一种提高葛根黄酮抗氧化活性的方法与流程

本发明涉及葛根黄酮的改性，尤其涉及一种提高葛根黄酮抗氧化活性的方法。

背景技术：

黄酮类化合物是一类多酚类抗氧化剂，是葛根、补骨脂、黄芩、银杏、沙棘、槐米等临床常用中药材的主要活性成分。该类化合物不仅数量众多，而且结构复杂，具有许多重要的生理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、抗过敏、抗糖尿病并发症等。

天然黄酮类化合物虽然生理活性丰富并且广泛存在于自然界，但因其溶解性差、生物利用度不高等缺点而限制了它们的临床应用。因此对自然界含量较高的天然黄酮进行结构修饰，使之达到成药要求,是合理开发利用该类化合物的一条重要途径。传统化学催化的方法会使产物变得复杂，并且其使用的试剂不适合添加到食品中，其溶剂残留问题将阻碍改性产物在食品等行业中的应用。而选择酶做催化剂，因其选择性强，反应条件温和，产品更易被食品等行业接受而成为当前研究的热点。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种提高葛根黄酮抗氧化活性的方法，采用一种风味水解酶β-葡萄糖苷酶对葛根黄酮粉进行水解处理，将葛根黄酮苷水解为具有更高抗氧化活性以及更好脂溶性的苷元，以拓展葛根黄酮粉在食品等行业的应用。

技术方案：本发明所述的提高葛根黄酮抗氧化活性的方法，包括：将葛根黄酮分散于缓冲液中，加入β葡萄糖苷酶进行反应，反应温度为30-50℃；反应结束后过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，再对萃取液进行减压蒸馏和干燥。

所述缓冲液的pH为4.5-6.5，优选的，pH为5.5-6.0，更优选的，pH为6.0。

所述的缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液。本领域人员知晓，所述的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液通常根据pH要求由0.2M磷酸氢二钠与0.1M柠檬酸按照不同比例混合而得。

将葛根黄酮分散于缓冲液中，料液比为1:2.5-1:20，优选的，料液比为

1:5-1:10，更优选的，料液比为1:5。

所述β葡萄糖苷酶的添加量为：每克葛根黄酮中添加50-400IUβ葡萄糖苷酶，优选的，每克葛根黄酮中添加100-300IUβ葡萄糖苷酶，更优选的，每克葛根黄酮中添加200IUβ葡萄糖苷酶。

为使反应进行完全，所述反应的时间为0.5-2.5h，优选的，反应时间为1h，反应温度为30-45℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

与传统的化学法相比，采用β葡萄糖苷酶对葛根黄酮进行处理，反应条件温和，除了使用食品级乙酸乙酯外，无任何有机溶剂的加入，无有毒溶剂残留。

采用β葡萄糖苷酶对葛根黄酮进行处理，有效提高了其抗氧化活性和脂溶性，拓展了其在食品等行业的应用。与未经处理相比，DPPH自由基清除率由25.89％提高到92.53％，总还原力由0.139提高到0.704，羟基自由基清除率由3.19％提高到22.79％。衡量脂溶性的透光率从0.108提高到1.000，DPPH自由基清除率达同浓度维生素C的98.1％。

附图说明

图1为pH对产物抗氧化活性的影响；

图2为料液比对产物抗氧化活性的影响；

图3为酶添加量对产物抗氧化活性的影响；

图4为温度对产物抗氧化活性的影响；

图5为水解时间对产物抗氧化活性的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

本发明具体实施方式中所用的β葡萄糖苷酶的酶活为100IU/g。

本发明具体实施方式中相关参数的测试方法如下：

1、羟基自由基清除率测定：

将样品用乙醇配成5g/L溶液。取1.0mL，分别加入9.0mmol/L FeSO₄、9.0mmol/L水杨酸-乙醇各1.0mL，对照组以蒸馏水1.0mL代替样品溶液。最后加8.8mmol/L H₂O₂启动反应，37℃水浴反应0.5h后，以蒸馏水调零，在波长510nm下测定吸光度。以Vc作阳性对照品，临用前用蒸馏水配制成与样品溶液相同的质量浓度。同法操作，进行对照试验。

清除率(％)＝([A₀-Ax-Ax₀)/A₀]×100计算清除率。

式中：A₀用蒸馏水代替水杨酸时测得的不同提取物浓度本底吸光度；

Ax为样品吸光度值；

Ax₀为用水代替样品测定的吸光度值。

2、DPPH自由基清除率测定：

将待测样品用无水乙醇配成5g/L。用乙醇做溶剂将DPPH配制成浓度为1.183g/L乙醇溶液作为储备液，临用前用无水乙醇溶液稀释成0.1183g/L。

测定：样品溶液+溶液各2ml为Ai(为样品抑制吸收值)；样品溶液+无水乙醇2ml为Ac(为样品对照)；DPPH溶液+无水乙醇各2ml为Aj(为无抑制吸收值)；4ml无水乙醇为无抑制吸收值对照。分别充分振荡混匀，室温静止30min后在517nm处测定吸收值(每个值同时测定两管)。

抑制率＝(Aj-Ai)*100％/Aj，结果以Vc作阳性对照。

3、总还原力测定：

将样品用无水乙醇配成5g/L。取2.5mL样品液，加入2.5mL 2.5mol/LpH6.6磷酸盐缓冲液，再加入2.5mL 1％六氰合铁酸钾和0.2mL 1％蔗糖酯溶液；充分振荡混匀；盖上塞子将该试管置于50℃水浴锅中保温20min；取出试管进行快速冷却,然后加入2.5mL 10％TCA,充分振荡混匀后4 000r/min离心10min；取离心后的上清液2.5mL，加入2.5mL浓度25％甲醇和0.5mL 0.1％三氯化铁,充分振荡混匀，静置10min后测定其在700nm处的吸光度值，用去离子水代替样品的混合液进行还原力参比测定试验。混合液的吸光度越强，表明还原力越强。

4、脂溶性测定：

称取10mg干燥后的产品，溶于10mL氯仿中，超声10min使其溶解，配成浓度为1g/L的溶液或悬液，在测之前再在震荡器上震荡混匀后用紫外分光光度计测定溶液或悬液在800nm下的透光率。

实施例1

称取5g葛根黄酮粉，按料液比(g/mL)1:5加入pH5.5柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，加入5gβ葡萄糖苷酶，在40℃下水解1h。反应结束后，抽滤，滤液用50mL食品级乙酸乙酯萃取二次。将萃取液40℃减压蒸馏去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

将真空干燥后的样品用乙醇溶解，配成5g/L浓度，测定其DPPH自由基清除率为73.42％，总还原力0.375，羟基自由基清除率为12.47％。

实施例2

称取5g葛根黄酮粉，按料液比(g/mL)1:5加入pH6柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，加入5gβ葡萄糖苷酶，在30℃下水解1h。反应结束后，抽滤，滤液用50mL食品级乙酸乙酯萃取二次。将萃取液40℃减压蒸馏去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

将真空干燥后的样品用乙醇溶解，配成5g/L浓度，测定其DPPH自由基清除率为61.59％，总还原力0.268，羟基自由基清除率为9.86％。

实施例3

称取5g葛根黄酮粉，按料液比(g/mL)1:5加入pH6柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，加入5gβ葡萄糖苷酶，在45℃下水解1h。反应结束后，抽滤，滤液用50mL食品级乙酸乙酯萃取二次。将萃取液40℃减压蒸馏去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

将真空干燥后的样品用乙醇溶解，配成5g/L浓度，测定其DPPH自由基清除率为85.96％，总还原力0.452，羟基自由基清除率为18.47％。

实施例4

称取5g葛根黄酮粉，按料液比(g/mL)1:5加入pH6柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，加入10gβ葡萄糖苷酶，在45℃下水解1h。反应结束后，抽滤，滤液用50mL食品级乙酸乙酯萃取二次。将萃取液40℃减压蒸馏去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

将真空干燥后的样品用乙醇溶解，配成5g/L浓度，测定其DPPH自由基清除率为92.53％，总还原力0.504，羟基自由基清除率为22.79％。

空白组：指未经酶处理的原料样品。

对照组1：指除不加酶外，其他操作参照实施例4。

对照组2：指以维生素C为对照品，用水配成5g/L浓度，按法测定DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率以及总还原力。

结果见表1。

表1

实施例5

称取5g葛根黄酮粉，按料液比(g/mL)1:5加入不同pH柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，加入10gβ葡萄糖苷酶，在40℃下水解1h。反应结束后，抽滤，滤液用50mL食品级乙酸乙酯萃取二次。将萃取液40℃减压蒸馏去除乙酸乙酯，40℃真空干燥。

pH分别设置为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，考察不同pH对产物抗氧化性能的影响，结果见图1，pH为6.0时产物抗氧化性能最佳。

实施例6

缓冲液的pH为5.5，料液比分别设置为1:2.5,1:5,1:10,1:15,1:20，考察不同料液比对改性产物抗氧化性能的影响，其余实验步骤同实施例5。

结果见图2，料液比为1:5时产物抗氧化性能最佳。

实施例7

缓冲液的pH为6.0，在45℃下水解1h，调整β葡萄糖苷酶的添加量，每克葛根黄酮中分别添加50、100、200、300、400IUβ葡萄糖苷酶，考察不同酶量对产物抗氧化性能的影响，其余实验步骤同实施例5。

结果见图3，β葡萄糖苷酶的添加量为200IU/g时产物抗氧化性能最佳。

实施例8

缓冲液的pH为6.0，β葡萄糖苷酶的添加量为10g，水解1h，调整反应温度分别设置为30、35、40、45以及50℃，考察不同反应温度对改性产物抗氧化性能的影响，其余实验步骤同实施例5。

结果见图4，温度为45℃时产物抗氧化性能最佳。

实施例9

缓冲液的pH为6.0，β葡萄糖苷酶的添加量为10g，在40℃分别反应0.5、1、1.5、2、2.5h，考察不同反应时间对改性产物抗氧化性能的影响，其余实验步骤同实施例5。

结果见图5，反应1h时产物抗氧化性能最佳。