本发明涉及一种双层微囊化的益生元、益生菌组合物及其制备方法，属于生物医药技术领域。
背景技术：
益生元是一种膳食补充剂，是膳食纤维的一种，它可通过选择性的刺激细菌的生长和活性，产生对人体有益的影响。这些复杂的碳水化合物在小肠内不被消化，在结肠可优先促进双歧杆菌和植物乳杆菌的生长。对人体来说，益生元的利用方式是肠道菌群吸收。
肠道菌群中的益生菌是对人体有益的健康细菌微生物，可以直接作用于肠道，通过抑制有害菌生长来调理肠道菌群，提高肠道机能，促进营养物质的吸收，增强免疫力。而益生元作为益生菌的“食物”，改善益生菌的生长环境，间接调节肠道健康。因此益生元与益生菌是相辅相成，共同改善人体健康。
现有技术中，关于益生元和益生菌组合物的报道较多。如，中国专利文献cn108606329a公开了一种益生元、益生菌复合微生态制剂及其制备方法。该发明将开菲尔粒与枯草芽孢杆菌按照3:1比例混合，按发酵液体积的3～10％将益生菌混合菌种接种于培养基中，发酵培养，添加益生元，同时加入脱脂乳粉、海藻糖、谷氨酸钠、甘油作为保护剂，混合均匀后进行低温喷雾干燥制得微生态制剂。该发明能够起到调节机体胃肠道平衡，增强机体免疫力功效；但采用喷雾干燥技术，存在耗能高、设备配置要求高的问题，继而导致益生元、益生菌组合物产业化的成本较高；同时，用该方法制备的微胶囊囊壁致密性不好，影响产品的质量及货架期；并且包埋率低，芯材可能粘附在微胶囊颗粒的表面从而影响产品的质量，所得微生态制剂不能有效抵御低ph胃酸侵蚀、避免胆汁破坏，定向缓释控释效果欠佳，对调节肠道菌群的作用欠佳。又如，中国专利文献cn105595359a公开了一种定位缓释微囊益生菌及其制备方法；该发明定位缓释微囊益生菌由内至外依次包括菌体层、酸性包埋吸附层以及复合离子层；菌体层包括益生菌和益生元，酸性包埋吸附层包括酸性物质，复合离子层包括碱性物质；本发明的制备方法，通过将益生菌菌种活化后培养，生长至稳定期终止发酵，离心后收集菌体，在菌体中加入益生元得到菌悬液，将菌悬液与酸性物质成比例混合搅拌后，再与碱性物质成比例混合搅拌，得到双层微囊菌液，将双层微囊菌液冻干处理制得。该发明制得的微囊能够达到定位缓释的效果；但该制备方法中采用酸性和碱性物质，它们会与益生菌接触，从而会影响益生菌的生物活性，从而影响益生菌的包埋效果。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种双层微囊化的益生元、益生菌组合物及其制备方法。本发明制备方法避免了喷雾干燥等高耗能工艺，降低了生产成本；本发明特定的双层微囊结构为不稳定的益生菌提供双重保护，免受外界环境及不良因素的影响(如光、温度、湿度、ph、胆汁等)，有效防止使用及储存过程中益生菌活性的降低，最大限度保持组合物的稳定性、活性和有效定植率，并且包埋效率高、包埋效果好。所得双层微囊化的组合物能够有效实现定向控释效果，能够有效调节肠道菌群平衡、改善机体免疫力。
术语说明：
室温：指25℃±5℃。
本发明的技术方案如下：
一种双层微囊化的益生元、益生菌组合物，包括壁材和芯材；
所述壁材包括：外壁材和内壁材；
所述外壁材包括如下质量份的原料制成：海藻酸钠15-70份，葡萄糖2-20份，益生元a6-55份；所述益生元a包括如下质量份的原料制成：β-环糊精3-30份，麦芽糊精3-25份；
所述内壁材包括如下质量份的原料制成：聚-l-精氨酸10-50份，益生元b25-79份；所述益生元b包括如下质量份的原料制成：壳聚糖20-45份，人参多糖1-5份，杏鲍菇多糖1-5份，菊粉1-14份，低聚果糖1-5份，低聚异麦芽糖1-5份；
所述芯材包括如下原料制成：益生菌和脱脂乳粉；所述益生菌按质量份计包括：长双歧杆菌2-10份、嗜酸乳杆菌2-10份、发酵乳杆菌2-10份、瑞士乳杆菌2-10份、副干酪乳杆菌2-10份、鼠李糖乳杆菌2-10份、嗜热链球菌2-10份。
根据本发明优选的，所述壁材和芯材的质量比为2-8:1。
根据本发明优选的，所述内壁材与外壁材的质量比为1-6:1。
根据本发明优选的，所述麦芽糊精的de值小于35。
根据本发明优选的，所述β-环糊精和麦芽糊精的质量比为1-2:1。
根据本发明优选的，所述壳聚糖重均分子量为800-2000，脱乙酰度≥85％。
根据本发明，所述海藻酸钠、聚-l-精氨酸、人参多糖、杏鲍菇多糖、菊粉、低聚果糖、低聚异麦芽糖均可市购获得，它们的性能均需符合国家标准要求。其中，人参多糖中多糖的质量含量≥50wt％、杏鲍菇多糖中多糖的质量含量≥30wt％。
根据本发明优选的，所述外壁材包括如下质量份的原料制成：海藻酸钠15-30份，葡萄糖5-15份，益生元a10-30份；所述益生元a包括如下质量份的原料制成：β-环糊精5-15份，麦芽糊精5-15份。
根据本发明优选的，所述内壁材包括如下质量份的原料制成：聚-l-精氨酸15-45份，益生元b32-70份；所述益生元b包括如下质量份的原料制成：壳聚糖25-40份，人参多糖1-5份，杏鲍菇多糖1-5份，菊粉3-10份，低聚果糖1-5份，低聚异麦芽糖1-5份。
根据本发明优选的，所述益生菌和脱脂乳粉的质量比为2-4.5:1。
根据本发明优选的，所述芯材中益生菌的活菌数≥100亿cfu/g；脱脂乳粉中蛋白质含量≥34wt％。
上述双层微囊化的益生元、益生菌组合物的制备方法，包括步骤：
(1)向益生菌中加入脱脂乳粉、甘油和nacl水溶液，充分混匀得菌悬液；
(2)向步骤(1)得到的菌悬液中加入聚-l-精氨酸、人参多糖、杏鲍菇多糖、菊粉、低聚果糖和低聚异麦芽糖的混合水溶液，混匀，得多糖-菌悬液；将cacl2水溶液与壳聚糖乙酸水溶液混匀，得固化剂；将多糖-菌悬液和固化剂混合，静置得沉淀，然后经洗涤、干燥得到单层微胶囊；
(3)将cacl2水溶液、β-环糊精和麦芽糊精混匀，加入步骤(2)得到的单层微胶囊，室温搅拌乳化20-30min后，加入海藻酸钠水溶液继续室温搅拌20-25min，再加入无菌双蒸水调ph至6-6.5；加入葡萄糖，混匀后固化得沉淀，然后经洗涤、冷冻干燥得双层微囊化的益生元、益生菌组合物。
根据本发明，所述益生菌可市购获得，为普通市售菌粉。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述益生菌还需进行如下处理：将长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌的菌粉混合，以2wt％的接种量接种于mrs培养基中，30-37℃条件下100r/min震荡培养24h，得活化菌液；然后以体积比为2％的接种量将活化菌液接种于与上述mrs培养基成分相同的培养基中，30-37℃条件下100r/min震荡培养24-48h；取菌液，3500-5000r/min离心15-20min，弃上层液体，即得益生菌菌泥。
优选的，上述所述mrs培养基，按重量百分比计，包括以下组份：蛋白胨5-20％，牛肉浸粉2-18％，酵母浸粉2-18％，葡萄糖12-28％，磷酸氢二钾2-6％，柠檬酸氢二胺2-6％，乙酸钠4-12％，碳酸钙0.4-0.8％，硫酸镁0.1-0.5％，硫酸锰0.01-0.05％，琼脂10-30％，吐温601-2％，各组分重量百分比之和为百分之百；所述mrs培养基的制备方法包括步骤：将上述各组份溶解于1000-2000ml蒸馏水中，调节ph为6.3-6.7，于115～125℃条件下高压(101kpa)杀菌10～20min，冷却至20～30℃即得。进一步优选的，所述蛋白胨为酵母蛋白胨；
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述nacl水溶液的质量浓度为0.9％，nacl水溶液和脱脂乳粉的质量比为2-6:1；甘油和脱脂乳粉的质量比为1.5-3:1。
根据本发明优选的，步骤(2)混合水溶液中，聚-l-精氨酸的质量浓度为0.2-0.7％。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述cacl2水溶液的质量浓度为2-6％；壳聚糖乙酸水溶液是将壳聚糖溶解于质量浓度为1-3％的乙酸水溶液中制备得到，所述壳聚糖乙酸水溶液中壳聚糖的质量浓度为0.5-3％；cacl2水溶液与壳聚糖的质量比为0.5-3:1。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述静置为室温静置15-20min。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述洗涤是使用无菌双蒸水充分洗涤3-5次；所述干燥是于二氧化硅干燥器内室温干燥3-5h。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述cacl2水溶液的质量浓度为2-6％；cacl2水溶液与β-环糊精的质量比为1-5:1。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述搅拌乳化的搅拌速率为3000-3500r/min。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述海藻酸钠水溶液的质量浓度为1-1.5％。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述固化温度为4℃，固化时间为1-1.5h。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述洗涤是使用无菌双蒸水洗涤3-5次；所述冷冻干燥时间为12-24h。
本发明的技术特点及有益效果：
1、本发明中的微囊化制备方法避免了喷雾干燥等高耗能工艺，降低了生产成本，保障产业化能够获得良好的收益；并且本发明的制备方法对益生菌的包埋效率高、包埋效果好。
2、本发明成功解决了外界环境及不良因素(如光、温度、湿度、ph、胆汁等)对益生菌的影响。本发明内、外壁材为不稳定的益生菌提供双重保护；内、外壁材中均加入益生元，生物相容性较好，其不仅对包埋产率和效率具有重要的影响，对组合物耐酸、胆汁性能也具有重要影响；并结合其它壁材原料，各壁材原料发挥相互协同作用，提高包埋产率和效率的同时，也提高了微胶囊对胃酸的耐受能力，能够更好的保护益生菌抵御低ph胃酸侵蚀，避免胆汁破坏，保证了益生菌能够定向控释。壁材中引入β-环状糊精和聚-l-精氨酸，可提高微胶囊的生物相容性，进一步提高益生菌的定位释放的能力。芯材中的脱脂乳粉能够保护益生菌的热敏性进而减少益生菌的损失，进一步最大限度保持组合物的稳定性、活性和有效定植率，有效防止使用及储存过程中益生菌活性的降低。
3、本发明中的益生元有助于调理肠胃，一方面，益生元使肠道还原电势降低，调节肠道正常蠕动；其次，作为益生菌的食物，它们可直达肠道，不受酸性胃液腐蚀破坏，产生挥发性脂肪酸，降低肠道ph，直接促活、增殖益生菌群，间接抑制有害菌的生长，保护肠道微生态。即本发明得到的双层微囊化的组合物能够有效实现定向控释效果，能够有效调节肠道菌群平衡、改善机体免疫力。
4、本发明益生菌为特定7种共生益生菌的组合，并且优选经过特殊处理，有利于提高益生菌的活性，更利于有效调节肠道菌群平衡、改善机体免疫力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明保护范围不限于此。
同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中，所用海藻酸钠，南京松冠生物科技有限公司有售；壳聚糖，武汉信之德生物科技有限公司有售，重均分子量为1150，脱乙酰度为90％；葡萄糖，武汉信之德生物科技有限公司有售；聚-l-精氨酸、低聚果糖，上海源叶生物科技有限公司有售；麦芽糊精，de值为20，山东西王糖业有限公司有售；脱脂乳粉，脱脂乳粉中蛋白质质量含量不低于非脂乳固体的34％，恒天然集团有售；人参多糖，多糖含量为50wt％，西安青芷生物技术有限公司有售；杏鲍菇多糖，多糖含量为30wt％，西安全奥生物科技有限公司有售；菊粉，苏州晖轩生物技术有限公司有售；低聚异麦芽糖，山东百龙创园生物科技有限公司有售；长双歧杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌，西安泽邦生物科技有限公司有售；发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌，西安千叶草生物科技有限公司有售；瑞士乳杆菌，西安新善生物科技有限公司有售；鼠李糖乳杆菌，西安泽邦生物科技有限公司有售；嗜热链球菌，河南希禾化工有限公司有售。
实施例1
一种双层微囊化的益生元、益生菌组合物，包括壁材和芯材；所述壁材和芯材的质量比为2:1；
所述壁材包括：外壁材和内壁材；所述内壁材与外壁材的质量比为1:1；
所述外壁材包括如下质量份的原料制成：海藻酸钠24份，葡萄糖5份，β-环糊精10份，麦芽糊精10份；
所述内壁材包括如下质量份的原料制成：聚-l-精氨酸15份，壳聚糖25份，人参多糖1份，杏鲍菇多糖1份，菊粉3份，低聚果糖2份，低聚异麦芽糖2份；
所述芯材包括如下质量份的原料制成：益生菌35份，脱脂乳粉14份，所述益生菌按质量份计包括：长双歧杆菌5份、嗜酸乳杆菌5份、发酵乳杆菌5份、瑞士乳杆菌5份、副干酪乳杆菌5份、鼠李糖乳杆菌5份、嗜热链球菌5份。
所述芯材中益生菌的活菌数≥100亿cfu/g。
上述双层微囊化的益生元、益生菌组合物的制备方法，包括步骤：
1)配制mrs培养基：按重量百分比计，培养基含有以下组分：酵母蛋白胨(山东玉宝生物科技有限公司有售)14％，牛肉浸粉(天津市利发隆化工科技有限公司有售)12％，酵母浸粉(河北丰味生物科技有限公司有售)12％，葡萄糖20％，磷酸氢二钾4.6％，柠檬酸氢二胺4.6％，乙酸钠10％，碳酸钙0.5％，硫酸镁0.46％，硫酸锰0.04％，琼脂20％，吐温60(山东金恒益化工有限公司有售)1.8％，将上述成分加热溶解于1500ml蒸馏水中，1mol/l盐酸调节ph为6.5，125℃条件下高压(101kpa)杀菌15min，冷却至26℃即得。
2)将长双歧杆菌菌粉5份、嗜酸乳杆菌菌粉5份、发酵乳杆菌菌粉5份、瑞士乳杆菌菌粉5份、副干酪乳杆菌菌粉5份、鼠李糖乳杆菌菌粉5份、嗜热链球菌菌粉5份混合，以2wt％的接种量接种于上述方法所得mrs培养基中，30℃条件下100r/min震荡培养24h，得活化菌液；然后以体积比为2％的接种量将活化菌液接种于上述方法所得mrs培养基中，30℃条件下100r/min震荡培养48h；取菌液，4000r/min离心15min，弃上层液体，即得益生菌菌泥。
3)向上述益生菌菌泥中加入14份脱脂乳粉、21份甘油和28份0.9wt％的nacl水溶液，充分混匀得菌悬液；
4)向步骤3)得到的菌悬液中加入含有聚-l-精氨酸15份、人参多糖1份、杏鲍菇多糖1份、菊粉3份、低聚果糖2份以及低聚异麦芽糖2份的混合水溶液，搅拌混匀，即为多糖-菌悬液；混合水溶液中聚-l-精氨酸的质量浓度为0.2％；
5)将13份4wt％cacl2水溶液与2500份质量浓度为1％的壳聚糖乙酸水溶液(由25份壳聚糖溶解于2475份质量浓度为1％的乙酸水溶液中得到)充分混合，即为固化剂，将搅拌子放到固化剂中，并置于磁力搅拌器上，恒速搅拌10min；
6)将多糖-菌悬液加入至上述固化剂中，加完后室温静置15min得沉淀，用无菌双蒸水充分洗涤3次，二氧化硅干燥器内室温干燥3h，得到单层微胶囊；
7)将10份4wt％cacl2水溶液、10份β-环糊精和10份麦芽糊精混匀，加入步骤6)得到的单层微胶囊，并置于磁力搅拌器上室温3000r/min下搅拌乳化20min后，加入质量浓度为1％的海藻酸钠水溶液继续室温搅拌20min，再加入无菌双蒸水调ph至6；加入5份葡萄糖，磁力搅拌5min混匀后，置于4℃冷藏固化1h，取沉淀，用无菌双蒸水洗涤3次，低温冷冻干燥12h，得双层微囊化的益生元、益生菌组合物。
实施例2
一种双层微囊化的益生元、益生菌组合物，包括壁材和芯材；所述壁材和芯材的质量比为4:1；
所述壁材包括：外壁材和内壁材；所述内壁材与外壁材的质量比为3:1；
所述外壁材包括如下质量份的原料制成：海藻酸钠15份，葡萄糖10份，β-环糊精5份，麦芽糊精5份；
所述内壁材包括如下质量份的原料制成：聚-l-精氨酸45份，壳聚糖40份，人参多糖3份，杏鲍菇多糖3份，菊粉8份，低聚果糖3份，低聚异麦芽糖3份；
所述芯材包括如下质量份的原料制成：益生菌28份，脱脂乳粉7份，所述益生菌按质量份计包括：长双歧杆菌4份、嗜酸乳杆菌4份、发酵乳杆菌4份、瑞士乳杆菌4份、副干酪乳杆菌4份、鼠李糖乳杆菌4份、嗜热链球菌4份。
所述芯材中益生菌的活菌数≥100亿cfu/g。
上述双层微囊化的益生元、益生菌组合物的制备方法，包括步骤：
1)配制mrs培养基：按重量百分比计，培养基含有以下组分：酵母蛋白胨(山东玉宝生物科技有限公司有售)15％，牛肉浸粉(天津市利发隆化工科技有限公司有售)12％，酵母浸粉(河北丰味生物科技有限公司有售)10％，葡萄糖20.5％，磷酸氢二钾5％，柠檬酸氢二胺5％，乙酸钠8％，碳酸钙0.55％，硫酸镁0.42％，硫酸锰0.03％，琼脂22％，吐温60(山东金恒益化工有限公司有售)1.5％，将上述成分加热溶解于1500ml蒸馏水中，1mol/l盐酸调节ph为6.5，120℃条件下高压(101kpa)杀菌20min，冷却至25℃即得；
2)将长双歧杆菌菌粉4份、嗜酸乳杆菌菌粉4份、发酵乳杆菌菌粉4份、瑞士乳杆菌菌粉4份、副干酪乳杆菌菌粉4份、鼠李糖乳杆菌菌粉4份、嗜热链球菌菌粉4份混合，以2wt％的接种量接种于上述方法所得mrs培养基中，37℃条件下100r/min震荡培养24h，得活化菌液；然后以体积比为2％的接种量将活化菌液接种于上述方法所得mrs培养基中，37℃条件下100r/min震荡培养24h；取菌液，5000r/min离心15min，弃上层液体，即得益生菌菌泥。
3)向上述益生菌菌泥中加入7份脱脂乳粉、12份甘油和14份0.9wt％的nacl水溶液，充分混匀得菌悬液；
4)向步骤3)得到的菌悬液中加入含有聚-l-精氨酸45份、人参多糖3份、杏鲍菇多糖3份、菊粉8份、低聚果糖3份以及低聚异麦芽糖3份的混合水溶液，搅拌混匀，即为多糖-菌悬液；混合水溶液中聚-l-精氨酸的质量浓度为0.5％；
5)将10份4wt％cacl2水溶液与500份质量浓度为2％的壳聚糖乙酸水溶液(由10份壳聚糖溶解于490份质量浓度为2％的乙酸水溶液中得到)充分混合，即为固化剂，将搅拌子放到固化剂中，并置于磁力搅拌器上，恒速搅拌15min；
6)将多糖-菌悬液加入至上述固化剂中，加完后室温静置20min得沉淀，用无菌双蒸水充分洗涤5次，二氧化硅干燥器内室温干燥5h，得到单层微胶囊；
7)将10份4wt％cacl2水溶液、5份β-环糊精和5份麦芽糊精混匀，加入步骤6)得到的单层微胶囊，并置于磁力搅拌器上室温3300r/min下搅拌乳化30min后，加入质量浓度为1.2％的海藻酸钠水溶液继续室温搅拌25min，再加入无菌双蒸水调ph至6.5；加入10份葡萄糖，磁力搅拌10min混匀后，置于4℃冷藏固化1.5h，取沉淀，用无菌双蒸水洗涤5次，低温冷冻干燥24h，得双层微囊化的益生元、益生菌组合物。
实施例3
一种双层微囊化的益生元、益生菌组合物，包括壁材和芯材；所述壁材和芯材的质量比为4:1；
所述壁材包括：外壁材和内壁材；所述内壁材与外壁材的质量比为6:1；
所述外壁材包括如下质量份的原料制成：海藻酸钠30份，葡萄糖15份，β-环糊精15份，麦芽糊精15份；
所述内壁材包括如下质量份的原料制成：聚-l-精氨酸30份，壳聚糖30份，人参多糖5份，杏鲍菇多糖5份，菊粉10份，低聚果糖5份，低聚异麦芽糖5份；
所述芯材包括如下质量份的原料制成：益生菌49份，脱脂乳粉10.9份，所述益生菌按质量份计包括：长双歧杆菌7份、嗜酸乳杆菌7份、发酵乳杆菌7份、瑞士乳杆菌7份、副干酪乳杆菌7份、鼠李糖乳杆菌7份、嗜热链球菌7份。
所述芯材中益生菌的活菌数≥100亿cfu/g。
上述双层微囊化的益生元、益生菌组合物的制备方法，包括步骤：
1)配制mrs培养基：按重量百分比计，培养基含有以下组分：酵母蛋白胨(山东玉宝生物科技有限公司有售)15％，牛肉浸粉(天津市利发隆化工科技有限公司有售)12％，酵母浸粉(河北丰味生物科技有限公司有售)10％，葡萄糖20.5％，磷酸氢二钾5％，柠檬酸氢二胺5％，乙酸钠8％，碳酸钙0.55％，硫酸镁0.42％，硫酸锰0.03％，琼脂22％，吐温60(山东金恒益化工有限公司有售)1.5％，将上述成分加热溶解于1500ml蒸馏水中，1mol/l盐酸调节ph为6.5，120℃条件下高压(101kpa)杀菌20min，冷却至25℃即得；
2)将长双歧杆菌菌粉7份、嗜酸乳杆菌菌粉7份、发酵乳杆菌菌粉7份、瑞士乳杆菌菌粉7份、副干酪乳杆菌菌粉7份、鼠李糖乳杆菌菌粉7份、嗜热链球菌菌粉7份混合，以2wt％的接种量接种于上述方法所得mrs培养基中，37℃条件下100r/min震荡培养24h，得活化菌液；然后以体积比为2％的接种量将活化菌液接种于上述方法所得mrs培养基中，35℃条件下100r/min震荡培养24h；取菌液，5000r/min离心15min，弃上层液体，即得益生菌菌泥。
3)向上述益生菌菌泥中加入10.9份脱脂乳粉、22份甘油和33份0.9wt％的nacl水溶液，充分混匀得菌悬液；
4)向步骤3)得到的菌悬液中加入含有聚-l-精氨酸30份、人参多糖5份、杏鲍菇多糖5份、菊粉10份、低聚果糖5份以及低聚异麦芽糖5份的混合水溶液，搅拌混匀，即为多糖-菌悬液；混合水溶液中聚-l-精氨酸的质量浓度为0.7％；
5)将45份4wt％cacl2水溶液与1500份质量浓度为2％的壳聚糖乙酸水溶液(由30份壳聚糖溶解于1200份质量浓度为2％的乙酸水溶液中得到)充分混合，即为固化剂，将搅拌子放到固化剂中，并置于磁力搅拌器上，恒速搅拌20min；
6)将多糖-菌悬液加入至上述固化剂中，加完后室温静置20min得沉淀，用无菌双蒸水充分洗涤5次，二氧化硅干燥器内室温干燥5h，得到单层微胶囊；
7)将45份4wt％cacl2水溶液、15份β-环糊精和15份麦芽糊精混匀，加入步骤6)得到的单层微胶囊，并置于磁力搅拌器上室温3500r/min下搅拌乳化30min后，加入质量浓度为1.5％的海藻酸钠水溶液继续室温搅拌25min，再加入无菌双蒸水调ph至6.5；加入15份葡萄糖，磁力搅拌10min混匀后，置于4℃冷藏固化1.5h，取沉淀，用无菌双蒸水洗涤5次，低温冷冻干燥24h，得双层微囊化的益生元、益生菌组合物。
对比例1
一种双层微囊化的益生元、益生菌组合物，该组合物如实施例1所述，所不同的是：内外壁材中均不加入益生元；其制备方法与实施例1一致。
对比例2
一种双层微囊化的益生元、益生菌组合物，该组合物如实施例1所述，所不同的是：芯材中不加入脱脂乳粉；其制备方法与实施例1一致。
对比例3
一种双层微囊化的益生元、益生菌组合物，该组合物如实施例1所述，所不同的是：外壁材中的益生元a加入到芯材中；
其制备方法与实施例1一致，所不同的是：
步骤3)：向益生菌菌泥中加入14份脱脂乳粉、21份甘油和28份0.9wt％的nacl水溶液、24份海藻酸钠、5份葡萄糖、10份β-环糊精和10份麦芽糊精；充分混匀得菌悬液；
步骤7)：向10份4wt％cacl2水溶液中加入步骤6)得到的单层微胶囊，并置于磁力搅拌器上室温3000r/min下搅拌乳化20min后，加入质量浓度为1％的海藻酸钠水溶液继续室温搅拌20min，再加入无菌双蒸水调ph至6；加入5份葡萄糖，磁力搅拌5min混匀后，置于4℃冷藏固化1h，取沉淀，用无菌双蒸水洗涤3次，低温冷冻干燥12h，得双层微囊化的益生元、益生菌组合物。
对比例4
一种双层微囊化的益生元、益生菌组合物，该组合物如实施例1所述，所不同的是：内壁材中不加入聚-l-精氨酸；其制备方法与实施例1一致。
试验例1
益生菌活菌包埋效率测定：
测定样品分别为实施例1和对比例1-4所得组合物。
样品表面活菌菌落数的测定：取1g样品3份，分别用1ml、2ml、4ml0.9wt％生理盐水分散，分别取分散后混合液各1ml加入培养皿中，加入5mlmrs培养基，37℃培养72h，依照gb/t-4789.35-2016对菌落进行计数并取平均值，所得平均值即为样品表面的活菌菌落数。
样品中含有的活菌菌落数的测定：将1g样品加入10ml0.2mol/l磷酸盐缓冲液中，待完全溶解后进行活菌菌落数计数。
益生菌菌泥中活菌菌落数的测定：无菌下取实施例1方法所得益生菌菌泥0.5g，加入4.5ml无菌生理盐水中，充分混匀，依次做梯度稀释，每次稀释倍数均为10倍，取各稀释度的稀释液0.05ml，均匀涂布在mrs培养基，放入37℃恒温培养箱培养24h，选择菌落数在10-200之间的稀释度作为最后稀释倍数，并取相应稀释液涂布于mrs培养基，并做3个平行板，放于37℃恒温培养箱培养24h后计数并取平均值，经计算得到益生菌菌泥中活菌菌落数为8.37×1012cfu/g。
样品中含有的活菌菌落数与样品表面活菌菌落数的差值就是胶囊内被包埋的活菌数。
包埋效率＝(1-样品表面活菌菌落数/样品中含有的活菌菌落数)×100％；
包埋产率＝(样品中含有的活菌菌落数/益生菌菌泥中的活菌菌落数)×100％；
样品的测试数据如下：
表1活菌菌落数计数表
以上实验结果表明，本发明制备的双层微囊化的益生元、益生菌组合物包埋效率可达到95.2％，包埋产率可达93.9％。本发明实施例1与对比例1对比表明，壁材中益生元的添加可以显著提高包埋效率和产率，说明益生元不仅可以刺激益生菌的增殖，也可以作为益生菌的保护剂，对益生菌具有较好的包埋效果。本发明实施例1与对比例2数据对比表明，脱脂乳粉可有效提高样品活菌数，保证足量的益生菌定植和增殖，进一步提高包埋效率和包埋产率。本发明实施例1与对比例3数据对比表明，益生元加入壁材中可以显著提高包埋产率和效率；对比例3样品表面活菌数增多，进一步说明壁材添加益生元可提高样品的稳定性，减少样品有效成分的损失，进一步延长样品的货架期。本发明实施例1与对比例4数据对比表明，内壁材中聚-l-精氨酸的加入对益生菌的包埋效果也会产生影响。综上可说明，本发明壁材中益生元的加入、芯材中脱脂乳粉的加入对包埋效果均具有重要的作用，并且结合其它原料，共同发挥协同作用，达到本发明的包埋效果。
试验例2
测定样品分别为实施例1、对比例1-4所得组合物。
将1g样品加入10ml人工模拟胃液中，在37℃、150r/min恒温振荡器中浸泡1h后，取出，测经浸泡后样品中的活菌数，计算益生菌溶出率(益生菌溶出率＝1-经浸泡后样品中的活菌数/浸泡前样品中的活菌数)。溶出率数据如表2所示。
将1g样品加入10ml人工模拟胃液中，在37℃、150r/min恒温振荡器中浸泡1h；然后于50ml人工模拟胆汁中，在37℃、150r/min恒温振荡器中浸泡1h后，取出，测浸泡后样品中的活菌数，计算益生菌溶出率(益生菌溶出率＝1-经浸泡后样品中的活菌数/浸泡前样品中的活菌数)。溶出率数据如表2所示。
表2益生菌溶出率数据表
由表2可知，本发明所得组合物耐胃酸、胆汁能力最强；对比例1由于内外壁材中无益生元的加入导致耐胃酸、胆汁能力最弱。上述数据说明本发明内外壁材中益生元的加入对组合物耐胃酸、胆汁的能力具有重要的作用，并结合其它原料共同发挥协同作用达到本发明耐胃酸、胆汁的效果。
试验例3
测定样品分别为实施例1、对比例1-4所得组合物以及未微囊化的共生益生菌即实施例所得益生菌菌泥。
将1g样品加入100ml人工模拟肠液中，在37℃、150r/min恒温振荡器中进行崩解实验，每隔10min测定人工模拟肠液的光密度(od600)，根据光密度数值变化分析样品在人工肠液中益生菌的释放情况。测试数据如下表3所示。
表3样品崩解特性表征数据表
由表3可知，实施例1在前60min内光密度无明显变化，在70min后迅速上升，然后在100min趋于稳定，说明本发明双层微囊化的益生元、益生菌组合物在模拟人工肠液前60min比较稳定，基本无释放，而之后益生菌迅速释放，30min内释放完全，释放速率较快。对比例2、对比例4与实施例1益生菌的释放开始时间以及完全释放时间大体一致。对比例1和实施例1相比较，益生菌释放开始时间较早，但完全释放所需时间较长；对比例3和实施例1相比较，由于对比例3外壁材中的益生元加入到芯材中，使得益生菌开始释放时间延长，完全释放时间也较长。上述数据说明本发明组合物在肠液中的崩解速率相对较快，利于组合物中益生元以及益生菌的充分利用。