本发明属于饲料和纳米材料技术领域，具体涉及一种高抗菌纳米饲料添加剂及其制备方法。
背景技术：
在现代畜牧业集约化、大型化、机械化的饲养管理条件下，动物饲养的生态环境恶化、疫病感染、营养缺乏等问题相继出现，传统的防治方法如将抗生素类生长促进剂、高铜、高锌制剂等用作饲料添加剂，不仅促进了动物生产性能的充分发挥，而且预防了病菌感染，极大地提高了养殖业的经济效益，迄今为止，抗生素添加剂仍是全球饲料添加剂销售额中所占比例最大的一类添加剂。但抗生素的滥用已经给动物本身、畜产品和环境等带来了一系列的不利影响，如使病原菌产生耐药性、降低机体免疫功能、易产生致病菌的交叉感染以及抗生素在机体内大量残留等；其次，高铜、高锌制剂的不规范使用易导致动物机体中毒、环境污染和资源浪费等副效应。近年来，人们越来越关注食品安全、饲料安全和细菌的耐药性等问题，欧盟从2006年开始全面禁止在动物饲料中添加抗生素，我国和其他一些国家也先后逐渐限制抗生素作为饲料添加剂。因此，绿色、安全、功能性饲料添加剂的研发应用意义重大。
纳米材料是指在三维空间中至少有一个维度处于纳米尺度范围(1～100nm)或由它们作为基本组成单元构成的材料。纳米空间是介于宏观和微观之间的相对独立的中间领域。纳米粒子具有小尺寸效应、表面与界面效应、量子尺寸效应以及宏观量子隧道效应，使得纳米粒子具有常规粒子所不具备的许多特殊性质。研究表明，金属纳米粒子如银、锌、铜等具有良好的抗菌性。其中，纳米银抗菌剂性能优异，但银是贵金属，应用成本较高，且ag+能与水介质中的cl-、hs-、s2-及so42-等多种阴离子发生反应，形成不溶于水的agcl和ag2s，从而失去抗菌活性。与纳米银相比，纳米铜和纳米锌成本较低，杀菌效果仅次于纳米银，且具有较高的化学稳定性和环境安全性，其次，铜和锌是人体必须的微量元素，对人体危害较小，在饲料领域具有广阔的应用前景。由于我国纳米抗菌材料研究起步晚，基础薄弱，应用研究滞后，技术不完备，因此，技术源头的应用基础研究领域创新具有重要的经济和社会价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于，针对现有技术的不足，提供一种高抗菌纳米饲料添加剂，该饲料添加剂不仅可以预防和治疗病菌感染，增强机体免疫功能和抗应激功能，还能有效促进动物生长，提高饲料利用率，且不产生耐药性，是一种绿色、安全的功能性饲料添加剂。
本发明的另一个目的是提供一种高抗菌纳米饲料添加剂的制备工艺，该饲料添加剂制备工艺简单，生产成本较低，具有重要的经济和社会意义，发展前景广阔。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种高抗菌纳米饲料添加剂，包括下述原料：纳米铜、纳米氧化锌，其中，纳米铜与纳米氧化锌重量比为1：1～6。
优选地，一种高抗菌纳米饲料添加剂，包括下述原料：纳米铜、纳米氧化锌，其中，纳米铜与纳米氧化锌重量比为1：1～3。
一种高抗菌纳米饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：
a、纳米铜的制备
(1)分别配置硝酸铜溶液和抗坏血酸溶液；
(2)称取一定量聚乙烯吡咯烷酮，将其溶于硝酸铜溶液中，在磁力搅拌作用下水浴加热至30～70℃；
(3)向步骤(2)所得溶液中加入抗坏血酸溶液，混合均匀，置于超声反应器中反应一段时间后，逐渐冷却至室温；
(4)将冷却的溶液用乙醇稀释，10000r/min，离心10min，去除上层清液，此过程重复3次；
(5)将步骤(4)所得产物于室温下真空干燥24h，即得纳米铜颗粒；
b、纳米氧化锌的制备
(1)称取一定量的硝酸锌溶于去离子水中，配置一定浓度的硝酸锌溶液；
(2)将蔗糖酯加入到步骤(1)所得硝酸锌溶液中进行分散溶解，配制成蔗糖酯-硝酸锌溶液；
(3)将步骤(2)所得溶液逐滴加入到氢氧化钠溶液中，电动搅拌30～90min，溶液有白色浑浊生成；
(4)将步骤(3)生成的白色浑浊液转移到超声反应器中进行超声反应；
(5)将步骤(4)所得反应混合液在4000r/min下离心分离10min，去除上层清液，产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤3次；
(6)将步骤(5)所得产物置于60℃真空干燥箱中干燥12h，即得纳米氧化锌颗粒；
c、高抗菌纳米饲料添加剂的制备
将步骤a所得纳米铜与步骤b所得纳米氧化锌按一定重量比混合均匀，既得本发明所述高抗菌纳米饲料添加剂。
优选地，所述步骤a中，步骤(1)硝酸铜溶液浓度为0.06～0.35mol/l；抗坏血酸溶液浓度为0.5～1.5mol/l，溶剂为乙醇。
优选地，所述步骤a中，步骤(2)硝酸铜与聚乙烯吡咯烷酮摩尔比为1：1～1：30；步骤(3)硝酸铜与抗坏血酸摩尔比为1：1～1：3。
优选地，所述步骤a中，步骤(3)超声反应时间为10～40min。
优选地，所述步骤b中，步骤(1)硝酸锌浓度为0.1～1.0mol/l；步骤(2)所得溶液蔗糖酯浓度为0.01～0.5g/l。
优选地，所述步骤b中，步骤(3)氢氧化钠与硝酸锌的浓度比值为1.0～3.0。
优选地，所述步骤b中，步骤(4)超声反应条件为：反应温度50～90℃、反应时间5～25min、反应功率200～800w。
本发明所述各成分作用机理如下：
纳米铜：铜主要分布于动物的肝、脑、肾、心、眼的色素部分及毛发中，既是多种酶的重要成分，又是造血和防止营养性贫血所必需的微量元素；铜既能催化血红素和红细胞的形成，又能维护细胞结构和功能的完整性，对动物机体的造血免疫功能、神经细胞、骨骼、结缔组织和被毛的生长发育及动物生产性能都有积极的促进作用。纳米铜由铜离子被还原成零价铜而制得，与传统单质铜相比，纳米铜除具有普通单质铜的营养生理效应外，还具有小尺寸效应和表面活性效应，在动物体内，可以通过被动扩散或自身独特的吸收方式，减少对载体、能量的需要和消耗，提高其吸收利用效率，减少在饲料中的添加量，从而提高动物生产养殖综合效益。其次，纳米铜还具有显著的抗菌作用，研究表明，其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等病原菌具有优异的抑菌杀菌作用。
纳米氧化锌：锌是动物体许多酶的组成成份或活性剂，是dna聚合酶、rna聚合酶、胸腺嘧啶、核苷酸酶的重要组成成分，参与dna复制、转录和调控蛋白质合成等一系列过程。纳米氧化锌，无毒无味、无刺激性，可以有效杀灭金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌等病原菌，且由于其海绵状多微孔结构而具有缓释长效性。纳米氧化锌抗菌机理包括：ⅰ锌离子活性抗菌机理：细菌通常带负电荷，带正电的锌离子通过库仑引力与细菌细胞膜牢固结合并进入细胞，与细胞中的巯基发生反应，使蛋白质变性，从而使细菌丧失分裂增殖能力而死亡，当菌体被杀灭后，锌离子通过沉淀平衡重新游离出来与其他菌落接触，进行新一轮细菌杀灭；其次，锌离子还能破坏微生物的电子传输系统、呼吸系统和物质输运系统；ⅱ光催化抗菌机理：当纳米氧化锌接受光的照射后，产生具有强氧化性的电子空穴，氧化分解细菌的细胞壁以及细胞膜，起到杀菌作用；ⅲ活性氧抗菌机理：纳米氧化锌在空气中与水接触会产生具有强氧化性的h2o2，破坏细菌细胞壁等物质，从而达到杀菌目的。
聚乙烯吡咯烷酮：聚乙烯吡咯烷酮简称pvp，是一种非离子型高分子化合物，具有低毒性、生理相容性及优异的溶解性能，在医药、食品、化妆品等领域应用广泛。pvp分子中o、n的孤对电子可与cu2+之间形成共价键，在反应体系中形成pvp-cu2+的复杂络合体，当还原剂把cu2+还原成铜纳米粒子时，这种络合体形成的空间位阻能起到阻止铜粒子团聚的作用。纳米铜粉由于颗粒较小，处在晶体表面区域的原子数目较多，使得其活性比处于晶体内部的原子高出许多，极不稳定。因此，在制备过程中添加适量的pvp作为保护剂，能够有效防止纳米铜颗粒团聚，增加颗粒稳定性，从而得到粒径分布范围窄、分散性好、晶型较好的纳米铜粉。
蔗糖酯：蔗糖脂肪酸酯简称蔗糖酯，是由纯糖和脂肪油制得的酯类化合物，是适用于食品和饮料的无毒、可生物降解的非离子型表面活性剂。蔗糖酯的空间位阻作用可以有效抑制纳米晶粒的粘连，防止纳米氧化锌粒子的团聚，减少纳米材料合成过程中的毒性和对环境的污染。近年来，蔗糖酯已被用作表面活性剂在微乳液法中合成纳米材料，如硫化铅、硫化镉、硫化镍和透钙磷石等。
本发明的有益效果：
1、本发明的功效成分纳米铜和纳米氧化锌具有很好的稳定性、细胞穿透性、药物缓释性和多价效应，因而与病原微生物接触时能发挥更显著的生物效应，具有更强的抗菌活性。
2、本发明的一种高抗菌纳米饲料添加剂不仅可以预防和治疗病菌感染，增强机体免疫功能和抗应激功能，还能有效促进动物生长，提高饲料利用率，且不产生耐药性，是一种绿色、安全的功能性饲料添加剂。
3、本发明的一种高抗菌纳米饲料添加剂，制备工艺简单，生产成本较低，具有重要的经济和社会意义，发展前景广阔。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种高抗菌纳米饲料添加剂，包括下述原料：纳米铜、纳米氧化锌，其中，纳米铜与纳米氧化锌重量比为1：1。
上述一种高抗菌纳米饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：
a、纳米铜的制备
(1)分别称取0.06mol硝酸铜和1.5mol抗坏血酸，分别溶于1l乙醇中，配置浓度为0.06mol/l的硝酸铜溶液和浓度为1.5mol/l的抗坏血酸溶液；
(2)称取1.8mol聚乙烯吡咯烷酮，将其溶于1l0.06mol/l硝酸铜溶液中，使硝酸铜与聚乙烯吡咯烷酮摩尔比为1：30，在磁力搅拌作用下水浴加热至50℃；
(3)向步骤(2)所得溶液中加入40ml1.5mol/l的抗坏血酸溶液，使硝酸铜与抗坏血酸摩尔比为1：1，混合均匀，置于超声反应器中反应40min后，逐渐冷却至室温；
(4)将冷却的溶液用乙醇稀释后，10000rpm/min离心10min，去除上层清液，此过程重复3次；
(5)将步骤(4)所得产物于室温下真空干燥24h，即得纳米铜颗粒；
b、纳米氧化锌的制备
(1)称取0.1mol硝酸锌溶于1l去离子水中，配置0.1mol/l的硝酸锌溶液；
(2)将0.01g蔗糖酯加入到步骤(1)所得硝酸锌溶液中进行分散溶解，配制成蔗糖酯-硝酸锌溶液；
(3)将步骤(2)所得溶液逐滴加入到0.3mol/l的氢氧化钠溶液中，使溶液中氢氧化钠与硝酸锌的浓度比值为3.0，电动搅拌30min，溶液有白色浑浊生成；
(4)将步骤(3)生成的白色浑浊液转移到超声反应器中，在反应温度为50℃、反应功率为200w的条件下，超声反应25min；
(5)将步骤(4)所得反应混合液在4000r/min下离心分离10min，去除上层清液，产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤3次；
(6)将步骤(5)所得产物置于60℃真空干燥箱中干燥12h，即得纳米氧化锌颗粒；
c、高抗菌纳米饲料添加剂的制备
将步骤a所得纳米铜与步骤b所得纳米氧化锌重量比为1：1混合均匀，既得本发明所述高抗菌纳米饲料添加剂。
实施例2
一种高抗菌纳米饲料添加剂，包括下述原料：纳米铜、纳米氧化锌，其中，纳米铜与纳米氧化锌重量比为1：6。
上述一种高抗菌纳米饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：
a、纳米铜的制备
(1)分别称取0.2mol硝酸铜和1.0mol抗坏血酸，分别溶于1l乙醇中，配置浓度为0.2mol/l的硝酸铜溶液和浓度为1.0mol/l的抗坏血酸溶液；
(2)称取4mol聚乙烯吡咯烷酮，将其溶于1l0.2mol/l硝酸铜溶液中，使硝酸铜与聚乙烯吡咯烷酮摩尔比为1：20，在磁力搅拌作用下水浴加热至30℃；
(3)向步骤(2)所得溶液中加入400ml1.0mol/l的抗坏血酸溶液，使硝酸铜与抗坏血酸摩尔比为1：2，混合均匀，置于超声反应器中反应20min后，逐渐冷却至室温；
(4)将冷却的溶液用乙醇稀释后，10000rpm/min离心10min，去除上层清液，此过程重复3次；
(5)将步骤(4)所得产物于室温下真空干燥24h，即得纳米铜颗粒；
b、纳米氧化锌的制备
(1)称取1.0mol硝酸锌溶于1l去离子水中，配置1.0mol/l的硝酸锌溶液；
(2)将0.5g蔗糖酯加入到步骤(1)所得硝酸锌溶液中进行分散溶解，配制成蔗糖酯-硝酸锌溶液；
(3)将步骤(2)所得溶液逐滴加入到1.0mol/l的氢氧化钠溶液中，使溶液中氢氧化钠与硝酸锌的浓度比值为1.0，电动搅拌90min，溶液有白色浑浊生成；
(4)将步骤(3)生成的白色浑浊液转移到超声反应器中，在反应温度为90℃、反应功率为800w的条件下，超声反应5min；
(5)将步骤(4)所得反应混合液在4000r/min下离心分离10min，去除上层清液，产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤3次；
(6)将步骤(5)所得产物置于60℃真空干燥箱中干燥12h，即得纳米氧化锌颗粒；
c、高抗菌纳米饲料添加剂的制备
将步骤a所得纳米铜与步骤b所得纳米氧化锌重量比为1：6混合均匀，既得本发明所述高抗菌纳米饲料添加剂。
实施例3
一种高抗菌纳米饲料添加剂，包括下述原料：纳米铜、纳米氧化锌，其中，纳米铜与纳米氧化锌重量比为1：3。
上述一种高抗菌纳米饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：
a、纳米铜的制备
(1)分别称取0.35mol硝酸铜和0.5mol抗坏血酸，分别溶于1l乙醇中，配置浓度为0.35mol/l的硝酸铜溶液和浓度为0.5mol/l的抗坏血酸溶液；
(2)称取0.35mol聚乙烯吡咯烷酮，将其溶于1l0.35mol/l硝酸铜溶液中，使硝酸铜与聚乙烯吡咯烷酮摩尔比为1：1，在磁力搅拌作用下水浴加热至70℃；
(3)向步骤(2)所得溶液中加入2100ml0.5mol/l的抗坏血酸溶液，使硝酸铜与抗坏血酸摩尔比为1：3，混合均匀，置于超声反应器中反应10min后，逐渐冷却至室温；
(4)将冷却的溶液用乙醇稀释后，10000rpm/min离心10min，去除上层清液，此过程重复3次；
(5)将步骤(4)所得产物于室温下真空干燥24h，即得纳米铜颗粒；
b、纳米氧化锌的制备
(1)称取0.4mol硝酸锌溶于1l去离子水中，配置0.4mol/l的硝酸锌溶液；
(2)将0.2g蔗糖酯加入到步骤(1)所得硝酸锌溶液中进行分散溶解，配制成蔗糖酯-硝酸锌溶液；
(3)将步骤(2)所得溶液逐滴加入到0.8mol/l的氢氧化钠溶液中，使溶液中氢氧化钠与硝酸锌的浓度比值为2.0，电动搅拌70min，溶液有白色浑浊生成；
(4)将步骤(3)生成的白色浑浊液转移到超声反应器中，在反应温度为70℃、反应功率为400w的条件下，超声反应15min；
(5)将步骤(4)所得反应混合液在4000r/min下离心分离10min，去除上层清液，产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤3次；
(6)将步骤(5)所得产物置于60℃真空干燥箱中干燥12h，即得纳米氧化锌颗粒；
c、高抗菌纳米饲料添加剂的制备
将步骤a所得纳米铜与步骤b所得纳米氧化锌重量比为1：3混合均匀，既得本发明所述高抗菌纳米饲料添加剂。
应用实施例
本发明的一种高抗菌纳米饲料添加剂对病原菌的抑制作用
1、测试样品：上述实施例1～3制备的高抗菌纳米饲料添加剂。
2、测试病原菌：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌。
3、测试用培养基：细菌为牛肉膏蛋白胨细菌培养基；白色念珠菌为沙堡氏培养基。
4、测定方法：
(1)在250ml三角瓶中加人70ml0.03mol/l磷酸缓冲液，高压蒸汽灭菌备用(压力为9.8×104pa，温度为121℃，时间为30min)；
(2)于上述三角瓶中，分别加入上述实施例1～3制备的待测饲料添加剂及待测病原菌菌液，使饲料添加剂的浓度500μg/ml，菌液的浓度为2×104cfu/ml，菌液经显微镜观察确定无其它杂菌污染；
(3)对照样不加饲料添加剂，其它步骤与待测样相同；
(4)将上述三角瓶固定于振荡摇床上，250r/min、37℃恒温振荡lh，取0.5ml三角瓶内的试样加入直径为9cm的无菌培养皿中，再加入18ml融化后冷却至45℃的培养基，迅速轻轻摇动混匀，平放于台上；
(5)待培养基凝固后，翻转培养皿，使底向上，置37℃恒温箱内培养48h(白色念珠菌培养72h)，观察菌落数(即剩余的活菌数量)，比较实施例1～3制备的饲料添加剂的抗菌性能。
按照以上方法，每个待测样样品及对照样都各做一式3份实验，并重复测定3次，取3次实验的平均值计算出灭菌率。由于细菌和酵母菌的死亡是一次性的，可以用灭菌率作为指标来评价纳米饲料添加剂的抗菌性能。灭菌率采用下式计算：
灭菌率＝(对照组平均菌落数-样本组平均菌落数)×100％/对照组平均菌落数
5、测试结果：检测结果如下表1所示。
表1高抗菌纳米饲料添加剂灭菌率测定结果
6、结论
经检测，本发明的一种高抗菌纳米饲料添加剂能够有效抑制革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、白色念珠菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌、铜绿假单胞菌)的生长，且对革兰氏阴性菌的抑制效果强于革兰氏阳性菌，这可能与二者的细胞壁结构、成分以及生长形态的不同相关。其次，抑菌实验表明，实施例3对4种病原菌的杀菌率最高，表明实施例3为本发明的最佳制备工艺。