一种复合酵素饮料的制备方法及复合酵素饮料与流程

【技术领域】

本发明属于食品饮料技术领域，尤其涉及一种复合酵素饮料的制备方法及复合酵素饮料。

背景技术：

以果蔬为原料制备酵素饮料的过程能够促进果蔬原料中碳水化合物、蛋白质、脂类等物质的代谢反应，大量产生和积累的初级及次级代谢产物，生成有机酸、低聚糖、糖醇、酶类、低聚肽。多酚等多种有益成分可以促进肠道有益菌的增殖、抑制有害菌的繁殖及腐败物质的形成，起到调节肠道菌群平衡、增强免疫、促进睡眠、延缓衰老等作用，对人体有多种有益功效。因而利用天然果蔬制备酵素饮料或果蔬汁发酵饮料因其营养保健功能和独特的风味深受广大消费者青睐。

目前国内以果蔬为原料制备酵素饮料多采用单一的果蔬进行发酵例如公开号为“cn102356899a”的发明专利公开一种用单一木瓜制备木瓜酵素或采用单一菌种或复合菌种进行单步发酵；公开号为“cn102018259a”的发明专利公开一种采用青稞红曲单步发酵虫草酵素饮料；公开号为“cn101341995a”的发明专利公开一种采用植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌混合单步发酵蔬菜汁的饮料，上述专利均存在发酵时间短，发酵过程简单的缺点，采用单一果蔬进行发酵，不能满足人体对酵素在健康和营养功效方面的需求，且其中的不溶性膳食纤维不易分解被人体消化。

技术实现要素：

为解决现有技术的酵素饮料多采用单一的果蔬进行发酵，不能满足人体对酵素在健康和营养功效方面的需求的问题，本发明提供一种复合酵素饮料的制备方法，采用糙米等谷物及特色果蔬为主原料，利用酵母菌、醋酸菌和乳酸菌进行3步发酵，在制作过程的不同阶段，采用不同菌种分步发酵，以满足人体对酵素在健康和营养功效方面的需求，发酵过程除了保留果蔬的维生素矿物质等外，特别是粗粮经过发酵后，能使其中的不溶性膳食纤维分解成容易被人体消化，具有营养丰富和风味独特的特点。

本发明另一目的是提供一种复合酵素饮料。

本发明为解决其技术问题所采用的技术方案：

一种复合酵素饮料的制备方法，包括以下步骤：

(1)原料处理：将谷物浸渍后按比例加水磨浆，制成原液；

(2)往原液中添加α-淀粉酶,对原液进行液化；

(3)往液化后的原液添加β-淀粉酶进行糖化；

(4)往糖化后的原液添加酵母菌，进行酵母菌发酵，制成酒精发酵液；

(5)对酒精发酵液进行醋酸发酵，当醋酸含量不再上升的时候停止醋酸发酵，制成醋酸发酵液；

(6)往醋酸发酵液中加入果蔬原料和乳酸菌，进行乳酸发酵，制成乳酸发酵液。

优选地，所述谷物包括糙米、燕麦和玉米，设定原液的ph值范围6.0-7.0。

优选地，步骤(3)中糖化时，β-淀粉酶的加酶量为6u/g,糖化温度为40℃，糖化时间为40min，同时设定原液的ph为4.5。

优选地，步骤(4)中酵母菌发酵时，酵母用量为9％，发酵时间为2h，发酵温度为35℃，gsh含量为2.73mg/g。

优选地，步骤(5)中醋酸发酵时，选取醋酸菌沪酿1.01作为出发菌株，醋酸发酵时间设为84h。

优选地，所述果蔬原料包括火龙果、木瓜、芒果、菠萝及番茄浆。

优选地，所述乳酸菌选用保加利亚乳酸菌和嗜热链球菌。

优选地，所述乳酸菌发酵时，乳酸用量为8％，发酵温度为40℃，发酵时间为35h，gsh含量为3.25mg/g。

优选地，步骤(6)之后还包括一调配过程，往所述乳酸发酵液添加甜味剂。

与现有技术相比，本发明有如下优点：

1、本发明采用糙米等谷物及果蔬为主原料，利用酵母菌、醋酸菌和乳酸菌进行3步发酵，在制作过程的不同阶段，采用不同菌种分步发酵，以满足人体对酵素在健康和营养功效方面的需求，发酵过程除了保留果蔬的维生素矿物质等外，特别是粗粮经过发酵后，能使其中的不溶性膳食纤维分解成容易被人体消化，具有营养丰富和风味独特的特点；

2、本发明可确定出酵素饮料生产的最佳工艺条件，生产出酸甜可口的复合酵素饮料，并能阐明影响功能的主要物质，本发明可推动水果加工业发展，提高酵素饮料生产的工艺技术水平，还可为生产提供专用菌种与工艺，增加产品品种，拓宽销售领域，满足消费市场的需求；

3、本发明酵素饮料的研制开发,符合国内外食品向功能化方向发展的趋势,具有很大的市场潜力，充分利用谷物和果蔬资源开发酵素产品的生产,既符合国家的产业政策,又部分解决了当地鲜果的销售问题，具有很高的社会效益和经济效益；

4、本发明通过粮谷及特色果蔬的发酵，每年可以消耗大量的果蔬，这对解除果农卖果难题，减少因水果滞销和腐烂带来的经济损失，为农民增收开创了一条新路。

【附图说明】

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的工艺流程图；

图2是本发明淀粉含量测定的变化示意图；

图3是本发明ph值对α-淀粉酶活性的影响的变化示意图；

图4是本发明原料糊化时加酶量对de值的影响的变化示意图；

图5是本发明大米糊化时温度对de值的影响的变化示意图；

图6是本发明大米糊化时酶解时间对de值的影响的变化示意图；

图7是本发明大米糊化时加水量对de值的影响的变化示意图；

图8是本发明的醋酸菌产酸能力的比较示意图；

图9是本发明醋酸发酵过程中酸度和酒度的变化过程示意图。

【具体实施方式】

下面将结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。

请参看附图1，一种复合酵素饮料的制备方法，包括以下步骤：

(1)原料处理：将重量相等的糙米、燕麦、玉米混合浸渍后按比例加水磨浆，制成原液，同时设定原液的ph值范围6.0-7.0，本实施例中将ph调节为6.5；

(2)往原液中添加α-淀粉酶,对原液进行液化，同时设定α-淀粉酶的加酶量为10u/g,液化温度为80℃，液化时间为30min，料水比为1∶4；本步骤具体实施过程如下：

液化所需材料及仪器

hh-4恒温水浴锅威尔仪器有限公司；hc-tph-5电子天平上海分析仪器厂；722s型分光光度计上海分析仪器厂；α-淀粉酶(2×10⁴u/g)奥博星生物技术有限责任公司，碘、碘化钾等均为分析纯；糙米、燕麦、玉米等均购自中山市太阳城沃尔玛超市。

实验方法

1.1淀粉标准曲线确定

用分析天平准确称取1.000g分析纯淀粉,加入5.0ml蒸馏水制成匀浆,逐渐倒入90ml左右沸腾的蒸馏水中,边倒边搅拌,即得澄清透明的糊化淀粉溶液,置100ml容量瓶中,用少量蒸馏水冲洗烧杯,定容,此淀粉溶液浓度为10mg/ml(a液)。吸取a液2.0ml置100ml容量瓶,定容,此时淀粉浓度为200ug/ml(b液)。取具塞刻度试管8支,分别加入标准淀粉溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0ml,及i-ki溶液2ml,再加蒸馏水使每支试管溶液补足到10ml,摇匀,使蓝色溶液稳定10min后,在722分光光度计660nm波长处测其消光值。以消光值为纵坐标,已知淀粉溶液的浓度为横坐标绘制标准曲线，请参看附图2，该图为经实验测得淀粉含量测定的变化示意图。根据该图得到标准曲线方程为：

y＝0.089x+0.0630相关系数r²＝0.9962。

1.2原料糊化液中淀粉的测定

吸取样品液2.0ml,置100ml容量瓶中,用蒸馏水定容,混匀。准淮确吸取2ml样品溶液(吸取量依样品中淀粉浓度而变),置15ml具塞刻度试管,加入i-ki溶液0.2ml,直至溶液呈现透明蓝色,用蒸馏水补足到10ml,混匀,静置10min,于660nm波长处测定消光值由标准曲线查出样品中淀粉含量(g/100g)。

1.3大米糊化液总糖含量的测定

国家标准gb9695.31-1991。

1.4de值计算

de＝总糖/淀粉

最佳工艺条件的确定：以加酶量、温度、时间、料水比这四个因素进行单因素试验,确定正交试验的水平。根据单因素结果,采用l9(3)⁴进行正交实验设计,对结果进行分析并确定最佳酶解效果。

1.5酶解单因素实验结果

1.5.1a-淀粉酶最佳ph值测定

分别配置ph为4、5、6、7、8、9、10的缓冲溶液然后测定a-淀粉酶的活性。

a－淀粉酶活力的测定：利用淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活性有关，可通过固定反应后的吸光度(660nm)计算酶活力，酶活力定义:1g固体酶粉或1ml酶液于60度，ph6.0条件下1h液化1g可溶性淀粉即为1个酶活力单位。请参看附图3，该图为经实验测得ph值对α-淀粉酶活性的影响的变化示意图，根据该图可看出a－淀粉酶活的最适ph为6.0－7.0之间。

1.5.2加酶量对原料糊化的影响研究

80℃、30min、1∶3料水比,以淀粉含量为指标,研究加酶量5u/g、10u/g、15u/g、20u/g、25u/g、30u/g时de值的变化情况确定最佳加酶量范围。请参看附图4，该图为经实验测得加酶量对de值的影响的变化示意图，由该图可看出，当酶添加量增加时,糊化液中的淀粉含量降低明显,糖度的增加明显。当加酶量达到20u/g后,糊化趋于缓和,且糊化液产生较多泡沫,对生产不利,综合以上,选用加酶量5～15u/g为最佳加酶量范围。

1.5.3温度对大米糊化的影响研究

加酶量为10u/g、30min、1∶3料水比,以淀粉含量为指标,研究60℃、70℃、80℃、90℃、100℃条件下淀粉含量,含糖量，de值的变化情况,确定最佳酶解温度。

酶的活性受温度的限制,当温度在最佳条件时,酶解效果最好。请参看附图5，该图为经实验测得温度对de值的影响的变化示意图，由该图可看出，随着温度的升高,耐热淀粉酶活性也增加,从而淀粉含量剧烈下降,总糖含量迅速上升。温度达到80℃时酶解效果最好,而后de增加趋于平缓,所以选择80℃温度范围进行正交实验。

1.5.4时间对大米糊化的影响研究

按照反应液设定80℃、加酶10u/g、1∶3料水比,以淀粉含量为指标,研究10min、20min、30min、40min、50min条件下淀粉含量,含糖量,de值变化情况,确定最佳酶解时间。

蒸煮时间越长,酶作用于底物的机会越大,因而对淀粉的分解效果也越好。请参看附图6，该图为经实验测得酶解时间对de值的影响的变化示意图，由该图分析可知，随着时间的增加，de值增加明显,当40min后趋于平缓,所以选择时间在20min、30min、40min范围进行正交实验。

1.5.5料水比对大米糊化的影响研究

80℃、30min、10u/g加酶量,以淀粉含量为指标,研究料水比1∶2、1∶3、1∶4、1∶5时de值的变化情况,确定最佳料水比范围。

适当的料水比,淀粉酶与底物接触机会增加,酶解效果较好,当物料含水量很高时,这种接触的机会会明显较小,因而酶解效果减弱。请参看附图7，该图为经实验测得加水量对de值的影响的变化示意图，由该图分析可知，在1∶2、1∶3、1∶4时糊化效果最佳,因此选择这三个水平进行正交实验。

α-淀粉酶发酵条件的确定

表1α-淀粉酶发酵条件的因素水平表

按照表1，设计的正交实验结果如表2,α-淀粉酶发酵条件正交实验结果表

表2α-淀粉酶发酵条件正交实验结果表

从表2中可以看出最佳糊化条件为a2b2c2d3组合。即为加酶量为10u/g,温度为80℃,作用时间为是30min,最佳的料水比为1∶4。从表还可以看出各因素对结果的影响次序为:c>b>a>d，即糊化的时间和温度是影响最大的因素。加酶量和料水比影响较小。

(3)往液化后的原液添加β-淀粉酶进行糖化，同时设定β-淀粉酶的加酶量为6u/g,糖化温度为40℃，糖化时间为40min，原液的ph为4.5；本步骤具体实施过程如下：

糖化选用的β-淀粉酶由天津酶制剂厂提供，活力为9万u/g。活力测定方法为：为:标准条件下作用1％的可溶性淀粉,每分钟生成lmg麦芽糖的酶活为一个活力单位。

β-淀粉酶发酵条件的确定

表3β-淀粉酶发酵条件的因素水平表

按照表3，设计的正交实验结果如表4,β-淀粉酶发酵条件正交实验结果表

表4β-淀粉酶发酵条件正交实验结果表

从表4中可以看出最佳糖化化条件为a2b2c2d2组合。即为加酶量为6u/g,温度为40℃,作用时间为是40min,最佳的ph为4.5。

原料经过糊化和糖化处理后，提高了原料的利用率,降低了成本,可以提高企业厂家的利润。

(4)往糖化后的原液添加酵母菌，进行酵母菌发酵，同时设定酵母用量为9％，发酵时间为2h，发酵温度为35℃，gsh含量为2.73mg/g，制成酒精发酵液；本步骤具体实施过程如下：

所需材料：酵母菌包括安琪高活性干酵母。

仪器设备：电热鼓风干燥箱、培养箱、可见分光光度计、离心机、谷胱甘肽试剂盒、真空包装机。

方法：

还原型谷胱甘肽(gsh)的测定：谷胱甘肽试剂盒法。

还原型谷胱甘肽(gsh)是一种具有重要生理功能的活性生物肽,以功能活性物质—谷胱甘肽为指标,进行四因素三水平正交试验,最终确定出酵母用量、发酵时间及发酵温度。

酵母最佳发酵条件的确定

将液化糖化反应后的粮谷转入发酵容器，按设定的条件进行实验，当酒精度约为10％的停止发酵。结果如下：

还原型谷胱甘肽(gsh)是一种具有重要生理功能的活性生物肽,以功能活性物质———谷胱甘肽为指标,进行四因素三水平正交试验。

表5酵母发酵条件的因素水平表

按照表5，设计的正交实验结果如表6,酵母发酵条件的正交实验表

表6酵母发酵条件的正交实验表

还原型谷胱甘肽(gsh)是一种具有重要生理功能的活性生物肽,以功能活性物质———谷胱甘肽为指标,由表6可以判断出各因素对产品中谷胱甘肽含量影响的主次顺序为:a>b>c,即酵母用量>发酵时间>发酵温度。最优组合为a3b1c3,即当酵母用量为9％,发酵时间为2h、发酵温度为35℃时,糙米酵素中的谷胱甘肽含量最高,达到2.73mg/g。

(5)对酒精发酵液进行醋酸发酵，选取醋酸菌沪酿1.01作为出发菌株，醋酸发酵时间设为84h，当醋酸含量不再上升的时候停止醋酸发酵，制成醋酸发酵液；本步骤具体实施过程如下：

醋酸发酵

醋酸菌的筛选和驯化培养

将醋酸菌沪酿1.01、、沈麦112-7#、巴氏醋杆菌as1.41接种于产酸试验培养基ⅰ，30℃120rpm培养6天，测其总酸含量；实验结果请参看附图8，该图为经实验测得醋酸菌产酸能力的比较示意图，由该图可知，醋酸菌沪酿1.01产酸量最大，达到3.51％；其次是as1.41,总产酸量为3.32％.沈麦112-7#和巴氏醋杆菌都较小。因此可以判断醋酸菌沪酿1.01在高酒精浓度下的产酸能力最强，所以选择醋酸菌沪酿1.01作为出发菌株。

醋酸菌的驯化培养：选用沪酿1.01醋酸菌为出发菌株，将10g葡萄糖、2g酵母膏，4ml大豆多肽溶液分别溶解于200ml的蒸馏水中，分装于2个三角瓶中，在121℃灭菌30min，冷却至30℃，在无菌条件下每瓶加入4ml95％的酒精，并接入沪酿1.01醋酸菌种，在29℃一30℃振荡培养18h～24h，得到纯培醋酸菌种子液；醋酸菌的驯化培养，在灭菌后的复合果清汁中接入5.0％的专用酵母驯化培养液，在28℃～30℃培养72h，发酵醪的酒精度达5％左右，然后接种5％的醋酸菌种子液，在29℃～31℃培养7d，得到醋酸菌第1代驯化种子液，然后以同样的方法经第2、3、4、5代培养后，所得醋酸菌能较好地在苹果汁酒精发酵液中生长繁殖，该菌种即可作为果醋醋酸发酵专用菌种使用，保藏用。

醋酸菌试管斜面培养基：酵母膏1％，葡萄糖1％，营养琼脂3.3％，碳酸钙2％，(95％)乙醇3％。按实际需要配置培养基，放入灭菌锅中灭菌(121℃、30min)，灭菌后摆成斜面备用。斜面菌种应于30℃培养72h。

醋酸菌三角瓶扩培培养基：酵母膏1％，葡萄糖1％，(95％)酒精3％。按实际需要配置培养基，分装到三角瓶中灭菌(121℃、30min)，冷却后备用。

醋酸菌一、二级种子培养基：90℃灭菌30min后的复合果汁酒精发酵醪液。接种量为10％。

反应液在醋酸发酵过程中的酒度和酸度变化请参看附图9，发酵前期,酸量变化不大，增长缓慢，这可能与初始的高酒精度对醋酸菌的抑制作用有关，48至84小时内的发酵中期由于醋酸菌活力提高,发酵速度快,产酸快,酵后期,酒度和酸度趋于一个稳定值，这与发酵后期的高酸度对醋酸菌抑制有关，随酒精降低酸度升高，醋酸发酵强度减弱。在发酵84小时时酸度达到4.3g/100ml，继续延长发酵时间,醋酸含量反而会下降，因此84小时为最佳醋酸发酵时间。

(6)往醋酸发酵液中加入按重量相等的火龙果、木瓜、芒果、菠萝、番茄浆和比例为1∶1的保加利亚乳酸菌和嗜热链球菌，进行乳酸发酵，同时设定乳酸用量为8％，发酵温度为40℃，发酵时间为35h，gsh含量为3.25mg/g，制成乳酸发酵液；本步骤具体实施过程如下：

乳酸发酵所需仪器：胶体磨、恒温箱、高压灭菌锅、电炉、天平、压盖机、水浴锅。

以功能活性物质—谷胱甘肽为指标,在酵母发酵液中加入果蔬汁后进行三因素三水平正交试验,优化出乳酸菌发酵条件即乳酸菌用量、发酵时间、发酵温度。乳酸菌发酵代谢产物能减轻胃酸分泌,抑制肠内腐败菌,对肠壁神经有良好的刺激作用,能促进人体消化酶的分泌和肠道的蠕动,从而促进食物的消化吸收,并预防便泌。同时,乳酸菌菌体在体内被分解后,其有效成分被机体吸收后,能增强人体免疫力。此外,乳酸菌还能分泌抑制内生病原菌的抗菌素,如保加利亚乳杆菌素等有明显的杀菌效果。

操作要点

菌种活化

由于保藏条件抑制了菌体的代谢和繁殖,使菌种的活力很弱,因此,使用前必须进行活化。活化采用脱脂奶粉中注入9倍的热水溶解,然后分装在洗净的试管里置于高压杀菌锅中杀菌,制成培养基,再将乳酸菌在培养基中进行3或4次传代培养。当ph值为4.0～4.2,活菌数在106以上,乳酸酸度在0.8％～1.0％时菌种可达正常活力,而后置于冰箱保存备用。

表7乳酸发酵条件的因素水平表

按照表7，设计的正交实验结果如表8,乳酸发酵的正交实验结果表

表8乳酸发酵的正交实验结果表

由表8可看出最优组合为a3b1c3,即当乳酸用量为8％,、发酵温度为40℃时,发酵时间为35h，酵素中的谷胱甘肽含量最高,达到3.25mg/g。

从以上表5-7可以看出，经过糖化处理后的原料经酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的发酵，使最终发酵产品中的生理功能的活性生物肽-还原型谷胱甘肽(gsh)的含量达到了最高，赋予了产品的特殊功能性。

(7)灭菌、均质、浓缩、调配：乳酸发酵液经过均质浓缩后添加糖醇、半乳糖等甜味剂进行优化调配，使产品酸甜可口；发酵出来的液体含有醋酸和乳酸，此外还含有微量的苹果酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸等有机酸。由于醋酸具有极强的刺激味，即使经过陈酿后也不宜直接饮用。因此本实验加入一定量的甜味剂，来缓和醋酸的刺激味，使口味更加柔和，协调自然。本步骤具体实施过程如下：

酵素饮料的调配

表9酵素饮料配方与水平设置表

按照表9，设计的正交实验结果如表10,酵素饮料配方正交实验表

表10酵素饮料配方正交实验表

由表10分析结果可得到苹果醋的最优配方组合为a3b2c2d3,即发酵液体基料的添加量为250ml/l，半乳糖为2％,蜂蜜添加量为2％，果葡糖浆添加量6‰

经过实验调配后所得的酵素饮料产品色泽均匀、发酵的香气浓郁、酸甜适口，功能成分谷胱甘肽含量≥2.00mg/g。谷胱甘肽具有清除人体细胞内的自由基,可以与人体内的有毒物质结合并排出体外等功能，是人体内重要的抗氧化剂、解毒剂及增强人体免疫功能的生理活性物质，因此利用本发明技术生产出的功能性的酵素饮料,符合国内外食品向功能化方向发展的趋势,具有很大的市场潜力及很高的社会效益和经济效益。

(8)灌装、成品。

一种复合酵素饮料，该复合酵素饮料由上述的复合酵素饮料的制备方法制成。该酵素饮料产品色泽均匀、无杂质；气味：有发酵香气、无异味；酸度：酸甜适口。组织形态：状态均匀、无杂质；杂质：无肉眼可见的外来杂质；谷胱甘肽约为3.25mg/g。

本发明提供的复合酵素饮料的制备方法，采用糙米等谷物及果蔬为主原料，利用酵母菌、醋酸菌和乳酸菌进行3步发酵，在制作过程的不同阶段，采用不同菌种分步发酵，以满足人体对酵素在健康和营养功效方面的需求，发酵过程除了保留果蔬的维生素矿物质等外，特别是粗粮经过发酵后，能使其中的不溶性膳食纤维分解成容易被人体消化，具有营养丰富和风味独特的特点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明实施的范围，其他凡其原理和基本结构与本发明相同或近似的，均在本发明的保护范围之内。