紫菜多糖锌配合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及饲料添加剂领域，具体而言，涉及紫菜多糖锌配合物及其制备方法和应用。

背景技术

锌对动物机体的健康生长有着十分重要的意义，也是一种必不可少的微量元素，几乎所有的动物组织器官中都含有锌。同时，动物体内至少有300种酶中也含有锌，这些锌承担着不同的生物学功能，在动物的生长发育、免疫、物质代谢及繁殖等多方面起着重要作用。

紫菜是中国沿海常见的水产品，产量丰富。大量研究发现紫菜多糖(porphyrapolysaccharide,pp)具有抗凝血、降血脂、抗突变、抗氧化和抗放射等多种生物学活性。

为了改善动物的生长性能，多以添加有锌制剂的饲料进行饲喂。然而，目前动物饲料中添加的多为氧化锌、硫酸锌等无机锌，高浓度的锌会对于机体产生毒副作用，同时无机锌的吸收利用率差，90％的锌在粪便中排出体外，污染环境，目前国家已严格限制猪饲料中锌的添加量。

因此，找出一种高效、无毒、无污染的锌添加剂产品对于规模化养猪具有十分重要的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种紫菜多糖锌配合物，本发明紫菜多糖锌配合物在动物体内吸收率高、排放少，无毒害作用，且不会产生重金属污染。

本发明的第二目的在于提供一种所述的紫菜多糖锌配合物的制备方法。

本发明的第三目的在于提供一种所述的紫菜多糖配合的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种紫菜多糖锌配合物，所述紫菜多糖锌配合物由紫菜多糖与锌盐反应制备得到。

同时，本发明还提供了所述的紫菜多糖锌配合物的制备方法，包括：向溶有紫菜多糖和锌盐的溶液中加入碱液以调节体系ph，加热反应后将反应液醇沉并收集沉淀物；沉淀物纯化后浓缩干燥即得。

优选的，本发明所述的制备方法中，所述锌盐为硫酸锌、硝酸锌，或者对应水合物中的至少一种。

优选的，本发明所述的制备方法中，紫菜多糖和锌盐的质量比为1:3～3:1；更优选的，紫菜多糖和锌盐的质量比为1:2～2:1。

优选的，本发明所述的制备方法中，所述碱液包括：氢氧化钠/氢氧化钾溶液，以及氨水；

和/或，所述调节体系ph为调节体系的ph至6.5～7.5；更优选的，所述调节体系ph为调节体系的ph至7。

优选的，本发明所述的制备方法中，所述纯化包括：将所得沉淀物以溶剂洗涤后，进行透析处理。

同时，本发明还提供了所述的紫菜多糖锌配合物在增加断奶仔猪肠道内菌群丰富度中的应用；和/或，紫菜多糖锌配合物在增加断奶仔猪肠道内有益菌的数量中的应用；和/或，紫菜多糖锌配合物在缓解因免疫应激引起的断奶仔猪肠道菌群失衡中的应用。

同样的，本发明也提供了所述的紫菜多糖锌配合物在增强断奶仔猪机体免疫力，增强机体抗应激能力中的应用。

进一步的，本发明还提供了所述的紫菜多糖锌配合物在饲料添加剂中的应用；优选的，所述饲料添加剂为断奶仔猪饲料添加剂。

同时，本发明也提供了包含本发明紫菜多糖锌配合物的饲料。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明制备方法操作简单，且原料紫菜来源丰富，以紫菜为原料制备紫菜多糖、并进一步通过反应得到紫菜多糖锌配合物，能够解决传统锌添加剂所存在的吸收问题，在目前严格控制猪生产中饲料锌添加量的情况下，紫菜多糖锌配合物可作为一种新型、环保、健康的锌添加剂替代品。

同时，本发明紫菜多糖锌配合物不仅能够改善断奶仔猪的免疫力和抗氧化应激性，更是具有改善断奶仔猪肠道菌群丰富度的功效，是一种良好的营养补充和功能改善添加剂。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为紫菜多糖锌配合物对仔猪肠道内微生物丰富度影响检测结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明所提供的紫菜多糖锌配合物，是一种新型饲料用锌添加剂，能够解决无机锌添加剂在吸收和动物排放污染等方面所存在的问题。

同时，本发明紫菜多糖配合物还能够起到提高断奶仔猪机体的血液抗氧化能力，缓解断奶仔猪因脂多糖(lps)免疫所产生免疫应激的作用；而且还具有改善仔猪肠道微生物丰富度，增加肠道内有益菌的数量，缓解因免疫应激(lps免疫应激)引起的仔猪肠道菌群失衡的功效。

具体的，本发明紫菜多糖配合物可以由如下方法制备得到：

(a)分别将紫菜多糖和锌盐(硫酸锌，硫酸锌水合物，硝酸锌，硝酸锌水合物中的一种或多种)加入蒸馏水中搅拌溶解；

其中，紫菜多糖和锌盐的质量比1:3～3:1，优选为1:2～2:1，更优选为2:1。

(b)向所得溶液中加入碱液，以调节体系的ph至6.5～7.5(优选为7)；

其中，所用碱液为naoh/koh溶液，以及氨水；优选为naoh溶液和氨水；

具体的，可以先以浓度为0.5mol/l的naoh溶液调节体系的ph至接近中性，然后以浓度为1％(m/m)的氨水调节体系的ph至7。

(c)调节ph后，反应体系在70℃加热条件下反应60min，反应结束后，自然冷却至室温；

然后，加入乙醇(浓度大于95％，优选为无水乙醇)醇沉过夜，过滤/离心收集沉淀物。

(d)将所得沉淀物以有机溶剂进行洗涤，优选的分别以无水乙醇、95％乙醇、丙酮、乙醚进行洗涤，具体可以采用淋洗或者浸泡的方式进行洗涤；

洗涤后，采用过滤或者离心的方式，收集沉淀。

(e)将洗涤后的沉淀以蒸馏水复溶，然后通过透析的方式进行再次纯化，将透析所得产物浓缩干燥后，得到产物紫菜多糖锌配合物。

如上方法所得到的紫菜多糖锌配合物可以进一步作为饲料添加剂使用，特别是作为仔猪断奶饲料的锌添加剂使用，从而起到改善仔猪免疫功能，提高仔猪抗氧化应激能力，以及改善肠道菌群丰富度的功效。

实施例1

称取2g紫菜多糖以及1gznso4·7h2o，溶解于10ml蒸馏水中，于70℃水浴中搅拌充分，3000r/min离心10min，缓慢吸取上清液，除去溶液中的杂质。配制0.5mol/l的naoh溶液以及质量浓度为1％氨水，依次加入反应体系中，在ph计准确监测条件下，将反应体系ph值调节至7。

反应体系在70℃水浴条件下，反应60min。反应结束后，自然冷却至室温，以无水乙醇醇沉过夜，离心收集沉淀，分别以无水乙醇、95％乙醇、丙酮、乙醚浸泡沉淀，并用玻璃棒搅拌荡洗沉淀物，离心收集沉淀。

透析袋处理：将透析袋放入2％nahco3和1mmol/l的edta(ph＝8)混合液中煮沸10min，然后以蒸馏水洗净，再放入蒸馏水中煮沸10min，冷却置于4℃冰箱备用(透析袋处理需要戴手套，处理后保证透析袋浸没于保存液中)。

将离心所得的紫菜多糖锌配合物粗品用蒸馏水充分复溶，装入透析袋中夹紧，磁力搅拌透析24h，透析后样品经旋转蒸发浓缩，冷冻干燥48h，得到棕白色紫菜多糖锌配合物，收率为55.45％

实施例2

称取3g紫菜多糖以及1gznso4·7h2o，溶解于10ml蒸馏水中，于70℃水浴中搅拌充分，3000r/min离心10min。配制0.5mol/l的naoh溶液以及质量浓度为1％氨水，依次加入反应体系中，在ph计准确监测条件下，将反应体系ph值调节至7。

然后，参照实施例1的方法，得到实施例2的紫菜多糖锌配合物，收率为：52.46。

实施例3

称取2g紫菜多糖以及1gznso4·7h2o，溶解于10ml蒸馏水中，于70℃水浴中搅拌充分，3000r/min离心10min。配制0.5mol/l的naoh溶液以及质量浓度为1％氨水，依次加入反应体系中，在ph计准确监测条件下，将反应体系ph值调节至6.5。

然后，参照实施例1的方法，得到实施例3的紫菜多糖锌配合物，收率为：51.73％。

实施例4

称取2g紫菜多糖以及1gzn(no3)2·6h2o，溶解于10ml蒸馏水中，于70℃水浴中搅拌充分，3000r/min离心10min。配制0.5mol/l的naoh溶液以及质量浓度为1％氨水，依次加入反应体系中，在ph计准确监测条件下，将反应体系ph值调节至7.5。

然后，参照实施例1的方法，得到实施例4的紫菜多糖锌配合物，收率为：48.65％。

实验例1

准确称取原料紫菜多糖以及实施例1-4紫菜多糖锌配合物各50mg，按照gbt13885-2003处理样本以及配置标准曲线，样本上样检测按照乙炔火焰原子吸收仪操作说明，得到样品中的含锌量，计算样本中的锌含量百分比。

实验结果显示，反应后产物中锌原子含量明显增加，说明紫菜多糖与锌发生螯合反应，即生成紫菜多糖锌配合物。

实验例2紫菜多糖锌配合物使用效果试验

检测材料：过氧化氢酶(cat)测定试剂盒，丙二醛(mda)测定试剂盒，超氧化物歧化酶(t-sod)测定试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)(以上试剂盒均来自南京建成生物工程研究所)；

28±1日龄的杜洛克×长白×大白三元阉公仔猪50头。

试验方法：将公仔猪按体重相近原则随机分为5组，分别为：空白对照组a组、硫酸锌添加组组b组、紫菜多糖低剂量组c组、中剂量组d组、高剂量组e组，每组10头断奶仔猪；

其中，a组饲喂基础饲粮，b组饲喂添加1000mg/kg硫酸锌的基础饲粮，c、d、e组分别饲喂添加1000、3000和5000mg/kg紫菜多糖锌配合物的基础饲粮(a、b、c、d、e组所用基础饲料中不含锌)。

试验开始后进入预试验期3d，以适应试验日粮。随后进行试验期30d。试验结束，禁食12h后，b、c、d、e组按体重腹腔注射100μg/kg的lps，a组注射等量的生理盐水。

样品采集：仔猪前腔静脉釆血，3500r/m离心15min，分离血清用于抗氧化能力的测定。

肠道内容物的样品采集：试验动物颈静脉放血处死，打开腹腔，将肠道从其肠系膜处取下后于冰上取样。取出盲肠，挤出10g盲肠内容物样品立即装入经灭菌(1×105pa，121℃灭菌60min)处理的10ml离心管中，放入-40℃低温冰箱保存，待送检。

cat和gsh-px采用比色法测定、mda采用苯巴比妥法测定、t-sod采用黄嘌呤氧化法测定具体操作步骤按试剂盒说明书进行；肠道菌群丰富度由上海派诺森生物公司检测。

使用“平均值±标准差”表示试验数据，spss17.0软件进行单因素分析，duncan氏多重比较检验。上标字母相同或不标字母表示差异不显著(p>0.05)，字母不同表示差异显著(p<0.05)。

紫菜多糖锌配合物对免疫应激仔猪血清抗氧化指标的影响试验检测结果如下表1所示：

表1紫菜多糖锌配合物对免疫应激仔猪血清抗氧化指标的影响

由如上表1的实验数据可知，b、c、d、e组血清mda含量和血清t-sod活性较空白组(a组)有显著性的提高，cat活性也呈现显著性的提高。由此可见，仔猪在注射lps后，血清中自由基含量大量增加，机体进入免疫应激状态。同时，紫菜多糖锌配合物添加组的血清t-sod和gsh-px活性与硫酸锌添加组b组相比都有显著性的提高，血清mda含量显著性的降低。

综合如上分析可知，在饲料中添加紫菜多糖锌配合物可以使得酶类自由基清除系统活性提高，增强机体的血液抗氧化能力，有效缓解断奶仔猪因lps免疫的免疫应激。

紫菜多糖锌配合物对仔猪肠道内微生物丰富度影响检测结果如图1所示。

由图1所示的检测结果可知，相较于a组而言，b组在菌群组成上更为单一，以betaproteobacteria和clostridia为优势菌纲，其丰度分别为40.8％和50.9％；同时a组以bacilli为优势菌纲，丰度为38.5％。a组bacilli菌纲中的lactobacillaceae丰度为38.5％，远高于b组的4.5％，b组betaproteobacteria菌纲的burkholderiaceae丰度为34.5％，clostridia菌纲的clostridiacea丰富为46.1％。clostridiaceae具有耐高温，抗逆性强等特性；lactobacillaceae是仔猪肠道内的有益菌，说明仔猪腹腔注射lps导致仔猪体温升高，耐受能力较强的clostridiaceae以及革兰氏阴性菌betaproteobacteria可以存活。

同时，相较于b组而言，紫菜多糖锌添加组的菌群丰富度明显提高，且更为稳定，菌群组成也较为平均，lactobacillaceae有明显的上升。与添加相同剂量的c组相比较，c组以clostridiacea和burkholderiaceae为优势菌，但所占比例较b组有所下降，分别为35.3％和18.5％，且菌科较b组丰富。其中e组的lactobacillaceae的丰度为各组最高，达到43.1％，其他菌群的丰富也较为平均，clostridiaceae的丰度为各组最低，为5.2％，ruminococcaceae为6.7％，betaproteobacteria菌纲的burkholderiaceae的丰度为12％，在注射lps的免疫应激各组中丰度最低。

综合如上分析可知，本紫菜多糖锌可提高断奶仔猪的肠道微生物丰富度，同时可以增加肠道内有益菌的数量，对免疫应激引起的仔猪肠道菌群失衡有一定的缓解作用。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。