本发明涉及活性成分提取技术领域，具体是一种从打碗花叶中提取酵母菌抑制剂的方法。
背景技术：
食品腐败微生物会引起食品发生化学或物理性质变化，从而使食品失去原有的营养价值、组织性状及色、香、味。植物性和动物性食品原料在收获、运输、加工和贮藏过程中，都会受到微生物的污染。在能引起食品腐败变质的微生物中，起主要作用的，除了我们熟知的一些细菌和霉菌外，酵母菌也扮演着非常重要的角色。
在高浓度糖分的糖浆、果酱、浓缩果汁等食品中，使其变质起主要作用的有鲁氏酵母、罗氏酵母、蜂蜜酵母、意大利酵母、异常汉逊氏酵母、汉氏德巴利氏酵母、膜醭毕赤氏酵母等。酵母菌对多数糖有分解作用，部分菌种还能氧化有机酸，具有耐高浓度糖和盐的特性，通常在果汁、炼乳中引起腐败。如炼乳球拟酵母、球拟酵母使炼乳罐头产气而膨胀，严重时发生爆裂。它们在果汁、果酱中繁殖后，改变内容物的风味，并产生汁液浑浊和沉淀，当大量产一氧化碳后，使容器膨胀和爆裂。而假丝酵母属是引起充气或不充气软饮料产生浑浊的腐败菌之一。其中，啤酒酵母（saccharomycescerevisiae）是常见的酵母菌，细胞呈圆形或椭圆性，有的有假丝，主要分布在果皮、果汁、果园土壤中。啤酒酵母是面包生产和酒精发酵最重要的属，同时也引起食品的腐败，产生酒精和二氧化碳。由此可见，酵母菌对食品腐败的作用不可小视。
目前，人们在生产应用中，为了防止酵母菌对食品的破坏作用，通常把一些抗生素，如链霉素、放线菌酮、制霉菌素等作为酵母菌抑制剂添加到食品中。很显然，如果人体长时间过量食用抗生素，肯定对身体造成巨大伤害。山梨酸是国际粮农组织和卫生组织推荐的高效安全的防腐保鲜剂，但是对酵母菌的抑制作用有限，在实际生产过程中必须添加很多的山梨酸，才能真正达到预期的效果，经济上不是很划算。因此，开发更多廉价、有效、作用更少的酵母菌抑制剂供食品工业选择使用就显得尤为重要。
我国中药资源丰富，从天然植物中寻找新的低毒、高效的酵母菌抑制剂一直是国内外的研究热点。打碗花，又叫打破碗花，为毛莨科银莲花属植物。打碗花在生产应用上主要用于杀虫，具有土农药的美称，在四川、湖南等地打碗花被广泛应用于杀灭蛆虫和孑孓。打碗花中的活性成分主要为原白头翁素，具有抗小麦赤霉病和水稻白叶枯病的功能。然而，通过本发明实验研究还发现，打碗花的乙醇抽提物对酵母菌等真菌具有抑制活性，且活性成分稳定，与原白头翁素不同，易于制备与保存。
超临界萃取兼有精馏和固液萃取的特点，利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行物质的分离。超临界二氧化碳流体具有安全无残留等优点，是应用最多的超临界流体，被广泛应用于活性物质的制备或精炼中。
现有技术如授权公告号为cn103705555b的中国发明专利，公开了一种基于超临界提取的制备性分离青枫叶中黄酮的方法，青枫叶经烘干、粉碎，过筛为提取原料，提取原料装入超临界萃取釜中萃取，萃取温度为20-40℃，co2流体压力为20-40mpa，夹带剂乙醇流速0.10-0.40ml/min下，萃取时间为1-3h，萃取物用甲醇吸收，ab-8树脂层析、乙醇洗脱，浓缩后浓缩液，浓缩液再用聚酰胺层析，乙醇洗脱，浓缩干燥，就从青枫叶中得到淡黄色粉末的黄酮提取物，该方法制备简单，提取的黄酮提取物纯度较高，主要含有ⅳ苷元-槲皮素，黄酮类化合物含量约为75-80%。该方法中采用甲醇作为萃取物的溶剂，甲醇对人的神经系统伤害很大，具有明显的麻醉作用，可引起脑水肿。对视神经和视网膜有特殊的选择作用，易引起视神经萎缩，导致双目失明。所以该方法提取得到的黄酮安全度有待提高。
现有技术如授权公告号为cn102742920b的中国发明专利，公开了一种从野棉花干叶中提取酵母菌抑制剂的方法，属于中草药活性成分的提取领域。该方法的工艺步骤如下：a、将野棉花的干叶粉碎后加入乙醇，室温下震荡分离出上清液，再将上清液浓缩干燥得乙醇浸膏；b、将乙醇浸膏分散于蒸馏水中，再加入己烷震荡萃取3～4次，收集水相萃取物；c、将水相萃取物浓缩后，上mci-gel反相树脂层析柱，用水-甲醇梯度洗脱，收集具有活性的甲醇洗脱峰流份，经浓缩干燥后即得到酵母菌抑制剂。该方法工艺简单、操作方便，环保，成本低；所提取得到的酵母抑菌剂的抑菌活性强、纯度高；浓度为10mg/ml时对酵母菌的抑菌圈直径为14～16mm。但该方法在提取过程中活性物质损失大，提取的活性物质量少。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提取率高、得到的活性物质纯度高、抑菌效果好、活性物质损失小、无溶剂残留、绿色安全的从打碗花叶中提取酵母菌抑制剂的方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
从打碗花叶中提取酵母菌抑制剂的方法，具体步骤为：
1）预处理：将打碗花洗净，干燥，粉碎，加入无水乙醇，打碗花粉末：乙醇体积比为1:8~15。超声波助溶，超声波频率为240~270w，超声时间为25~32min。过滤，取滤液，旋蒸干燥，得到打碗花活性物质粗粉。醇提辅以超声助溶，超声波能使体系宏观流动加快并且颗粒固体之间的碰撞加快，使得传质的边界层部分变得极为细薄，传质速率得到了显而易见的增强。能够穿透打碗花细胞的细胞壁，让乙醇以最快的速度进入到植物细胞细胞质中，以便于溶解出其中的活性物质。超声提取能够明显的缩短其提取的时间，并且提取的条件适中温和，使得提取产率有了明显提高；
2）超临界提取：将打碗花活性物质粗粉置于二氧化碳超临界萃取釜中，乙醇为夹带剂，超临界萃取压力为25~31mpa，温度为34~38℃，夹带剂乙醇流速为0.2~0.4ml/min，萃取1.2~2.0h，co2流速为4~5l/h。含有活性物质的超临界co2进入解析釜，调节温度和压强，分离压力为10~12mpa，分离温度为32~35℃，得到的物质即为打碗花活性物质粉末。采用超临界二氧化碳流体提取技术提取打碗花活性物质，对环境友好，无溶剂残留，提取时间短，提取效率高；
3）超滤：将步骤2得到的活性物质乙醇溶液进行超滤，超滤膜孔径为2~4kda，取滞留液，真空浓缩，得到浓缩液。超滤可除去溶于乙醇并分子量小于2~4kda的杂质，分离效果好，并且不会造成打碗花活性物质的流失；
4）大孔树脂吸附：将大孔树脂装柱平衡后对步骤3得到的浓缩液进行梯度洗脱。洗脱时间、洗脱液成分及其百分比和流速分别为：0~5min，超纯水+硫酸镁，流速为0.18~0.22bv/h；5~15min，90%超纯水+10%异丙醇+硫酸镁，流速为0.18~0.22bv/h；15~25min，70%超纯水+30%异丙醇+硫酸镁，流速为0.18~0.22bv/h；25~40min，100%异丙醇，流速为0.18~0.22bv/h；40~50min，60%超纯水，40%异丙醇+硫酸镁，流速为0.18~0.22bv/h，硫酸镁加入量为洗脱液质量的1/10000~1/15000。收集具有活性的100%异丙醇洗脱峰流份。硫酸镁能够有效的提高打碗花活性成分的挂柱率，使活性物质损失小，避免了部分活性物质在未加异丙醇的时候就洗脱下来，造成活性物质的浪费，提高了活性物质的提取率；
5）透析、干燥：将洗脱液旋蒸浓缩后置于透析袋中透析，旋蒸浓缩至原来体积的1/300~1/400，透析袋孔径为2~4kda，取滞留液，去除打孔树脂吸附过程中加入的硫酸镁，旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到酵母菌抑制剂。最后得到的酵母菌抑制剂中打碗花活性成分纯度高、抑菌效果好、无溶剂残留、绿色安全。本发明对打碗花活性成分的提取率高，采用的溶剂对人健康无危害，绿色健康，提取效率高，整个制备过程耗费的时间短；成本低廉，操作步骤简单，适合工厂化生产。
与现有技术相比，本发明的优点在于：醇提辅以超声助溶，超声波能使体系宏观流动加快并且颗粒固体之间的碰撞加快，使得传质的边界层部分变得极为细薄，传质速率得到了显而易见的增强。能够穿透打碗花细胞的细胞壁，能够让乙醇以最快的速度进入到植物细胞细胞质中，以便于溶解出其中的活性物质。超声提取能够明显的缩短其提取的时间，并且提取的条件适中温和，使得提取产率有了明显提高；采用超临界二氧化碳流体提取技术提取打碗花活性物质，对环境友好，无溶剂残留，提取时间短，提取效率高；超滤可除去溶于乙醇并分子量小于2~4kda的杂质，分离效果好，并且不会造成打碗花活性物质的流失；洗脱液中加入硫酸镁，能够有效的提高打碗花活性成分的挂柱率，避免了部分活性物质在未加异丙醇的时候就洗脱下来，造成活性物质的浪费，提高了活性物质的提取率；最后得到的酵母菌抑制剂中打碗花活性成分纯度高、抑菌效果好、无溶剂残留、绿色安全。本发明对打碗花活性成分的提取率高，采用的溶剂对人健康无危害，绿色健康，提取效率高，整个制备过程耗费的时间短；成本低廉，操作步骤简单，适合工厂化生产。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
从打碗花叶中提取酵母菌抑制剂的方法，具体步骤为：
1）预处理：将打碗花洗净，干燥，粉碎，加入无水乙醇，打碗花粉末：乙醇体积比为1:8~15。超声波助溶，超声波频率为240~270w，超声时间为25~32min。过滤，取滤液，旋蒸干燥，得到打碗花活性物质粗粉。醇提辅以超声助溶，超声波能使体系宏观流动加快并且颗粒固体之间的碰撞加快，使得传质的边界层部分变得极为细薄，传质速率得到了显而易见的增强。能够穿透打碗花细胞的细胞壁，让乙醇以最快的速度进入到植物细胞细胞质中，以便于溶解出其中的活性物质。超声提取能够明显的缩短其提取的时间，并且提取的条件适中温和，使得提取产率有了明显提高；
2）超临界提取：将打碗花活性物质粗粉置于二氧化碳超临界萃取釜中，乙醇为夹带剂，超临界萃取压力为25~31mpa，温度为34~38℃，夹带剂乙醇流速为0.2~0.4ml/min，萃取1.2~2.0h，co2流速为4~5l/h。含有活性物质的超临界co2进入解析釜，调节温度和压强，分离压力为10~12mpa，分离温度为32~35℃，得到的物质即为打碗花活性物质粉末。采用超临界二氧化碳流体提取技术提取打碗花活性物质，对环境友好，无溶剂残留，提取时间短，提取效率高；
3）超滤：将步骤2得到的活性物质乙醇溶液进行超滤，超滤膜孔径为2~4kda，取滞留液，真空浓缩，得到浓缩液。超滤可除去溶于乙醇并分子量小于2~4kda的杂质，分离效果好，并且不会造成打碗花活性物质的流失；
4）大孔树脂吸附：将大孔树脂装柱平衡后对步骤3得到的浓缩液进行梯度洗脱。洗脱时间、洗脱液成分及其百分比和流速分别为：0~5min，超纯水+硫酸镁，流速为0.18~0.22bv/h；5~15min，90%超纯水+10%异丙醇+硫酸镁，流速为0.18~0.22bv/h；15~25min，70%超纯水+30%异丙醇+硫酸镁，流速为0.18~0.22bv/h；25~40min，100%异丙醇，流速为0.18~0.22bv/h；40~50min，60%超纯水，40%异丙醇+硫酸镁，流速为0.18~0.22bv/h，硫酸镁加入量为洗脱液质量的1/10000~1/15000。收集具有活性的100%异丙醇洗脱峰流份。硫酸镁能够有效的提高打碗花活性成分的挂柱率，避免了部分活性物质在未加异丙醇的时候就洗脱下来，造成活性物质的浪费，提高了活性物质的提取率；
5）透析、干燥：将洗脱液旋蒸浓缩后置于透析袋中透析，旋蒸浓缩至原来体积的1/300~1/400，透析袋孔径为2~4kda，取滞留液，去除打孔树脂吸附过程中加入的硫酸镁，旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到酵母菌抑制剂。最后得到的打碗花活性成分纯度高、抑菌效果好、无溶剂残留、绿色安全。本发明对打碗花活性成分的提取率高，采用的溶剂对人健康无危害，绿色健康，提取效率高，整个制备过程耗费的时间短；成本低廉，操作步骤简单，适合工厂化生产。
实施例2：
从打碗花叶中提取酵母菌抑制剂的方法，最优选步骤为：
1）预处理：将打碗花洗净，干燥，粉碎，加入无水乙醇，打碗花粉末：乙醇体积比为1:11。超声波助溶，超声波频率为255w，超声时间为29min。过滤，取滤液，旋蒸干燥，得到打碗花活性物质粗粉。醇提辅以超声助溶，超声波能使体系宏观流动加快并且颗粒固体之间的碰撞加快，使得传质的边界层部分变得极为细薄，传质速率得到了显而易见的增强。能够穿透打碗花细胞的细胞壁，让乙醇以最快的速度进入到植物细胞细胞质中，以便于溶解出其中的活性物质。超声提取能够明显的缩短其提取的时间，并且提取的条件适中温和，使得提取产率有了明显提高；
2）超临界提取：先将打碗花活性物质粗粉置于已保温至40℃的二氧化碳超临界萃取釜中，然后开启二氧化碳高压泵以4.6l/h的流速向萃取釜中注入二氧化碳气体。将萃取釜内压力升至28mpa，温度为37℃，并通过调节萃取釜至解析釜间的阀门保持压力不变，乙醇为夹带剂，流速为0.31ml/min，萃取1.8h。含有活性物质的超临界二氧化碳进入温度为33℃，压力为10mpa的解析釜内，在解析釜内二氧化碳气体与打碗花活性物质分离，打碗花活性物质沉至解析釜底，间歇释放获得打碗花活性物质；在停止萃取、释放萃取釜内压力后取出釜内打碗花活性物质粉末。二氧化碳气体进高压泵加压至28mpa，重新进入萃取釜，循环使用。采用超临界二氧化碳流体提取技术提取打碗花活性物质，对环境友好，无溶剂残留，提取时间短，提取效率高；
3）超滤：将步骤2得到的活性物质乙醇溶液进行超滤，超滤膜孔径为3kda，取滞留液，真空浓缩，得到浓缩液。超滤可除去溶于乙醇并分子量小于3kda的杂质，分离效果好，并且不会造成打碗花活性物质的流失；
4）大孔树脂吸附：将xda-1大孔树脂装柱平衡后对步骤3得到的浓缩液进行梯度洗脱。洗脱时间、洗脱液成分及其百分比和流速分别为：0~5min，超纯水+硫酸镁，流速为0.26bv/h；5~15min，90%超纯水+10%异丙醇+硫酸镁，流速为0.26bv/h；15~25min，70%超纯水+30%异丙醇+硫酸镁，流速为0.26bv/h；25~40min，100%异丙醇，流速为0.26bv/h；40~50min，60%超纯水，40%异丙醇+硫酸镁，流速为0.26bv/h，硫酸镁加入量为洗脱液质量的1/12000。收集具有活性的100%异丙醇洗脱峰流份。硫酸镁能够有效的提高打碗花活性成分的挂柱率，避免了部分活性物质在未加异丙醇的时候就洗脱下来，造成活性物质的浪费，提高了活性物质的提取率；
5）透析、干燥：将洗脱液旋蒸浓缩后置于透析袋中透析，旋蒸浓缩至原来体积的1/360，透析袋孔径为3kda，取滞留液，去除打孔树脂吸附过程中加入的硫酸镁，旋蒸浓缩，冷冻干燥。最后得到的酵母菌抑制剂中打碗花活性成分纯度高、抑菌效果好、无溶剂残留、绿色安全。本发明对打碗花活性成分的提取率高，采用的溶剂对人健康无危害，绿色健康，提取效率高，整个制备过程耗费的时间短；成本低廉，操作步骤简单，适合工厂化生产。
6）抗菌活性测试：
a.供试菌株包括：大肠杆菌(escherichiacoliatcc25922)，鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimuriumatcc14028)，金黄色葡萄球菌(staphylpcoccusaureusatcc25923)，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilisatcc21216)，蜡状芽孢杆菌(bacilluscereusatcc10231)，侧孢芽孢杆菌(bacilluslaterosporusatcc64)，黄曲霉（aspergillusflavusatcc204304），黑曲霉（aspergillusnigeratcc16404），根霉（rhizopusoryzaeatcc9363），青霉（pencicilliumcitrinumatcc14994），白色念珠菌(candidaalbicansatcc10231)，啤酒酵母菌（saccharomycescerevisiaeatcc9763）。本测试中的实验菌株由四川大学食品科学与技术四川省重点实验室提供。
b.细菌固体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，其主要组成成分如下：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，琼脂2g，水100ml，灭菌前用浓度2mnaoh调ph值为7.2~7.4。真菌及酵母培养基为土豆培养基，其主要组成成分如下：去皮后的马铃薯200g，蔗糖20g，水1000ml，琼脂20g。
c.抗菌活性测定采用牛津杯法。牛津杯在121℃条件下高压灭菌20min，冷却干燥备用；将受试物用95%甲醇溶液稀释成10mg/ml溶液并用0.22μm细菌滤器过滤除菌备用；将牛津杯放置于已冷却的含菌双碟平板表面，吸取200μl的受试物稀释液分别注入牛津杯中，然后放入37℃培养36h，观察各平板抑菌圈直径大小。每组4个平板，每个平板放置2个牛津杯，重复3次，用游标卡尺测定并记录结果，抑菌圈直径取平均值。
d.测试结果分析：
表1实施例2酵母菌抑制剂抗菌活性结果：
测试浓度为10mg/ml，每个平板注入200μl，每个平板含提取物2mg。用95%甲醇溶解提取物，故采用95%甲醇做阴性对照。10mg/ml青霉素和链霉素分别作为细菌、霉菌及酵母的阳性对照。
由上表可以看出，打碗花提取物对细菌无抑制作用，真菌中除对黑曲霉有抑制作用外，其它几种真菌没有影响；对酵母菌的抑菌作用明显，效果和链霉素差不多。因此，该打碗花提取物可以作为理想的酵母菌抑制剂应用到含高浓度糖分的食品中。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。