行均质处理；
本步骤(2)中，均质处理在温度为45°C、压力为20MPa的条件下进行。
[0025](3)碱性蛋白酶酶解:将均质处理后的第一料液灭菌后调整其温度至37°C (将均质处理后的第一料液在85°C下灭菌30分钟，然后冷却至37°C )，并调节其pH值至7.5，然后加入占原料重量1%的蛋白酶(均为碱性蛋白酶)，在搅拌的情况下酶解3小时；
(4)第一次灭酶、离心分离:将步骤(3)得到的酶解液灭酶(将步骤(3)得到的酶解液于85°C下灭酶10分钟)，然后以3000转/分钟的转速离心15分钟，得到上清液A和沉淀A ；
(5)中性蛋白酶酶解:将沉淀A加水并搅拌均匀(所加入的水的重量是沉淀A的6倍)，得到第二料液；然后将第二料液的温度调整到37°C，并调节其pH值至7.0，再加入占沉淀A重量2%的蛋白酶(均为中性蛋白酶)，在搅拌的情况下酶解3小时；
(6)第二次灭酶、离心分离:将步骤(5)得到的酶解液灭酶(将步骤(5)得到的酶解液于95°C下灭酶10分钟)，然后以3000转/分钟的转速离心15分钟，得到上清液B和沉淀B ；(7)酸性蛋白酶酶解:将沉淀B加水并搅拌均匀(所加入的水的重量是沉淀B的6倍)，得到第三料液；然后将第三料液的温度调整到37°C，并调节其pH值至3，再加入占沉淀B重量1%的蛋白酶(均为胃蛋白酶)，在搅拌的情况下酶解2小时；
(8)第三次灭酶、离心分离:将步骤(7)得到的酶解液灭酶(将步骤(7)得到的酶解液于85°C下灭酶15分钟)，然后以3000转/分钟的转速离心15分钟，弃去沉淀，得到上清液C ；
(9)将上清液A、上清液B和上清液C混合并将其混合液的pH值调节到6.5，得到多肽混合液；
(10)除去多肽混合液中的水，得到多肽。
[0026]本步骤(10)中，将多肽混合液真空浓缩后喷雾干燥(真空浓缩、喷雾干燥均为除去水的处理过程)，得到多肽。
[0027]本实施例的蛋白质利用率>80% (重量)，得到的多肽产品的蛋白质含量>70% (重量)。
[0028]实施例2
本实施例中，提高蛋白质利用率的多肽生产方法依次包括如下步骤:
(I)原料预处理:取含蛋白质的原料(原料为乳清浓缩蛋白，其蛋白质含量>35%(重量))，加水浸泡后得到第一料液；
本步骤(1)中，所加入的水的重量是原料的10倍；浸泡时间为30分钟。
[0029](2)均质处理:将步骤(1)得到的第一料液搅拌均匀后进行均质处理；
本步骤(2)中，均质处理在温度为60°C、压力为1MPa的条件下进行。
[0030](3)碱性蛋白酶酶解:将均质处理后的第一料液灭菌后调整其温度至50°C (将均质处理后的第一料液在95°C下灭菌15分钟，然后冷却至50°C)，并调节其pH值至9.5，然后加入占原料重量5%的蛋白酶(胰蛋白酶和Protamex复合蛋白酶的组合，其中胰蛋白酶和Protamex复合蛋白酶重量各占一半),在搅拌的情况下酶解I小时；
(4)第一次灭酶、离心分离:将步骤(3)得到的酶解液灭酶(将步骤(3)得到的酶解液于95°C下灭酶10分钟)，然后以4500转/分钟的转速离心10分钟，得到上清液A和沉淀A ；
(5)中性蛋白酶酶解:将沉淀A加水并搅拌均匀(所加入的水的重量是沉淀A的8倍)，得到第二料液；然后将第二料液的温度调整到50°C，并调节其pH值至7.5，再加入占沉淀A重量8%的蛋白酶(木瓜蛋白酶和风味酶的组合，其中木瓜蛋白酶和风味酶重量各占一半)，在搅拌的情况下酶解I小时；
(6)第二次灭酶、离心分离:将步骤(5)得到的酶解液灭酶(将步骤(5)得到的酶解液于95°C下灭酶10分钟)，然后以4500转/分钟的转速离心10分钟，得到上清液B和沉淀B ；
(7)酸性蛋白酶酶解:将沉淀B加水并搅拌均匀(所加入的水的重量是沉淀B的8倍)，得到第三料液；然后将第三料液的温度调整到50°C，并调节其pH值至5，再加入占沉淀B重量5%的蛋白酶(均为胃蛋白酶)，在搅拌的情况下酶解I小时；
(8)第三次灭酶、离心分离:将步骤(7)得到的酶解液灭酶(将步骤(7)得到的酶解液于95°C下灭酶10分钟)，然后以4500转/分钟的转速离心10分钟，弃去沉淀，得到上清液C ；
(9)将上清液A、上清液B和上清液C混合并将其混合液的pH值调节到7.0，得到多肽混合液；
(10)除去多肽混合液中的水，得到多肽。[0031 ] 本步骤(10)中，将多肽混合液真空浓缩后喷雾干燥(真空浓缩、喷雾干燥均为除去水的处理过程)，得到多肽。
[0032]本实施例的蛋白质利用率>80% (重量)，得到的多肽产品的蛋白质含量>70% (重量)。
[0033]实施例3
本实施例中，提高蛋白质利用率的多肽生产方法依次包括如下步骤:
(1)原料预处理:取含蛋白质的原料(原料为裂壶藻提油后的裂壶藻柏，其蛋白质含量>40% (重量))，加水浸泡后得到第一料液；
本步骤(1)中，所加入的水的重量是原料的9倍；浸泡时间为45分钟。
[0034](2)均质处理:将步骤(1)得到的第一料液搅拌均匀后进行均质处理；
本步骤(2)中，均质处理在温度为50°C、压力为15MPa的条件下进行。
[0035](3)碱性蛋白酶酶解:将均质处理后的第一料液灭菌后调整其温度至45°C (将均质处理后的第一料液在90°C下灭菌20分钟，然后冷却至45°C )，并调节其pH值至8.0，然后加入占原料重量3%的蛋白酶(均为Protamex复合蛋白酶)，在搅拌的情况下酶解2小时；
(4)第一次灭酶、离心分离:将步骤(3)得到的酶解液灭酶(将步骤(3)得到的酶解液于90°C下灭酶12分钟)，然后以4000转/分钟的转速离心11分钟，得到上清液A和沉淀A ；
(5)中性蛋白酶酶解:将沉淀A加水并搅拌均匀(所加入的水的重量是沉淀A的7倍)，得到第二料液；然后将第二料液的温度调整到40°C，并调节其pH值至7.5，再加入占沉淀A重量4%的蛋白酶(木瓜蛋白酶和风味酶的组合，其中木瓜蛋白酶和风味酶重量各占一半)，在搅拌的情况下酶解2小时；
(6)第二次灭酶、离心分离:将步骤(5)得到的酶解液灭酶(将步骤(5)得到的酶解液于90°C下灭酶12分钟)，然后以3500转/分钟的转速离心15分钟，得到上清液B和沉淀B ；
(7)酸性蛋白酶酶解:将沉淀B加水并搅拌均匀(所加入的水的重量是沉淀B的7倍)，得到第三料液；然后将第三料液的温度调整到45°C，并调节其pH值至4，再加入占沉淀B重量3%的蛋白酶(酸性蛋白酶和胃蛋白酶的组合，其中酸性蛋白酶和胃蛋白酶重量各占一半)，在搅拌的情况下酶解1.5小时；
(8)第三次灭酶、离心分离:将步骤(7)得到的酶解液灭酶(将步骤(7)得到的酶解液于90°C下灭酶12分钟)，然后以3500转/分钟的转速离心12分钟，弃去沉淀，得到上清液C ；
(9)将上清液A、上清液B和上清液C混合并将其混合液的pH值调节到6.8，得到多肽混合液；
(10)除去多肽混合液中的水，得到多肽。
[0036]本步骤(10)中，将多肽混合液真空浓缩后喷雾干燥(真空浓缩、喷雾干燥均为除去水的处理过程)，得到多肽。
[0037]本实施例的蛋白质利用率>80% (重量)，得到的多肽产品的蛋白质含量>70% (重量)。
【权利要求】
1.一种提高蛋白质利用率的多肽生产方法，其特征在于依次包括如下步骤: (1)原料预处理:取含蛋白质的原料，加水浸泡后得到第一料液； (2)均质处理:将步骤(1)得到的第一料液搅拌均匀后进行均质处理； (3)碱性蛋白酶酶解:将均质处理后的第一料液灭菌后调整其温度至37- 50°C，并调节其pH值至7.5 — 9.5，然后加入占原料重量I 一 5%的蛋白酶，在搅拌的情况下酶解I 一3小时； 本步骤所用的蛋白酶是碱性蛋白酶、胰蛋白酶和Protamex复合蛋白酶中的一种或其中两种的组合 ； (4)第一次灭酶、离心分离:将步骤(3)得到的酶解液灭酶，然后以3000- 4500转/分钟的转速离心10 - 15分钟，得到上清液A和沉淀A ； (5)中性蛋白酶酶解:将沉淀A加水并搅拌均匀，得到第二料液；然后将第二料液的温度调整到37 - 50°C，并调节其pH值至7.0-7.5，再加入占沉淀A重量2 — 8%的蛋白酶，在搅拌的情况下酶解I 一 3小时； 本步骤所用的蛋白酶是中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味酶中的一种或其中两种的组合； (6)第二次灭酶、离心分离:将步骤(5)得到的酶解液灭酶，然后以3000- 4500转/分钟的转速离心10 - 15分钟，得到上清液B和沉淀B ； (7)酸性蛋白酶酶解:将沉淀B加水并搅拌均匀，得到第三料液；然后将第三料液的温度调整到37 — 50°C，并调节其pH值至3 — 5，再加入占沉淀B重量I 一 5%的蛋白酶，在搅拌的情况下酶解I 一 2小时； 本步骤所用的蛋白酶是酸性蛋白酶和胃蛋白酶中的一种或两者的组合； (8)第三次灭酶、离心分离:将步骤(7)得到的酶解液灭酶，然后以3000- 4500转/分钟的转速离心10 - 15分钟，弃去沉淀，得到上清液C ; (9)将上清液A、上清液B和上清液C混合并将其混合液的pH值调节到6.5 — 7.0，得到多肽混合液； (10)除去多肽混合液中的水，得到多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽生产方法，其特征在于:步骤(1)中，所用原料的蛋白质含量>35% (重量)。
3.根据权利要求1所述的多肽生产方法，其特征在于:步骤(1)中，所加入的水的重量是原料的8 — 10倍；浸泡时间为30 - 60分钟。
4.根据权利要求1所述的多肽生产方法，其特征在于:步骤(2)中，均质处理在温度为45 - 60°C、压力为10 - 20MPa的条件下进行。
5.根据权利要求1所述的多肽生产方法，其特征在于:步骤(3)中，将均质处理后的第一料液在85 - 95°C下灭菌15 - 30分钟，然后冷却至37 — 50°C。
6.根据权利要求1所述的多肽生产方法，其特征在于:步骤(4)中，将步骤(3)得到的酶解液于85 - 95°C下灭酶10 - 15分钟。
7.根据权利要求1所述的多肽生产方法，其特征在于:步骤(5)中，所加入的水的重量是沉淀A的6 — 8倍。
8.根据权利要求1所述的多肽生产方法，其特征在于:步骤(6)中，将步骤(5)得到的酶解液于85 - 95°C下灭酶10 - 15分钟。
9.根据权利要求1所述的多肽生产方法，其特征在于:步骤(7)中，所加入的水的重量是沉淀B的6 — 8倍。
10.根据权利要求1所述的多肽生产方法，其特征在于:步骤(8)中，将步骤(7)得到的酶解液于85 - 95°C 下灭酶10 - 15分钟。
【文档编号】C12P21/06GK104073540SQ201410322074
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月5日 优先权日:2014年7月5日
【发明者】李建平, 任国谱 申请人:广东润科生物工程有限公司