本申请根据35u.s.c.§119(e)要求2016年7月1日提交的美国临时专利申请号62/357,829并且标题为“含有裂解的微生物细胞的饲料成分(feedingredientscontaininglysedmicrobialcells)”的优先权权益，以及要求2016年10月14日提交的美国临时专利申请号62/408,630并且标题为“含有氧化稳定的未裂解和裂解的微生物细胞的饲料成分(feedingredientscontainingoxidativelystableunlysedandlysedmicrobialcells)”的优先权权益，以及根据35u.s.c.§120要求2017年6月28日提交的美国临时专利申请号15/636,506并且标题为“包含裂解的微生物细胞的饲料成分(feedingredientscomprisinglysedmicrobialcells)”的优先权权益，将其各自通过引用以其全文结合在此。
背景技术：
：：由微生物和植物产生的甘油三酯油为食物链中高等生物的消耗提供必需的营养素。这种甘油三酯油由某些未发现的或者在高等生物中以较低的量产生脂肪酸组成。在食物链中特别具有营养重要性的是由微生物和植物产生的多不饱和脂肪酸(pufa)含量高的甘油三酯油。多不饱和脂肪酸包括长链ω-3脂肪酸，如二十二碳六烯酸(dha)。dha在人类营养中是一种重要的成分，尤其对于婴儿来说。水生动物(如鱼和水生贝壳类动物)在它们的饮食中也需要dha用于适当发育和生长。另外，向新生家畜如猪、母牛和其他哺乳动物喂养dha增加了小猪、小牛、小山羊和其他新生哺乳动物的存活率。今天的商业长链ω-3脂肪酸的主要来源是鱼油。每年产生约100万公吨鱼油，主要用于水产养殖的饲料应用、陆生动物饲料和人类营养。水产养殖业正在增长，但来自野生捕捞鱼的长链ω-3脂肪酸的可用性并未随着需求而增加。持续可用性取决于可持续渔业管理政策、对气候变化敏感的自然系统的生产力以及其他因素。许多国家对野生捕捞鱼有严格的配额。技术实现要素：在一个实施例中，提供了一种饲料成分组合物，其包含裂解的微生物细胞在甘油三酯油中的分散体，其中：a)按组合物重量计5％-90％是裂解的细胞，和b)按组合物重量计10％-90％是甘油三酯油，其中该甘油三酯油包含来自裂解的细胞的油和来自另一种生物体的油。在一些实施例中，甘油三酯油具有按脂肪酸重量计10％-70％的二十二碳六烯酸(dha)、按脂肪酸重量计15％-65％的dha、按脂肪酸重量计20％-60％的dha、按脂肪酸重量计25％-55％的dha、按脂肪酸重量计30％-55％的dha、或按脂肪酸重量计40％-55％的dha的脂肪酸分布型。在一些实施例中，按组合物重量计dha是4％-45％、4％-40％、4％-35％、4％-30％、4％-25％。在其他实施例中，dha是按组合物重量计4％-20％、4％-15％、5％-15％、5％-12％、5％-10％、5％-7％、5％-8％、6％-8％、或6％-7％。在一些实施例中，本文提供的组合物包含按重量计5％-15％、5％-10％、10％-15％、10％-25％、15％-20％、或20％-25％、30％-40％、30％-50％、30％-60％、30％-70％、30％-80％、30％-90％的裂解的微生物细胞。在一些实施例中，本文提供的组合物进一步包含按重量计少于20％、15％、10％、5％、3％、或1％的未裂解的微生物细胞或其中该组合物不含未裂解的微生物细胞。在一些实施例中，组合物不含未裂解的微生物细胞在一些实施例中，来自裂解的微生物细胞的油具有按脂肪酸重量计40％-70％、40％-50％、40％-50％、45％-55％、或50％-55％的dha的脂肪酸分布型。在一些实施例中，裂解的细胞具有小于1:1的纵横比。在其他实施例中，裂解的细胞具有1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10的纵横比。在一些实施例中，裂解的细胞具有1:2-1.5、1:2-1:4或1:2-1:3的纵横比。在一个实施例中，裂解的细胞具有1:1与1:5之间、1:5与1:10之间、1:10与1:15之间、或1:15与1:20之间的纵横比。在一些实施例中，裂解的细胞具有从1微米至20微米、1微米至18微米、1微米至15微米、1微米至12微米、1微米至10微米、1微米至9微米、1微米至8微米、1微米至7微米、1微米至6微米、1微米至5微米、1微米至4微米、1微米至3微米、5微米至100微米、5微米至90微米、5微米至80微米、5微米至80微米、5微米至70微米、5微米至60微米、5微米至50微米、5微米至40微米、5微米至30微米、5微米至20微米、或5微米至10微米的中值粒径。在一些实施例中，大于一半的裂解的细胞在组合物中保持悬浮至少一周而不沉降。在一些实施例中，来自另一种生物体的油是来自鱼、植物、产油微生物或其组合的油。这些油包括从另一种生物体中萃取和分离的那些。在一些实施例中，另一种微生物是微藻、真菌或酵母。在一些实施例中，来自植物的油是椰子、玉米、棉籽、橄榄、棕榈、花生、油菜籽、低芥酸菜籽、红花、芝麻、大豆、大豆油、坚果油、亚麻荠油、或柑橘油、或其一种或多种组合。在一些实施例中，来自鱼的油是来自凤尾鱼、青鱼、鲱鱼、鳀鱼、皮尔彻德鱼、沙丁鱼、或鲭鱼或其一种或多种组合。在一些实施例中，微生物细胞来自thaustochytriacae科。在一些实施例中，微生物细胞来自选自下组的属，该组由以下组成：隐甲藻属、壶菌属、破囊壶菌属和裂殖壶菌属。在一些实施例中，微生物细胞适于在低氯条件下生长。在一些实施例中，本文提供的组合物进一步包含卵磷脂。在一些实施例中，本文提供的组合物进一步包含膳食添加剂如微量营养素。膳食添加剂包括虾青素、类胡萝卜素、黄酮类、固醇类、骨化三醇(维生素d)、生育酚(维生素e)、以及叶绿醌和甲萘醌(维生素k)。其他膳食添加剂包括抗生素、抗真菌药、抗寄生物药和激素。虾青素、类胡萝卜素和其他膳食添加剂可以以微生物生物质的形式添加。例如，可以将酵母、细菌、真菌、微藻或产生虾青素、类胡萝卜素和其他微量营养素的其他微生物添加到组合物中。在一些实施例中，本文提供的组合物进一步包含抗氧化剂。在其他实施例中，抗氧化剂是天然抗氧化剂、卵磷脂、淀粉、抗坏血酸、生育酚、迷迭香萃取物、绿茶萃取物、抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟甲苯(bht)、叔丁基对苯二酚(tbhq)、乙氧喹啉、或其一种或多种组合。在一些实施例中，提供了一种包含本文提供的组合物的运送或储存容器。在其他实施例中，该容器是55加仑的桶或搬运箱。在一些实施例中，提供了一种制备本文提供的食物成分组合物的方法，该方法包括：a)共混微生物细胞与来自另一种生物体的油以形成共混物；b)裂解共混物中的微生物细胞以形成作为分散体的组合物。在一些实施例中，提供了一种制备配制饲料的方法，该方法包括使本文提供的组合物与可食用食物接触。在一些实施例中，提供了一种包含本文提供的组合物和可食用食物的配制饲料。在一些实施例中，用组合物涂覆可食用食物。在其他实施例中，在真空下用组合物涂覆可食用食物。在一些实施例中，可食用食物是水产养殖或动物饲料。在其他实施例中，可食用食物是鲑鱼饲料。在其他实施例中，可食用食物包含鱼或动物副产品或其组合。在一些实施例中，配制饲料是粒化的形式。在一些实施例中，配制饲料含有至少1％、1.5％、或2％的ω-3脂肪酸。在一些实施例中，本文提供的组合物代表按配制饲料重量计的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％。在一些实施例中，本发明的浆液不再是自燃的。含有大量pufa的微生物细胞是氧化不稳定的。含有大量pufa的微生物细胞的储存和运输可能是有问题的，因为其倾向于自燃。当经受50℃与150℃之间的温度时，裂解的微生物细胞在甘油三酯油中的分散体不会自燃。在一些实施例中，当组合物或饲料配制品经受80℃时，组合物或裂解的微生物饲料成分的分散体的燃烧在至少5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时或20小时不会发生。本发明的浆液的运送和保险的成本较低，因为它不会自燃。本发明的浆液还使运送给定量的微生物细胞所需的体积最小化。未裂解的微生物细胞具有低的堆密度。裂解的细胞和甘油三酯油的分散体显著增加了固体的堆密度(消除了聚集体之间的空气空间)，使得几乎两倍的生物质适合于相同的空间；因此导致降低的运送和储存成本。此外，本发明的分散体更容易与氧气暴露隔离。用氮气吹扫超大袋干燥生物质是困难的并且需要大量的氮气并且难以实现低水平的残余氧气。相反，在含有本发明浆液的搬运箱中吹扫小顶部空间是容易实现的并且具有远远更少的氮气。本文提供的组合物或饲料成分包含至少一种或多种选自下组的抗氧化剂，该组由以下组成：卵磷脂、淀粉、抗坏血酸、生育酚、迷迭香萃取物、绿茶萃取物、抗坏血酸棕榈酸酯、bht、tbhq、和pwl。在一些实施例中，当经受50℃与150℃之间的温度时，两种或更多种抗氧化剂延迟或抑制生物质的燃烧。在一些实施例中，当组合物或饲料配制品经受80℃时，组合物或饲料成分的燃烧在至少5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时或20小时不会发生。在一些实施例中，提供了一种组合物，该组合物包含隐甲藻属、壶菌属、破囊壶菌属或裂殖壶菌属的微藻细胞以及两种或多种选自下组的抗氧化剂，该组由以下组成：卵磷脂、淀粉、抗坏血酸、生育酚、迷迭香萃取物、绿茶萃取物、抗坏血酸棕榈酸酯、bht、tbhq、和pwl。当组合物或饲料配制品经受80℃时，组合物的微藻细胞在至少5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时或20小时不会燃烧。在一些实施例中，提供了一种增加动物体重的方法。该方法包括用饲料喂养动物，所述饲料被涂覆有裂解的微生物细胞在甘油三酯油中的分散体，其中裂解的细胞具有小于1:1的纵横比。裂解的微生物细胞在甘油三酯油中的分散体含有按重量计从5％至90％的裂解的细胞和10％与95％之间的甘油三酯油，其中甘油三酯油包含来自裂解的微生物细胞的油和来自另一种生物体的油。例如，用含有50％脂质和50克低芥酸菜籽油的50g裂殖壶菌细胞制成的浆液将具有总共75g的油(50g低芥酸菜籽油和25g裂殖壶菌油)。在一些实施例中，提供了增加动物的热量单位生长系数(tgc)、采食量(fi)或饲料效率(fe)的方法。该方法包括用饲料喂养动物，所述饲料被涂覆有裂解的微生物细胞在甘油三酯油中的分散体，其中裂解的细胞具有小于1:1的纵横比。该方法可以增加动物的tgc、fi和fe。在一些实施例中，提供了降低动物粪便中二十二碳六烯酸含量的方法。该方法包括用饲料喂养动物，所述饲料被涂覆有裂解的微生物细胞在甘油三酯油中的分散体，其中裂解的细胞具有小于1:1的纵横比。在一些实施例中，提供了增加动物的蛋白质沉积(pd)、脂质沉积(ld)、二十二碳六烯酸沉积(dhad)或二十碳五烯酸(epad)的方法。该方法包括用饲料喂养动物，所述饲料被涂覆有裂解的微生物细胞在甘油三酯油中的分散体，其中裂解的细胞具有小于1:1的纵横比。该方法可以增加动物的pd、ld、dhad、或epad。附图说明图1显示了作为实例2的低芥酸菜籽油和生物质混合物的粒度(μm)的和由随后的混合物的均质化或珠研磨产生的分散体的函数的体积密度百分比。图2显示了混合物的和实例2的分散体的显微照片。图3显示了作为混合物的和实例2分散体的剪切速率的函数的粘度。图4显示了1周后混合物的和实例2分散体的外观。图5显示了实例3的生物质和/或抗氧化剂的oxipress值(小时)。图6显示了实例5的膳食dha水平与dha沉积效率(edhad)之间的关系。图7显示了研究期间鲑鱼鱼片(无皮的)的dha含量的变化。每个数据点代表两个样品的平均值，并且每个样品由每个罐中汇集的三条鱼的鱼片组成。说明书定义“纵横比”是指裂解的细胞或未裂解的细胞的宽度与高度的比率。“膳食添加剂”是添加到饲料成分中以提供微量营养素或其他化合物以提高动物产品产量或质量的成分。膳食添加剂典型地是油溶性化合物，但可以是水溶性化合物。膳食添加剂包括但不限于虾青素、类胡萝卜素、黄酮类、固醇类、骨化三醇(维生素d)、生育酚(维生素e)、以及叶绿醌和甲萘醌(维生素k)。虾青素用于水产养殖以增强鲑鱼和鳟鱼等产品的颜色。其他膳食添加剂包括抗生素、抗真菌药、和用于保护动物健康的抗寄生物药、以及激素以增加动物的生长速度和大小。饲料成分组合物可以进一步包含酵母、细菌、真菌、微藻或产生虾青素、类胡萝卜素和其他微量营养素的其他微生物。“分散体”是指油混合物中的固体。在这类混合物中，固体在没有放大的辅助下是肉眼可见地存在。“脂肪酸分布型”是油的甘油三酯中脂酰基基团的分布，而不涉及与甘油主链的附接。脂肪酸分布型典型地通过转化为脂肪酸甲酯(fame)、然后用火焰离子化检测(fid)进行气相色谱(gc)分析来确定。脂肪酸分布型可以被表示为由该脂肪酸的曲线下面积确定的总脂肪酸信号中脂肪酸的一个或多个百分比。fame-gc-fid测量近似于脂肪酸的重量百分比。在甘油三酯油的上下文中的“脂肪酸”是指甘油三酯中的脂酰基部分。因此，应该理解，甘油三脂的脂酰基基团可以就当甘油三酯水解或皂化时产生的羧酸而言进行描述。“饲料成分”是指添加到其他成分或食物中以制造或修饰食物的物质。“饲料效率”(fe)是动物消耗的每给定饲料量的体重(重量)增加。“采食量”(fi)是动物在确定的时间段期间消耗的饲料量。“食物”、“可食用食物”、“饲料”、“配制饲料”和“成品食物”是指具有适合活生物体吸收的一些营养价值的产品。“脂质沉积”(ld)是以度日(mg℃/天)的动物的脂质含量的增加。脂质沉积效率(eld)是喂养给动物的脂质的百分比，其最终为动物的脂质含量。“二十二碳六烯酸沉积”(dhad)是以度日(mg℃/天)的动物的dha含量的增加。“二十二碳六烯酸沉积”效率(edhad)是喂养给动物的二十二碳六烯酸的百分比，其最终为动物的dha含量。“二十碳五烯酸沉积”(epad)是以度日(mg℃/天)的动物的epa含量的增加。“二十碳五烯酸沉积”效率(eepad)是喂养给动物的二十碳五烯酸的百分比，其最终为动物的脂质含量。“低氯”是指生长条件，其中氯化物的量低于海洋环境的盐度。“裂解(lyse)”、“裂解(lysing)”、“裂解(lysis)”意指破坏(disrupting)或破坏(disruption)细胞的细胞壁或细胞膜足以释放至少一些细胞内内容物。“裂解的”细胞或“破坏的”细胞是其中细胞壁和/或膜被破坏的那些。裂解后，细胞内容物(包括甘油三酯油)被部分地或全部地从细胞中释放出来。在破坏细胞壁和/或膜后，细胞内内容物的一些部分(包括甘油三酯油)可保留在破坏的细胞壁或膜内。“微生物细胞”是指单细胞微生物。单细胞微生物包括真核微生物生物体。微生物生物体包括能够进行光合作用的那些以及能够仅以固定碳源为生的异养生物。“产油”细胞、微生物(microbe)或微生物(microorganism)能够天然地或通过重组或经典菌株改良产生按干细胞重量计至少20％的脂质。产油细胞和微生物包括如微藻、真菌和酵母的那些。“蛋白质沉积”(pd)是以度日(mg℃/天)的动物的蛋白质含量的增加。蛋白质沉积效率(epd)是喂养给动物的蛋白质的百分比，其最终为动物的蛋白质含量。“浆液”或“微藻浆液”是裂解的微生物细胞在甘油三酯油中的分散体。浆液包含具有小于1:1的纵横比的裂解的微藻细胞。浆液可以是顶部涂、真空涂覆、喷洒涂覆在固体饲料上。固体饲料可以通过造粒、挤出、成型制备或通过使用其他已知的制备固体的方法制备。“热量单位生长系数”(tgc)是一个数学系数，它描述了水生物种的生长，解释了动物生命阶段发生的生长模式的变化。“甘油三酯分子”是指由三种脂肪酸(其作为酯与甘油主链附接)组成的单一甘油三酯。“甘油三酯油”是指不同的甘油三酯分子的集合，其在不同脂肪酸的性质和比例以及不同脂肪酸如何相对于彼此与甘油主链附接方面不同。在一些实施例中，微生物细胞含有富含dha的甘油三酯油。富含dha的油的商业来源是从来自裂殖壶菌属的物种中获得的，sp.表示该物种是未被鉴定的。如barclay在us5,130,242、5,340,742和5,340,594中所述，这种细胞可通过异养发酵制备。产生dha细胞的大多数商业方法涉及使用确定的培养基、工业需氧发酵容器、确定的操作参数(如ph/温度/盐水平)和双滚筒干燥器以产生特征性细片状粉末。海水含有约0.55m氯化物。氯离子导致工业环境中不锈钢设备的腐蚀。有利的是使培养和加工过程中使用的发酵培养基和其他液体中氯化物的量最小化以使腐蚀最小化。本文提供了已经适于在氯化物浓度小于0.55m的条件下生长的海洋生物体。本发明的低氯条件是300mm至500mm氯化物、100mm至300mm氯化物、50mm至100mm氯化物、1mm至75mm氯化物、1mm至50mm氯化物、1mm至40mm氯化物、1mm至30mm氯化物、1mm至20mm氯化物、1mm至15mm氯化物、1mm至10mm氯化物、0.5mm至10mm氯化物、0.5mm至7.5mm氯化物、或0.5mm至5mm氯化物。通过首先任选地使发酵液脱水(浓缩发酵液)可以实现水性发酵液中微生物细胞的干燥以增加发酵液的细胞含量。脱水或浓缩是指从发酵液或其他液体介质中分离生物质，并且固液分离也是如此。因此，在脱水期间，从生物质中去除培养基(例如，通过保留生物质的过滤器引流发酵液)，或者以其他方式从培养基中去除生物质。脱水的常用方法包括离心、过滤和使用机械压力。这些方法可以单独使用或以任何组合使用。在任选的脱水步骤之后，现在具有较高固体含量的浓缩液可以通过已知的干燥方法干燥，包括但不限于滚筒干燥、气动干燥、喷雾干燥、冻干和其他干燥方法。滚筒干燥器通过将发酵液(或脱水的发酵液)的薄膜施用到滚动的加热滚筒的表面来操作。发酵液的水性部分蒸发，在滚筒表面上留下干燥的固体。然后用刀将干燥的固体从滚筒上刮掉。气动干燥器在热空气流中吸取或吸入待干燥的材料。当在热空气中吸入材料时，水分迅速被去除。然后将干燥的材料与潮湿空气分离，并且然后将潮湿空气再循环用于另外的干燥。喷雾干燥器通过将细小液滴分散体中的发酵液(或脱水的发酵液)喷雾到加热空气流中来操作。吸入的材料快速干燥并形成干粉。喷雾干燥可通过箱式干燥器、或高型喷雾干燥器、流化床干燥器或移动流化床干燥器来完成(例如，喷雾干燥器，基伊埃工程技术有限公司(geaprocessengineering,inc.))。干燥粉末可以与从其他生物体中萃取的油混合。油可以是基本上不含固体材料的纯净油状物。油可以是如从植物油、鱼油或其组合中萃取的油。油主要是甘油三酯油。富含dha的鱼油包括来自南美洲的野生凤尾鱼和来自北半球的青鱼的油。与干燥粉末混合的油也可以包括从破囊壶菌中萃取的油。在一些情形中，其中油主要是来自植物的油，并且含有少于50％、40％、30％、20％或10％的鱼油。可以研磨混合粉末和油或过去常常裂解微生物细胞的其他方法。裂解细胞允许来自细胞的甘油三酯油释放到饲料成分组合物中。机械裂解可以通过各种熟知的方法(如通过辊磨机、均化器或珠研磨)进行。细胞破坏的程度可以通过显微分析来确定。裂解细胞的百分比可以通过观察和计数在细胞裂解后裂解的和未裂解的细胞的数量来确定。在具体实施例中，本发明的裂解的细胞大于50％、60％、70％、80％、90％或95％裂解。细胞的裂解或破坏可通过机械的、酶的、化学的、病毒的、电的、超声的、渗透的或其他方法来完成。压力破坏器(如高压均化器)可用于裂解细胞。压力破坏器通过泵送细胞和油的混合物(例如低芥酸菜籽油或其他植物油)通过限制孔口阀裂解细胞以裂解细胞。施加高压(从50巴至多1500巴)，然后通过离开的喷嘴立即膨胀。niro(nirosoavigea)均化器(或任何其他高压均化器)或其他可商购的均化器可用于将细胞加工成长度为5微米至500微米的颗粒。裂解的细胞的纵横比从未裂解的细胞的约1:1的值减少到1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。用高压均化器处理生物质可以通过控制压力、出口速度和其他参数产生使细胞裂解超过这些细胞的50％、60％、70％、80％、90％、95％或大于95％。可替代地，可以使用球磨机(也称为珠磨机)。在球磨机中，将细胞在具有小研磨颗粒(如珠子)的悬浮液中搅动。细胞由于剪切力、珠子之间的研磨以及与珠子的碰撞而破裂。珠子破坏细胞以释放细胞内容物。可以使用dyno-millecmultra(cbmills)球磨机和其他可商购的珠磨机。细胞也可以通过剪切力破坏，如使用共混(如使用高速或waring共混器作为实例)、弗氏压碎器(frenchpress)、或甚至离心以破坏细胞。剪切混合器可用于裂解细胞，包括线式高剪切混合器和散装高剪切混合器。裂解的细胞的纵横比小于1:1。在另一个实施例中，纵横比是1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。未裂解的细胞的纵横比为约1:1。裂解细胞的一个优点是它们具有小于1:1的纵横比。较小的纵横比是有利的，因为当裂解的细胞/油浆液用于工业设备时，裂解的细胞/油浆液防止或使设备的堵塞最小化，包括用于将裂解的细胞/油浆液喷雾到挤出的饲料上的孔口。然后可以将饲料成分组合物与其他饲料成分一起配制以产生配制饲料。在一些实施例中，将含有裂解的细胞的饲料成分组合物涂覆在压制或挤出的饲料上，如通过喷雾。压制或挤出的饲料可以是高蛋白的，如衍生自鱼和/或动物副产品的那些。配制饲料还可以包括另外的添加剂以改进风味、稳定性和保质期。配制饲料可用于水产养殖以喂养养殖鱼类或水生贝壳类动物。养殖鱼类包括肉食性鱼类。在一些实施例中，养殖鱼类或水生贝壳类动物是鲑鱼、鳗鱼、甲壳类动物、海鱼、淡水鱼、罗非鱼、或鳗鱼。在其他实施例中，鱼类或水生贝壳类动物是海鲈鱼、海鲷(seabrim)、黄狮鱼、石斑鱼、尖吻鲈、或虾。实例实例1.食物成分将通过标准异养发酵制备的富含dha的裂殖壶菌细胞(生物质)干燥并使用标准叶轮型混合器在载量水平为按重量计10％、20％和30％的生物质与低芥酸菜籽油共混。然后通过高压均化器或珠磨机处理油共混物中的生物质，以产生裂解的藻类细胞在油中的分散体。为了在高压均化器中裂解，使用200巴至1200巴的压力并且足以裂解细胞。实例2.分析混合物和从混合物制备的分散体制备与实例1的低芥酸菜籽油共混的按重量计20％的生物质共混物，并通过malvernmastersizer3000上的激光衍射粒度分析进行分析。将混合物还在400巴下均质化并珠研磨，并且也分析所得的分散体。图1显示了珠研磨的分散体具有比均质化的分散体更低的平均粒度，并且两者具有比母体混合物更低的平均粒度。在图2的显微照片中也可以看到较小的尺寸(放大400x)。混合物的dv50值(分布值为50％或更低)为228μm，而均质化的分散体具有15.3μm的dv50，并且珠研磨的分散体具有3.8μm的dv50，表明分散体具有更好的用于喷雾器的特征。使用马尔文(malvern)kinexus专业流变仪测量图3的粘度。发现与均质化的分散体(其进而低于混合物)相比，在任何给定的剪切速率下，珠研磨的分散体具有较低的粘度。允许混合物和两种分散体沉降，并且一周后它们的外观显示在图4中。发现珠研磨的分散体基本上保持在悬浮液中。混合物显示出最大程度的沉降。实例3.氧化稳定性分析使用手动共混器将实例1的干燥生物质与各种抗氧化剂合并。使用oxipress在约80℃分析含有或不含抗氧化剂的干燥生物质。使用天然和合成抗氧化剂并且其包括l-α-卵磷脂(大豆，calbiochem公司#429415)、淀粉(玉米，阿尔戈国际控股集团有限公司(argo))、抗坏血酸(光谱化学公司(spectrumchemicalco.))、paradigmox白色液体(pwl-没食子酸盐，凯明健康公司)、rpt40(迷迭香、生育酚、抗坏血酸棕榈酸酯、凯明健康公司)、naturfortlgr105(绿茶和迷迭香萃取物，凯明健康公司)、rendoxcq(tbhq，凯明健康公司)、rendoxeq(乙氧喹啉，凯明健康公司)、bht(结晶溶于乙醇，凯明健康公司)、和covi-oxt-30p(混合生育酚)。图5显示了某些含生物质的卵磷脂的令人惊讶和意想不到的氧化稳定性。当用抗氧化剂rpt40(4,000ppm)和卵磷脂(1％)制备时，生物质的氧化稳定性在80℃为约22小时。这是令人惊讶和意想不到的，因为当用4,000ppmrpt40单独配制时，生物质的氧化稳定性是约16小时，并且当用1％卵磷脂单独配制时生物质的氧化稳定性是约1.5小时。当用rpt40和卵磷脂配制生物质时，稳定性为22小时，远高于17.5小时的预测稳定性。实例4.配制饲料使用真空涂覆设备将实例1的浆液顶部涂覆到挤出的饲料颗粒上。所得颗粒含有按重量计20％的实例1的分散体。实例5.鲑鱼饲养研究将四种水产养殖饮食配制成含有2.0％dha，并且dha与epa的比率为2.1与2.5之间。下表1公开了饮食a、b、c和d的成分和每种成分的量。下表2公开了四种饮食的营养含量。饮食a(对照)不含裂殖壶菌生物质，但使用作为顶涂层的标准鱼油作为dha的主要膳食来源(还有含有低水平dha的鱼粉)。饮食b含有未裂解的裂殖壶菌生物质。对于饮食b，在饲料挤出后，用低芥酸菜籽油和青鱼油顶部涂覆颗粒。饮食c含有珠研磨的裂殖壶菌生物质，其与低芥酸菜籽油混合并与表1中所示的其他油一起真空涂覆在挤出的鲑鱼饲料上。饮食d含有裂殖壶菌生物质，其在400巴下均质化并与低芥酸菜籽油混合并与表1中所示的其他油一起真空涂覆在挤出的鲑鱼饲料上。dha水平最终低于预期，为1.5％而非2％。计算和观察到的膳食dha含量之间的差异可能是由于其中一种鱼油中的dha水平低于平常水平。表2显示了饮食a、b、c和d的营养含量。青鱼油是购买的，并且在nrc(2011)中可以找到青鱼油的典型脂肪酸含量。鱼油金枪鱼70dha成分是从爱德华兹国际公司(edwardsinternationalinc.)可商购的。表1：实验饮食的饲料配方(计算的)im代码成分a(对照)b(ap)c(ap-bm)d(ap-h400)55磷酸二钙(40％p205)4.0564.0004.0194.01959biolys1.5001.3431.3401.34060dl甲硫氨酸0.2740.0000.1110.111300鱼油青鱼9.1988.8781.0001.000302鱼油金枪鱼70dha1.8860.0001.0381.038304鱼油青鱼_schizo0.0000.00010.90710.907310低芥酸菜籽油12.0059.78310.59510.595320vit&min预混物0.2000.2000.2000.200330加丽素粉红(carophyllpink)0.0500.0500.0500.050500鱼粉青鱼5.0005.0005.0005.000510家禽副产品平均值(低灰分)16.56520.00017.79617.796550大豆蛋白浓缩物10.0006.8028.8768.876561玉米蛋白浓缩物20.00020.00020.00020.000565小麦谷蛋白粉10.0009.67110.00010.000567小麦粉9.2669.2749.0679.067572algaprime(ap)0.0005.0000.0000.000表2：计算的实验饮食的营养成分表3显示了实验饮食的计算的(cal.)和分析的营养组合物之间的比较。在表3中，avc和njfl是指进行分析的实验室。实验饮食中分析的粗蛋白比计算的高2％-4％。相反，分析的膳食粗脂质、dha和epa均低于计算值。实验室之间也观察到细微差异；计算的和分析的营养素之间的差异可以通过有时从一批到另一批不同的成分组合，以及从配方软件中规定的组合物不同的成分组合与分析方法的不确定性来解释。表3：计算的(cal.)和分析的营养组合物之间的比较饲养条件：盐水，在配备8个850升的圆形罐的循环水产养殖系统中。水保持在13.7℃±1.3℃，并且溶解氧饱和度>80％。每个实验饮食随机分配到两个罐中。样品收集：在开始制备9条鱼(汇集的)的鱼片并且在第28天、56天、84天和112天制备来自每个罐的3条鱼的鱼片。鱼片在http://primanor.com/salmon-fillet-trim-guide/上对应trime，即无皮的、修整过的(没有腹部脂肪)、鳍脱落的。唯一的例外是没有去除针状骨。在第84天和第112天收集每个处理组汇集的粪便物质。实验室分析：对每个罐(n＝33)汇集的每个罐中三条鱼的饮食(n＝4)、粪便(n＝8)和鱼片的蛋白质、脂质、灰分、干物质和总脂肪酸组合物进行近似分析。化学分析进行如下：干物质，在105℃16小时(aoac930.15)，灰分，在550℃和氮气下至少6小时(aoac990.03；使用78元素分析仪lecofp528，st.joseph，密歇根州，美国；粗蛋白质＝n×6.25)和脂质(bligh&dyer，1959)。根据mcniven等人(2011)确定饮食和鱼片的总脂肪酸含量。简而言之，根据sukhija和palmquist(1988)的程序制备脂肪酸甲酯(fame)，并在配有7673系列自动进样器和注射器、agilentdb23熔融石英毛细管柱(30m×0.53mmid×0.5m薄膜厚度)、fid检测器并与agilentchemstation软件(安捷伦科技加拿大有限公司，米西索加，加拿大)进行整合的hewlettpackard5890气液色谱仪上进行分析。操作条件是：柱上注射；烘箱温度，70℃保持0.5分钟，然后10℃/分钟至170℃并且保持3分钟，5℃/分钟至210℃并且保持6分钟，25℃/分钟至230℃并且保持4.2分钟；检测器温度，250℃；氢气作为载气，并且氮气作为补充气。添加十九烷酸作为内标，并使用fame标准(nu-chek-prep，伊利森，明尼苏达州，美国；matreya，愉悦隘口，宾夕法尼亚州，美国)鉴定色谱峰。使用公布的校正因子报告结果为mg/100mg的总脂肪酸(ackman，2002)。计算和统计分析：使用热量单位生长系数(tgc)计算生长速率：其中wf和w0分别是鱼的最终和初始体重，单位为g，n(＝1,2,…)是从w0记录的天数，ti(℃)是平均日水温。来自近似的和脂肪酸分析的结果用于使用以下等式(dumas等人，2007)描述营养素沉积的速率：其中dj是营养素j的沉积速率[mg(℃·d)-1]，fj和ij分别是84天结束和开始时营养素j(mg)的最终和初始全身重量，n代表覆盖从fj到ij时段的天数，ti(℃)是ti天的平均日水温，其产物以度-日为单位。进而，营养素沉积的速率用于使用dumas等人(2007)修改的以下等式估计营养素沉积的效率：其中edj是营养素j沉积的效率(％)[mg(鱼)-1]，inj(mg)是ti天的营养素j的每日摄入量。使用单向anova和tukey的多重比较测试与版本12.0.1(sas软件研究所公司，卡里，北卡罗来纳州，美国)来分析结果。4.0结果和讨论：初始体重(p＝0.590)、最终体重(p＝0.483)、tgc(p＝0.387)、采食量(p＝0.588)和饲料效率(p＝0.484)的处理之间没有观察到统计学差异(表4)。此外，饮食处理不会显著影响采食量和饲料效率(p值在0.44和0.90之间变化)。鲑鱼喂养饮食c(ap-bm)和d(ap-h400)的生长优于对照组和b(ap)的生长。在该研究中观察到的tgc值与用相同鲑鱼品种进行的其他研究是可比的(例如wolters等人，2009)。这些结果表明包含在鲑鱼饮食中的algaprime的持续生长性能和与鱼油相似的饲料转化率。表4显示了不含algaprime(对照)的、含algaprime粉(ap)的、含珠研磨的algaprime(ap-bm)的和含在400巴下均质化的algaprime(ap-h400)的大西洋鲑鱼喂养饮食的初始体重(ibw)和最终体重(fbw)体重、热量单位生长系数(tgc)、采食量(fi)和饲料效率(fe)。数据是平均数(标准偏差)；基于tukey测试(没有上标表示没有差异)，在没有共同上标的列中的平均值显著不同(p<0.05)。当与喂养对照饮食(不含algaprime)的鲑鱼相比时，饮食b、c和d的最终体重。热量生长系数从0.176增加到0.193，p<0.05。表4dha的利用和沉积：表5中显示了在该研究中大西洋鲑鱼鱼片中蛋白质(p＝0.626)、脂质(p＝0.185)、dha(p＝0.699)和epa(p＝0.256)浓度的处理之间观察到的差异。出乎意料地，用在400巴下均质化的algaprime获得鱼片中的最高含量的dha。在该研究中，鱼片组合物不被饮食处理显著影响(表5)。大西洋鲑鱼片(fp)中的蛋白质含量与文献一致(例如等人，1993)。然而，观察到脂质和脂肪酸的更多变化。鱼片的脂质含量(fl)低于等人(1993)和acharya(2011)观察到的脂质含量，但仍在fao报告的范围内(http://www.fao.org/wairdocs/tan/x5916e/x5916e01.htm)。与当地杂货店购买的来自智利和加拿大的大西洋鲑鱼鱼片相比，在该研究中dha(fdha)和epa(fepa)的含量分别高出近5x和2x(附录2)。相反，从当地杂货店购买的大西洋鲑鱼的dha+epa水平比我们的研究(例如kousoulaki等人，2015；sprague等人，2016)高至少2x。在kousoulaki等人(2016)的研究中，鱼片的dha和epa含量与本研究是相当的，分别在0.7％和0.1％。这些差异可以至少部分地通过膳食脂质来源的脂肪酸含量和可以影响脂质和脂肪酸结果的鱼片的修整来解释。表5显示了鲑鱼鱼片的蛋白质和脂质含量。不含algaprime(对照)的、含algaprime粉(ap)的、含珠研磨的algaprime(ap-bm)的和含在400巴下均质化的algaprime(ap-h400)的大西洋鲑鱼喂养饮食的初始和最终鱼片蛋白(fp)、脂质(fl)、二十二碳六烯酸(fdha)和二十碳五烯酸(fepa)。数据是平均数(标准偏差)；基于tukey测试，在没有共同上标的列中的平均数显著不同。初始样品是在开始喂养研究(处理)之前的鲑鱼片。表5：粪便的dha含量：确定粪便的dha含量。除了饮食b(ap)，粪便的dha含量比饮食低约75x，这表明大多数膳食dha被用这些其他饮食喂养的鲑鱼的消化道吸收(表6)。来自鲑鱼喂养饮食b(ap)的粪便中dha含量显著高于来自其他处理的粪便中dha含量(p<0.05)。与更多处理的ap相比，来自ap粉中dha的可用性可能更低，但这一假设需要得到验证。虽然我们没有在该研究中估计消化率系数，但我们在之前的一项试验中证明了来自ap的dha消化率高达约95％(dumas，2016)。不含algaprime(对照)的、含algaprime粉(ap)的、含珠研磨的algaprime(ap-bm)的和含在400巴下均质化的algaprime(ap-h400)的大西洋鲑鱼喂养饮食的饮食和粪便中的二十二碳六烯酸(dha)含量显示于表6中。数据是平均数(标准偏差)；基于tukey测试(没有上标表示没有差异)，在没有共同上标的列中的平均数显著不同。用饮食b喂养的鲑鱼粪便中dha的量不同，p<0.05。因此，以裂解的藻类浆液的形式提供给鲑鱼的dha导致鲑鱼比作为未裂解的藻类生物质掺入干饲料中提供给鲑鱼时的更好的吸收。表61对饮食没有进行重复。与其他处理相比，喂养饮食b和c的鲑鱼鱼片在第一个月内dha水平增加的更快(图1)。在第28天，在样品1和2中，喂养饮食d的鲑鱼鱼片的dha含量分别为0.27％和0.45％。0.27％的样品可视为离群值。在这种情况下，鱼片中的dha含量在饮食d和对照之间是相同的。总体而言，在研究的一到两个月之间达到了最高的dha水平，并且之后对喂养含ap饮食的鲑鱼的水平保持相对相似。参见图7蛋白质、dha和epa沉积：当与喂养鱼油的鱼相比时，大西洋鲑鱼鱼片中蛋白质、dha和epa沉积的速率增加(表7)。蛋白质、dha和epa沉积速率的p值分别为p＝0.417、p＝0.639和p＝0.197。用在400巴下均质化的algaprime观察到dha的最高沉积速率，这与喂养相同处理的鲑鱼鱼片中报告的最高dha含量一致(上表5)。在饮食b(ap)情况下下记录最低的dha沉积，这也导致含有最高dha含量的粪便，如表6所报告。因此可以合理地得出结论，ap粉(饮食b)的dha是较少可用的。喂养algaprime粉(饮食b)的鲑鱼鱼片中的脂质沉积(ld)低于对照(鱼油)和在400巴下处理的algaprime(表7)。这种差异可以通过与均质化的algaprime相比在algaprime粉中较低的脂质消化率来解释。不含algaprime(对照)的、含algaprime膳食(ap)的、含的algaprime珠研磨(ap-bm)和含在400巴下均质化的algaprime(ap-h400)的大西洋鲑鱼喂养饮食的鱼片中(无皮的，修整的)的蛋白质(pd)、脂质(ld)、二十二碳六烯酸(dhad)或二十碳五烯酸(epad)的沉积速率显示在表7中。数据是平均数(标准偏差)；基于tukey测试(没有上标表示没有差异)，在没有共同上标的列中的平均数显著不同。均质化和非均质化的algaprime都增加了鲑鱼的蛋白质沉积。此外，二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸沉积的量随着均质化的藻类生物质而增加。喂养algaprime粉(饮食b)的鲑鱼鱼片中的脂质沉积(ld)显著低于(p＝0.024)对照(鱼油)和在400巴下处理的algaprime(表5)。这种差异可以通过与均质化的algaprime相比在algaprime粉中较低的脂质消化率来解释。因此，当与在水产养殖饲料中直接包含藻类细胞相比，在鲑鱼饮食中作为涂覆在挤出的颗粒上的浆液包含藻类细胞显著增加了脂质沉积。表7algaprime和鱼油导致蛋白质(p＝0.397)、脂质(p＝0.205)、dha(p＝0.239)和epa(p＝0.371)沉积的效率更高(表8)。dha沉积的效率(edhad)与膳食dha含量/可用性成反比(roselund等人，2016；kousoulaki等人，2016)。本文公开的结果证实了这一观察结果(图6)。因此，低edhad值可以通过饮食中高水平的可用dha来解释，并且不一定意味着dha的一种来源优于另一种。使用表3中报告的avc的实验室结果计算营养素沉积的效率。表8显示了不含algaprime(对照)的、含algaprime膳食(ap)的、含algaprime珠研磨(ap-bm)的和含在400巴下均质化的algaprime(ap-h400)的大西洋鲑鱼喂养饮食的鱼片中(无皮的，修整的)的蛋白质(epd)、脂质(eld)、二十二碳六烯酸(edhad)或二十碳五烯酸(eepad)沉积的效率。数据是平均数(标准偏差)；基于tukey测试(没有上标表示没有差异)，在没有共同上标的列中的平均数显著不同。均质化和非均质化的algaprime都增加了蛋白质沉积的效率。脂质沉积的效率随着均质化的藻类生物质而增加。此外，二十碳五烯酸沉积的效率随着均质化的藻类生物质而增加。表87实例6.裂殖壶菌的低氯耐受菌株高水平氯化物的存在对工业设备(包括发酵罐、管道、泵和其他单元)造成腐蚀挑战。氯化物的减少提供了用于培养和加工富含dha的生物质的设备中较低腐蚀电位的益处。将裂殖壶菌培养物在减少的氯化物培养基中连续培养，直至群体进化并且能够实现与原始全氯化物培养基中的亲本菌株相似的生长。筛选进化群体的分离物以鉴定适合在氯化物水平降低的培养基中培养的菌株。裂殖壶菌菌株s9026被用作对低氯化物耐受性的进化的来源培养物。通过测量750nm处的吸光度，在这些培养物中的生长作为光密度(od)被监测。在-80℃用20％(w/v)甘油冷冻保存的s9026细胞(1.5ml)在环境温度下解冻并用于接种250ml带挡板的烧瓶中的含有8.4mm氯化物的50mlo3sf25培养基(表9和10)。然后将该细胞培养物在旋转振荡器上在28℃和200rpm下以2英寸冲程孵育24小时，直至od750的范围为3-6。使用5％的所得初级种子培养物在250ml带挡板的烧瓶中接种50ml含有0.25mm氯化物(氯化物减少97％)的改性的o3sf25培养基。将减少的氯化物培养物在旋转振荡器上在28℃和200rpm下孵育直至其最终od750达到3-6。与在24小时内达到目标生长的s9026的原代培养物相反，减少的氯化物培养物需要4-5天以达到目标生长，这表明s9026需要氯化物。将得到的细胞培养物在250ml带挡板的烧瓶中连续传代培养4次到具有0.25mm氯化物的改性的o3sf25培养基中，直至其细胞生长速率与其在o3sf25培养基中的亲本菌株s9026的细胞生长速率相似。如果进入含有0.25mmcl的改性的o3sf25培养基中的1％-5％v/v接种物在24小时内能够达到od3-6，则估计生长速率是相似的。将最终的传代培养物(表示为s9026-mf5-1-0.25mmcl)铺板在gyps琼脂上，并且筛选单菌落用于脂质产生。表9.确定的或改性的o3sf25培养基的组合物表10.das3维生素原料溶液的组成表11.c-痕量7的组合物(痕量金属原料溶液)从s9026-mf5-1-0.25mmcl中挑取的80个分离物在含有10ml含有0.25mm氯化物的改性的o3sf25培养基的50ml生物反应器管中筛选，如下所述。将每种分离物以96孔块培养形式接种到0.8ml改性的o3sf25培养基(0.25mmcl)中，并且然后在28℃和在900rpm下在multitron振荡器上孵育20-24小时以制备初级种子培养物。将所得的初级种子培养物以4％(v/v)接种到50ml生物反应器管中的9.6ml改性的o3sf25培养基(0.5mm氯化物)中。将生产生物反应器管在28℃和200rpm下在旋转振荡器上孵育3天，并且然后收获用于脂质测定。亲本菌株s9026也在o3sf25(8.4mmcl)中平行培养作为对照。从初步筛选中鉴定出两个具有良好脂质生产力和脂质中dha含量的分离物，并且然后分别冷冻保存为s9179和s9180。冷冻保存后，证实s9179和s9180在减少的氯化物培养基(具有0.5mmcl的改性的o3sf25)中提供了与亲本菌株相当的脂质产生和脂质中的dha含量。还使用与用于s9026评价相当的的350mmnh4,n/p16，在高细胞密度补料分批发酵过程中在3-l实验室规模发酵罐(applikon，荷兰)中评价s9179和s9180。为了培养s9026，种子阶段典型地包括在烧瓶中在o3sf25(8.4mmcl)中的培养，并以10％v/v接种到含有10-11mmcl的生产培养基中。为了评价s9179和s9180，种子烧瓶阶段在改性的o3sf25(0.25mmcl)中培养，并且将生产培养基改性为达到1mmcl(表12)。为了促进蔗糖水解，在发酵开始时添加1.5ml/l的20g/l的maxvert转化酶溶液(过滤灭菌的)。培养物在28℃培养，通气速率为1.0vvm。使用灭菌的vhp糖浆(70％w/w)作为碳原料，并使用do响应算法(按需脉冲进料至每次注射<10g/l总糖量)进料。通过添加酸(16％w/w的h2so4)和碱(28％w/w的氢氧化铵，然后是10％w/w的naoh)自动将ph维持在5.1±0.2。通过自动控制搅拌(500-1250rpm)，然后纯氧补充(0-100％)，将溶解氧(do)水平保持在空气饱和度的≥20％。使用硫酸铵(50mmnh4+批次)和氢氧化铵(300mmnh4+)作为氮源。根据需要，对发酵液进行取样以确定发酵液中的dcw、脂质滴度和脂肪酸组成、总固体和残余糖浓度。表12.确定的发酵罐中的分批发酵培养基的组成组分s9026发酵培养基cl减少的发酵培养基kh2po42.94g/l2.94g/l(nh4)2so43.3g/l3.3g/lna2so412g/l12g/lmgso4·7h2o2.68g/l2.68g/lkcl0.5g/l0.06g/lcaso4·2h2o-0.26g/lcacl2·2h2o0.22g/l-消泡剂西格玛2040.225ml/l0.225ml/lvhp70蔗糖40g/l40g/lc-痕量71.83ml/l1.83ml/ldas34.21ml/l4.21ml/l两个菌株s9179和s9180在生物质和脂质产生/产量、脂质中的dha含量和发酵罐中的dha产率/产量方面显示出相当的菌株性能。虽然已经结合其具体实施例描述了本发明，但应该理解的是能够对本发明进行进一步修改。本申请意在涵盖任何一般而言依循本发明的原理的变化、用途或改编，且包括这样的偏离当前披露的内容：其在本发明所属领域的已知或惯常操作内、且可适用于此前所示的特征。当前第1页12当前第1页12