一种可可多酚提取以及富集制备方法与流程

本发明涉及一种可可多酚提取以及富集制备的方法，特别涉及到提取工艺以及大孔树脂纯化工艺，属于食品工程技术领域。

背景技术：

可可为梧桐科可可属常绿小乔木，原产于南美洲亚马逊河上游的热带雨林，为湿热地区的典型作物。主要分布在赤道南北纬100以内较为狭窄的地带，17～18世纪传到东南亚。目前，世界上已有60多个国家和地区种植可可，主要产地为委内瑞拉、巴西、加纳等热带地区。可可与茶叶、咖啡并称为世界三大饮料植物。可可被人熟知除了因为其香甜可口,还归功于它的保健功效。研究表明，可可具有抗氧化功能，可以延缓衰老，抑制癌细胞的生长增殖。

多酚类化合物是指分子结构中有若干个酚羟基的植物成分的总称，包括黄酮类、黄烷醇类、单宁类、酚酸类、花青素类以及花色苷类等。可可中的多酚类化合物主要为黄烷醇类，酚酸类、花青素类以及花色苷类。目前已知许多植物中都含有多酚类化合物，例如茶叶、葡萄籽、芒果、银杏、高粱、黑豆、桑葚、槟榔等。可可多酚含量在同类食品当中是较高的。针对如何提取、富集以及制备植物多酚包括可可多酚，近年来已有许多研究。

中国专利申请文献cn1872172a（公开日2006年12月6日）提出了一种可可壳的提取方法，并提供了富可可碱部分或组合物以及富多酚部分或提取物。起始原料为可可壳，具体工艺步骤包括：用丙酮溶液对脱脂可可壳进行提取，提取液除去丙酮并且浓缩。浓缩液过凝胶过滤柱，用水以及甲醇冲洗，分别得到富可可碱以及富多酚提取物。虽然此方法同样得到了可可多酚提取物，但是所用材料如凝胶过滤柱成本较高；且所用溶剂含低毒，无法直接应用于食品，需要去残留；可可多酚的回收率（41%）较低，利用度小；可可多酚的质量百分含量大约为55%。可见，该方法未能获得同时具备高回收率和高含量的多酚。

中国专利申请文献cn105878518a（公开日2016年8月24）提供一种荔枝多酚的分离纯化方法，过程包括提取过程，荔枝粉碎，沸水浸提过滤；滤渣用丙酮在50℃下浸提过滤；合并滤液干燥得到多酚粗提物。纯化过程，将粗提物用乙醇溶解，加入乙酸乙酯萃取两次，乙醇层溶剂蒸干得到纯化提取物。提取物用水溶解后过大孔树脂吸附分离。分离后得到的荔枝多酚中的多酚含量为214g/kg，即荔枝多酚中多酚的质量百分含量为21.4%，处于较低水平。将经粉碎、沸水浸提、过滤处理得到的荔枝滤渣，在70℃下浸提过滤；合并滤液干燥得到多酚粗提物。纯化过程，将粗提物用乙醇溶解，加入乙酸乙酯萃取两次，乙醇层溶剂蒸干得到纯化提取物。提取物用水溶解后过大孔树脂吸附分离。分离后得到的荔枝多酚中的多酚含量为208g/kg，即荔枝多酚中多酚的质量百分含量为20.8%。并且，随着温度升高，多酚的质量百分含量出现下降趋势。

中国专利申请文献cn105998109a（公开日2016年10月12日）公开了一种芒果核多酚提取物及其制备方法。工艺步骤包括：将芒果核粉碎，用乙醇-水溶剂对原料进行提取，提取液浓缩干燥，再次用乙醇-水溶解，过滤得到上样溶液。取非极性或弱极性大孔吸附树脂，将上样溶液上样，先用水洗去杂质，然后用洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液。将洗脱液浓缩干燥得到产品。产品中多酚的含量为10–20g/kg，即产品中多酚的质量百分含量为1–2%，处于极低水平。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种可可多酚提取以及富集制备方法，可同时获得较高的多酚回收率和含量。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：本发明可可多酚提取以及富集制备方法包括如下步骤：

（1）将可可原料粉碎；

（2）用乙醇-水溶液作为提取液将粉碎后的可可原料浸没，加热至70–85℃进行提取，提取完毕后除去提取液中的乙醇；

（3）将提取液静置过滤，取滤液加水稀释，离心去除滤液中的不溶物，得到上样液；

（4）将上样液上样至已预处理的大孔树脂，采用梯度法洗脱大孔树脂，并收集洗脱液；

（5）将洗脱液进行干燥处理，得到富集的可可多酚。

进一步地，本发明所述步骤（2）中，可可原料与提取液的料液比为1:5-30。

进一步地，本发明所述步骤（1）中的可可原料为发酵或未发酵的可可豆和/或可可壳。

进一步地，本发明所述步骤（1）中的可可原料为烘烤或未烘烤的可可豆或可可壳。

进一步地，本发明在步骤（2）中，所述乙醇-水溶液中的乙醇的体积百分含量为20%-70%。

进一步地，本发明所述乙醇-水溶液中的乙醇的体积百分含量为40%-50%。

进一步地，本发明在所述步骤（2）中，提取时间为1h–3h。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

现有技术公开的技术方案在提取多酚时，均未能获得同时具备高回收率和高含量的多酚。中国专利申请文献cn105878518a表明，在使用乙醇-水溶剂作提取液时，提取温度越高，其得到的芒果多酚含量越低。而本发明采用乙醇-水溶剂作为提取液，并且将提取温度设置在70-85℃高温状态下，不仅未使可可多酚提取物中可可多酚的回收率及其含量降低，反而大大地提高可可多酚的回收率及其含量，使得可可多酚提取物中可可多酚的回收率达到70%以上，质量百分含量达到50-70%，取得意料不到的技术效果。

此外，本发明以乙醇-水溶剂为体系，基本没有毒性；并且溶剂可以回收利用，节约成本且对环境污染小；整个工艺流程简单，适合工业放大。

附图说明

图1是本发明方法得到的可可提取物的rp-hplc图谱；

图2是表儿茶素标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，但是本发明不限于所给出的例子。

在以下实施例中，hplc检测条件和总多酚测定方法如下：

hplc检测条件：色谱柱为phenomenexlunac18100acolumn(250mm×4.6mm,5μm)，采用梯度洗脱检测样品。流动相a为80%乙腈，流动相b为纯水含有0.5%甲酸。梯度为：0–20min，15%a–22%a；20–25min，22%a–25%a；25–35min，25%a–35%a；35–40min，35%a–15%a。波长280nm，流速1.0ml/min。样品进行hplc分析之前过0.45μm有机滤膜，定量环为20μl。每个样品进样两次，柱温为30℃。如图1所示，出峰顺序为：可可碱（5–6min），咖啡因（11–12min），表儿茶素（16–18min）。

总多酚测定方法：采用folin–ciocalteu方法进行总多酚检测。具体为：将待测可可多酚提取物用水稀释10倍，分别取0.2ml，0.4ml于比色管中。分别加入2ml10%na2co3溶液及1ml福林酚试剂，用蒸馏水定容至25ml。充分摇匀后，80℃加热15min，设置紫外分光光度计波长为735nm，进行测定。采用不同浓度的表儿茶素（ec）标准溶液（0.66,1.31,1.97,2.62and3.28μg/ml）绘制标准曲线，如图2所示，得到线性回归方程：y=0.1056x–0.0019，r²=0.9975。其中，y表示吸光值a，x表示表儿茶素浓度（μg/ml），r²是线性回归的相关系数。

实施例1：

可可多酚的提取：将100.0g未发酵、未烘烤的可可豆粉碎。按照料液比1:5向粉碎后的可可豆中加入20%乙醇溶液，加热至70℃搅拌浸提1h，重复提取2次，合并提取液。将提取液减压浓缩去除溶剂乙醇，加水稀释至浓度为6mg/ml上样液，离心去除滤液中的不溶物。

上样吸附：将预处理完毕的lx–17大孔树脂用纯水冲洗3bv（柱床体积，下同），加入可可豆上样液，上样速度为1.6bv/h，进行吸附。上样完毕后，用纯水冲洗柱子2bv。收集流出液以及纯水洗脱液。

梯度洗脱：lx–17树脂上样吸附完毕后，分别按顺序用10%乙醇溶液洗脱3bv、50%乙醇溶液洗脱5bv、90%乙醇溶液洗脱2bv，洗脱速度为2bv/h。分别收集洗脱液，取样品进行hplc分析。得到与图1相似的出峰顺序（峰面积不同）的rp-hplc图谱，出峰顺序为可可碱（5–6min），咖啡因（11–12min），表儿茶素（16–18min）。按照峰面积计算各物质含量。富集的可可多酚中得到可可碱的质量百分含量为0.56%，咖啡因的质量百分含量为0.86%，表儿茶素的质量百分含量为1.68%。

干燥：将50%乙醇洗脱液减压浓缩干燥后得到富集的可可多酚提取物，取样品进行总多酚含量测定，根据如图2所示的标准曲线方程计算多酚的质量百分含量。得到5.39g富集的可可多酚提取物。在得到的富集的可可多酚中，多酚的质量百分含量为50.39%；回收率为71.50%。

实施例2：

可可多酚的提取：将100.0g未发酵、未烘烤的可可豆粉碎。按照料液比1:30向粉碎后的可可豆中加入70%乙醇溶液，加热至75℃搅拌浸提3h，重复提取3次，合并提取液。将提取液减压浓缩去除溶剂乙醇，加水稀释至浓度为6mg/ml上样液，离心去除滤液中的不溶物。

上样吸附：将预处理完毕的lx–17大孔树脂用纯水冲洗3bv，加入可可豆上样液，上样速度为1.6bv/h，进行吸附。上样完毕后，用纯水冲洗柱子1bv。收集流出液以及纯水洗脱液。

梯度洗脱：lx–17树脂上样吸附完毕后，分别按顺序用10%乙醇溶液洗脱5bv、50%乙醇溶液洗脱8bv、90%乙醇溶液洗脱4bv，洗脱速度为2bv/h。分别收集洗脱液，取样品进行hplc分析。得到与图1相似的出峰顺序（峰面积不同）的rp-hplc图谱，出峰顺序为可可碱（5–6min），咖啡因（11–12min），表儿茶素（16–18min）。按照峰面积计算各物质含量。富集的可可多酚中得到可可碱的质量百分含量为0.77%，咖啡因的质量百分含量为1.13%，表儿茶素的质量百分含量为5.94%。

干燥：将50%乙醇洗脱液减压浓缩干燥后得到富集的可可多酚提取物，取样品进行总多酚含量测定，根据如图2所示的标准曲线方程计算多酚的质量百分含量。得到5.18g富集的可可多酚提取物。在得到的富集的可可多酚中，多酚的质量百分含量为51.21%；回收率为74.36%。

实施例3：

可可多酚的提取：将2.0kg未发酵未烘烤的可可壳粉碎。按照料液比1:10向粉碎后的可可壳中加入50%乙醇溶液，加热至80℃搅拌浸提1.5h，重复提取3次，合并提取液。将提取液减压浓缩去除溶剂乙醇，加水稀释至浓度为6mg/ml上样液，离心去除滤液中的不溶物。

上样吸附：将预处理完毕的lx–17大孔树脂用纯水冲洗2bv，加入可可壳上样液，上样速度为1.6bv/h，进行吸附。上样完毕后，用纯水冲洗柱子2bv。收集流出液以及纯水洗脱液。

梯度洗脱：lx–17树脂上样吸附完毕后，分别按顺序用10%乙醇溶液洗脱4bv，50%乙醇溶液洗脱6bv，90%乙醇溶液洗脱3bv，洗脱速度为2bv/h。分别收集洗脱液，取样品进行hplc分析。得到与图1相似的出峰顺序（峰面积不同）的rp-hplc图谱，出峰顺序为可可碱（5–6min），咖啡因（11–12min），表儿茶素（16–18min）。按照峰面积计算各物质含量。富集的可可多酚中得到可可碱的质量百分含量为1.87%，咖啡因的质量百分含量为1.86%，表儿茶素的质量百分含量为1.94%。

干燥：将50%乙醇洗脱液减压浓缩干燥后得到富集的可可多酚提取物，取样品进行总多酚含量测定，根据如图2所示的标准曲线方程计算多酚的质量百分含量。得到55.66g富集的可可多酚提取物。富集的可可多酚中，多酚的质量百分含量为62.87%，回收率为78.57%。

实施例4：

可可多酚的提取：将2.0kg未发酵未烘烤的可可壳粉碎。按照料液比1:20向粉碎后的可可壳中加入40%乙醇溶液，加热至85℃搅拌浸提1.5h，重复提取2次，合并提取液。将提取液减压浓缩去除溶剂乙醇，加水稀释至浓度为6mg/ml上样液，离心去除滤液中的不溶物。

上样吸附：将预处理完毕的lx–17大孔树脂用纯水冲洗1bv，加入可可壳上样液，上样速度为1.6bv/h，进行吸附。上样完毕后，用纯水冲洗柱子1bv。收集流出液以及纯水洗脱液。

梯度洗脱：lx–17树脂上样吸附完毕后，分别按顺序用10%乙醇溶液洗脱3bv，50%乙醇溶液洗脱7bv，90%乙醇溶液洗脱2bv，洗脱速度为2bv/h。分别收集洗脱液，取样品进行hplc分析。得到与图1相似的出峰顺序（峰面积不同）的rp-hplc图谱，出峰顺序为可可碱（5–6min），咖啡因（11–12min），表儿茶素（16–18min）。按照峰面积计算各物质含量。富集的可可多酚中得到可可碱的质量百分含量为2.61%，咖啡因的质量百分含量为1.76%，表儿茶素的质量百分含量为1.14%。

干燥：将50%乙醇洗脱液减压浓缩干燥后得到富集的可可多酚提取物，取样品进行总多酚含量测定，根据如图2所示的标准曲线方程计算多酚的质量百分含量。得到59.21g富集的可可多酚提取物。富集的可可多酚中，多酚的质量百分含量为58.11%，回收率为75.09%。