一种发酵苦荞的制备方法及应用与流程

本发明属于保健食品技术领域，具体涉及一种发酵苦荞的制备方法及应用。

背景技术：

随着年龄的增大，炎症特别是慢性炎症的发病率会不可避免地升高。而且随着经济和社会的发展，由于环境污染和生活压力等越来越重，全世界特别是经济较为发达的国家和地区，慢性炎症及其引发的疾病的发病率越来越高且呈现年轻化的趋势。长期处于压力和暴露于污染物之下会导致身体机能失衡，特别是体内氧化应激水平升高。过高的氧化应激水平会损伤机体的dna和细胞，从而诱发和加重炎症的发生。目前，已有的大量研究表明，长期的慢性炎症是癌症、糖尿病、阿兹海默症以及心脑血管疾病的重要诱发病因。

目前对急性炎症主要采用抗生素治疗，例如阿莫西林、头孢类药物，而针对慢性炎症还未有比较满意的治疗方案。目前认为那些可以清除衰老损伤细胞的药物可以预防和减轻慢性炎症，另外，一些可以清除炎症促进因子和增加自身免疫功能的药物可能也可以预防和减轻慢性炎症。但是，这些潜在的药物还在寻找当中，目前并没有上市的相关药物。所以，目前相关专家推荐通过调整生活方式和饮食来预防和降低慢性炎症的发生和发展。前人一些研究表明，植物性食物中含有多种活性成分，具有一定的抗炎作用，例如植物中的多糖、酚类物质等。由于慢性炎症是一个长期持续的发病过程，其预防和控制也是一个长期持续的过程，而一般药物是不能够长期持续服用，但是功能性食品却可以长期持续食用。所以，目前全世界都在积极地从食源性植物中寻找具有较好抗炎作用的原料用以开发相关功能食品以应对日益严峻的慢性炎症等相关疾病问题。因此，开发新型具有抗炎活性的功能食品具有极其重要的意义。

苦荞是一种经济价值很高的粮食作物，其富含多种营养和功能成分，具有良好的营养价值和保健功能。目前国内外已有的大量研究和流行病学调查结果表明苦荞具有明显的抗炎作用，并认为这是一活性功能食品，苦荞中酚类物质特别是芦丁的含量较高。如前所述，目前大量研究表明植物酚类物质以及芦丁具有良好的抗炎活性。本研究室前期研究也表明苦荞的醇提物能够抑制氧化应激所导致的dna损伤同时具有良好的抑制炎症反应的作用，并且确认苦荞的酚类物质特别是芦丁是其主要的活性成分。另外，许多学者对各种发酵食品的功能进行研究发现，发酵能够显著提高多种食品的功能活性或者产生新的功能，例如纳豆的抗氧化能力强于未发酵的大；利用丝状真菌发酵制成的天培也同样具有更好的抗氧化活性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种发酵苦荞的制备方法及应用，以苦荞米为原料，采用食用真菌对苦荞米进行发酵，提高苦荞的功能活性，开发出具有预防和降低炎症、抑制由自由基引发的dna损伤的功能食品或药物，具有很好的应用前景。

本发明的发酵苦荞以苦荞米为主要原料，经杀菌、发酵、粉碎制成，具体操作如下：

（1）苦荞米的预处理：首先将苦荞米用水清洗干净，再加水将苦荞米浸没，然后于室温下浸泡6~12小时，沥干后粉碎，再进行高压灭菌处理，然后冷却至室温后转入发酵罐中，且转入每个发酵罐中的苦荞米体积为发酵罐总容积的10~60%；

（2）先将食用真菌种于马铃薯培养基上进行活化培养，待菌种产生孢子后，用生理盐水将培养基表面的孢子洗出并制成孢子悬液，然后将孢子悬液加入至步骤（1）中转入苦荞米后的发酵罐中，再置于27~30℃下发酵3~5天，待发酵结束后，将发酵后的苦荞米冷冻干燥，然后研磨成粉，得到发酵苦荞功能食品。

所述步骤（2）中孢子悬液的浓度为10⁴~10⁸个/ml。

所述步骤（2）中孢子悬液与发酵罐中苦荞米的体积质量比为1ml:10~100g。

所述步骤（2）中发酵的湿度为60~95%，发酵罐的通气量为12~23l/h。

所述步骤（2）中食用真菌为米根霉、米曲霉、少孢根霉中的一种或一种以上。

本发明另一目的是将上述发酵苦荞的制备方法制得的发酵苦荞应用在制备预防和/或减轻炎症的食品或药物中。

本发明另一目的是将上述发酵苦荞的制备方法制得的发酵苦荞应用在制备抑制由自由基引发的dna损伤的食品或药物中。

上述食品中可以添加常规辅料，制成粉剂、胶囊或颗粒剂的食品或饮料。

所述发酵苦荞每克苦荞米中总酚的含量≥11.7mg，每克苦荞米中芦丁的含量≥16.6mg。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明采用现代生物发酵技术对苦荞中活性成分进行生物转化，提高了苦荞中酚类物质和芦丁的含量，该技术低能耗且环境友好；与原料苦荞相比，发酵后的苦荞预防和减轻炎症的作用更强或者效果相当但具有更好的风味。

2、本发明制得的发酵苦荞富含多种酚类物质和芦丁，具有显著的预防和减轻炎症的功效，制成功能食品，安全不限量，可以长期持续食用。

3、本发明发酵苦荞中酚类物质含量提高，是其主要的活性成分，大量研究表明植物酚类物质具有抗氧化、延缓衰老、预防多种慢性疾病等功效。因此，本发酵苦荞不仅保证了预防和减轻炎症反应的作用，还能促进机体健康。

附图说明

图1是不同浓度发酵和未发酵苦荞对lps诱导的raw264.7细胞释放no的影响示意图；

图2是不同浓度样品对pet23b质粒dna超螺旋结构的保护作用电泳图，其中泳道1：dna；泳道2：dna+aaph；泳道3、4、5分别为：dna+aaph+未发酵苦荞（200、300、400μg苦荞/ml）；泳道6、7、8分别为：dna+aaph+米根霉1发酵苦荞（200、300、400μg苦荞/ml）；泳道9、10、11分别为：dna+aaph+少孢根霉发酵苦荞（200、300、400μg苦荞/ml）；泳道12、13、14分别为：dna+aaph+米根霉2发酵苦荞（200、300、400μg苦荞/ml）；

图3是不同浓度样品对pet23b质粒dna超螺旋结构的保护作用的示意图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步说明本发明，但应注意本发明的保护范围并不受这些实施例的限制。

实施例1~3中的米根霉1编号为40469，米根霉2编号为40506，少孢根霉的编号为3152，米曲霉编号为2026，均从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买。

实施例1：发酵苦荞的制备方法，具体操作如下：

苦荞的预处理：首先将苦荞米用水清洗干净后，加水浸没清洗后的苦荞米，于23℃下浸泡8小时，沥干后粉碎，再进行高压灭菌处理，冷却至23℃后转入3个发酵罐中，转入每个发酵罐中的苦荞米体积为发酵罐总容积的40%；

将米根霉1、米根霉2和一株少孢根霉分别种于马铃薯培养基上进行活化培养，待每个菌种产生孢子后，用生理盐水洗下三个培养基表面的孢子制成三种孢子悬液，每种孢子悬液的浓度均为2.0×10⁶个孢子/ml，然后将三种不同的孢子悬液分别加入到预处理好的含有苦荞的三个发酵罐中，每个发酵罐中加入一种孢子悬液，且每一个发酵罐中加入的孢子悬液与发酵罐中苦荞米的体积质量比为1ml:30g，然后将三个发酵罐置于28℃下发酵4天，发酵过程中湿度均为85%，每个发酵罐的通气量均为18l/h，待发酵结束后，将三个发酵罐中的发酵苦荞分别冷冻干燥，然后粉碎成粉，得到三种发酵苦荞。

发酵前后苦荞酚类物质定性定量测定：采用uplc-esi-hrms/ms对发酵前后苦荞中化合物组成和含量进行测定，具体操作如下：uhplc分离条件为：分离柱为thermofisherc18柱子；流动相a为0.1%甲酸水，b为乙腈；分离梯度为：0-3min，5%b；3-8min，5-12%b；8-18min，12-15%b；18-20min，15-85%b；20-21min，85-5%b；21-22min，5%b；流速为0.2ml/min；进样量为2μl。esi-hrms/ms鉴定条件为：高分辨率质谱为q-exactiveorbitrap质谱(thermofisherscientific，德国)，主要技术参数为：全扫范围为100-1000m/z；鞘气流速为，30l/min；辅助气体流速，8l/min；吹扫气体流速4l/min；负离子模式喷雾电压，3.20kv；离子传输管温度，320℃；s-lensrf水平，50%。

发酵前后苦荞中酚类物质总量的测定，采用福林酚法测定各提取物中多酚类物质的总含量，具体操作如下：在室温条件下，将发酵前后苦荞的甲醇提取物用甲醇配成一定浓度的溶液，然后每种提取物溶液各取1ml（每种提取物做三次平行），加入1ml的福林酚试剂，静置1min后分别加入1.5ml的20%na2co3和7.5ml的蒸馏水，混匀后于70℃孵育10min，待冷却至室温后，用分光光度计于765nm下测定吸光值，并以没食子酸作标准曲线，通过吸光值计算各提取物中多酚类物质的总含量，表示为μmol没食子酸/g苦荞干重。

表1本实施例中发酵前后苦荞所含酚类物质的种类

表2本实施例中发酵前后苦荞酚类物质的含量(μmol/g苦荞干重)

由表2可知，经过三种真菌发酵后，苦荞中四种主要酚类物质含量均显著升高，而且不论发酵与否，芦丁均为苦荞中含量最高的酚类物质，而且发酵后的苦荞总酚含量升高1.9~2.5倍。

采用lps诱导raw264.7巨噬细胞炎症反应模型来对发酵前后苦荞抑制和减轻炎症反应活性进行评价。首先复苏传代细胞，然后将处于对数生长期的细胞稀释为为4×10⁴个/ml的单细胞悬液，然后将细胞接板于12孔板细胞中，每孔1ml，于5%co2，37℃恒温培养箱中培养24h，吸除培养基，重新加入1ml含lps（1.5μg/ml）的完全培养基，刺激12h。12h后吸除培养基，分别加入1ml稀释成不同浓度的样品溶液（样品浓度分别为1、2苦荞/ml）和芦丁标准品溶液（标准品浓度分别为20、40μg/ml），孵育12h后，将各孔培养基转移到无菌离心管中，3000r/min下离心10min，将上清液吸出置于新的离心管中，置于-20℃冰箱中保存备用，实验重复三次，然后根据试剂盒操作说明检测上清液中no含量。

采用lps诱导raw264.7巨噬细胞是经典的炎症反应模型，当raw264.7巨噬细胞经过lps刺激后其no释放量会显著增加，如图1所示，说明raw264.7发生了炎症反应，再添加了发酵前后的苦荞或者芦丁后，其no释放量显著下降，其中米根霉2发酵苦荞处理后的抑制效果最好，米根霉1发酵苦荞和未发酵苦荞相当，少孢根霉发酵苦荞对no的抑制能力稍稍变弱，但是相较于未发酵苦荞，经过发酵后的苦荞具有特殊的香气，大大提升了产品的感官。

发酵前后苦荞对dna损伤的保护作用测定：首先取2μl稀释成不同浓度的苦荞样品溶液，然后分别加入2μlpbs缓冲液、2μl质粒dna以及4μlaaph溶液，混匀后避光于37℃下孵育1h。以未经处理的dna为空白对照，同时以只加了aaph溶液处理的dna组作为模型对照组。孵育结束后，取1μl溴化乙锭加入到反应混合液中进行着色，然后将所有混合液添加到1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，电泳条件为180v，35min。等到电泳结束后，在凝胶成像系统下进行紫外观测，然后采用“imagelab5.0”软件计算每条dna带的光强度，超螺旋dna保留率（%）计算如下：

超螺旋dna保留率（%）=×100

式中：a1表示aaph和苦荞存在时超螺旋dna的亮度

a2表示表示aaph和苦荞不存在时超螺旋dna的亮度

研究表明由自由基引发的dna损伤可以导致多种疾病，另外，一些自由基本身也是促炎症因子，而且炎症和dna损伤存在着相互促进的关系。本实施例除了测定发酵前后苦荞对raw264.7巨噬细胞炎症反应的直接抑制作用外，同时还测定了发酵前后苦荞对自由基引发的dna损伤的保护作用，从而评价了发酵前后苦荞对炎症的间接抑制作用以及相关的保健功能。检测结果如图2、图3所示，其中图2中泳道1：dna；泳道2：dna+aaph；泳道3、4、5分别为：dna+aaph+未发酵苦荞（200、300、400μg苦荞/ml）；泳道6、7、8分别为：dna+aaph+米根霉1发酵苦荞（200、300、400μg苦荞/ml）；泳道9、10、11分别为：dna+aaph+少孢根霉发酵苦荞（200、300、400μg苦荞/ml）；泳道12、13、14分别为：dna+aaph+米根霉2发酵苦荞（200、300、400μg苦荞/ml），图2、图3结果表明经过三种丝状真菌发酵后，苦荞对aaph诱导的dna损伤的保护作用显著增强，且呈现量效关系。

实施例2：发酵苦荞的制备方法，具体操作如下：

苦荞的预处理：首先将苦荞米用水清洗干净后，加水浸没清洗后的苦荞米，于24℃下浸泡12小时，沥干后粉碎，再进行高压灭菌处理，冷却至24℃后转入三个发酵罐中，转入每个发酵罐中的苦荞米体积为发酵罐总容积的10%；

将米根霉1、米根霉2和一株少孢根霉分别种于马铃薯培养基上进行活化培养，待每个菌种产生孢子后，用生理盐水洗下培养基表面孢子制成三种孢子悬液，每种孢子悬液的浓度均为10⁴个孢子/ml，然后将三种不同的孢子悬液分别加入到预处理好的含有苦荞的三个发酵罐中，每个发酵罐中加入一种孢子悬液，且每一个发酵罐中加入的孢子悬液与发酵罐中苦荞米的体积质量比为1ml:10g，然后于30℃下发酵5天，发酵过程中湿度均为60%，每个发酵罐通气量均为23l/h，待发酵结束后，将三个发酵罐中的发酵苦荞冷冻干燥，然后粉碎成粉，得到三种发酵苦荞，经检测，米根霉1、米根霉2和一株少孢根霉发酵得到的发酵苦荞每克苦荞米中总酚的含量分别为12.6、14.3和16.6mg，米根霉1、米根霉2和一株少孢根霉发酵得到的发酵苦荞每克苦荞米中芦丁的含量分别为16.9、17.9和20.6mg。

实施例3：发酵苦荞的制备方法，具体操作如下：

苦荞的预处理：首将苦荞米用水清洗干净后，加水浸没清洗后的苦荞米，于25℃下浸泡6小时，沥干后粉碎，再进行高压灭菌处理，冷却至25℃后转入一个发酵罐中，转入发酵罐中的苦荞米体积为发酵罐总容积的60%；

发酵苦荞粉的制备：将米曲霉和一株少孢根霉共同种于马铃薯培养基上进行活化培养，待每个菌种产生孢子后，用生理盐水洗下培养基表面孢子制成孢子悬液，孢子悬液的浓度均为10⁸个孢子/ml，向预处理好的含有苦荞的发酵罐中加入孢子悬液，且加入的孢子悬液与发酵罐中苦荞米的体积质量比为1ml:100g，然后于27℃下发酵3天，发酵过程中湿度为95%，发酵罐通气量为12l/h，待发酵结束后，将发酵苦荞冷冻干燥，然后粉碎成粉，得到发酵苦荞，经检测，该米曲霉和少孢根霉共同发酵得到的发酵苦荞每克苦荞米中总酚的含量为14.3mg，米曲霉和少孢根霉共同发酵得到的发酵苦荞每克苦荞米中芦丁的含量为17.9mg。该发酵苦荞制备抑制由自由基引发的dna损伤的食品，对人体无副作用，可长期服用，促进人体健康。