一种大黄鱼卵分离蛋白-EGCG结合物的制备方法及其应用与流程

本发明涉及水产加工技术领域，涉及一种新型抗氧化剂的制备方法，更具体地说，涉及一种大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物的制备方法及其应用。

背景技术：

大黄鱼卵是大黄鱼加工过程中的主要副产物，约占鱼体总质量的15％～25％其蛋白质含量高达59.03±0.08％左右(以干重计)，目前，我国很多的大黄鱼卵除了被制成饲料外，其余的均被丢弃，这造成了极大的资源浪费及环境污染。前期研究表明大黄鱼卵分离蛋白具有优质的氨基酸组成及功能特性，但是其抗氧化活性较弱。

茶多酚是茶叶中的主要活性物质，具有抗氧化、抗衰老、杀菌、预防心脑血管疾病等诸多保健功效，现已成为医药、食品等方面开发的热点，茶多酚的主要化学成分为儿茶素类化合物。儿茶素类化合物主要包括表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)4种物质，其中egcg的含量最多，抗氧化活性最好。因此，如果可以将大黄鱼卵分离蛋白与egcg有效的结合在一起，可以有效的提高大黄鱼卵分离蛋白的抗氧化能力，结合产物兼具分离蛋白营养价值及egcg的抗氧化活性，可以作为一种新型的抗氧化剂应用于食品工业中。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点，本发明提供了一种大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物的制备方法，本发明所述方法具有条件温和、生产效率高的特点。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物的制备方法，包括如下步骤：

s1、制备大黄鱼卵分离蛋白溶液：将大黄鱼卵分离蛋白溶解于去离子水中，制备成分离蛋白溶液；所述大黄鱼卵分离蛋白和去离子水的重量体积比为(0.1～0.2):50g/ml；申请号为201811034409.x，《大黄鱼卵中蛋白及脂质的同步提取及组成特性研究》的发明专利申请中记载一种大黄鱼卵分离蛋白的制备方法，本发明所述大黄鱼卵分离蛋白可以选用该发明申请所述的制备方法制备的大黄鱼卵分离蛋白；

s2、自由基诱导分离蛋白：向步骤s1所述分离蛋白溶液中加入其0.02～0.025倍体积的5m过氧化氢溶液和l-抗坏血酸，搅拌混匀得大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液；所述l-抗坏血酸和分离蛋白溶液的重量体积比为(0.25～0.3):50g/ml；

s3、加入表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)：向步骤s2所述大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液中加入表没食子儿茶素没食子酸酯，搅拌混匀，得大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液；所述表没食子儿茶素没食子酸酯和大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液的重量体积比为(0.045～0.09):50g/ml；

s4、透析：使用1～3.5kda的透析膜及去离子水对步骤s3所述大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液进行透析，除去未结合的egcg，得大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物溶液；

s5、干燥：将步骤s4所述大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物溶液进行真空冷冻干燥，得到大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物。

优选方式下，步骤s2所述搅拌混匀具体为：25～30℃、300～400rpm搅拌2h。

优选方式下，步骤s3所述搅拌混匀具体为：25～30℃、300～400rpm搅拌20～24h。

优选方式下，步骤s4所述透析为：利用1～3.5kda的透析膜、去离子水对步骤s3所述大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液进行透析72～84h，所述去离子水的体积为所述大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液体积的15～20倍，每8h更换一次去离子水，透析温度为4℃。

优选方式下，步骤s5所述真空冷冻干燥参数为：1～5pa，-25℃～-50℃，干燥60～72h。

本发明的另一个目的是，提供一种所述大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物的应用，作为一种抗氧化剂，用于抗氧化。

优选的，所述抗氧化剂用于食品抗氧化。

一种抗氧化剂，在制备时加入所述大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物。

优选的，所述抗氧化剂为食品抗氧化剂。

本发明的有益效果是：

1、提高了大黄鱼加工过程中副产物的利用率，使其分离蛋白得到充分开发利用，同时减少了对环境的污染。

2、本发明开发了一种制备大黄鱼卵分离蛋白与egcg结合物的方法，制备条件温和且在制备过程中没有产生有害物质。所得结合物中egcg含量高达13.48mg/g大黄鱼卵分离蛋白，大黄鱼卵分离蛋白的dpph自由基清除能力为0.59μmoltrolox/mg样品；abts⁺自由基清除能力为0.24μmoltrolox/mg样品；还原能力为0.5174；而本发明制备的大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物的dpph自由基清除能力为1.40～1.46μmoltrolox/mg样品；abts⁺自由基清除能力为0.47～0.48μmoltrolox/mg样品；还原能力为0.7207～0.7362，均显著高于大黄鱼卵分离蛋白。这些结果表明本发明有效的提高了大黄鱼卵分离蛋白的抗氧化能力，且大黄鱼分离蛋白-egcg结合物可以作为一种新型的抗氧化剂应用于食品工业当中。

3、本发明涉及的操作过程简单，不需要复杂的设备，提高了生产效率，适合工业化生产。

附图说明

图1为本发明制备的大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物的egcg含量；

图2为本发明制备的大黄鱼卵分离蛋白、大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物的dpph、abts⁺自由基清除能力；

图3为本发明制备的大黄鱼卵分离蛋白、大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物的还原能力。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作详细说明，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例。

本发明提供了一种大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物的制备方法，本发明所述方法具有条件温和、生产效率高的特点。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物的制备方法，包括如下步骤：

s1、制备大黄鱼卵分离蛋白溶液：将大黄鱼卵分离蛋白溶解于去离子水中，制备成分离蛋白溶液；所述大黄鱼卵分离蛋白和去离子水的重量体积比为(0.1～0.2):50g/ml；所述大黄鱼卵分离蛋白的制备方法参考大黄鱼卵中蛋白及脂质的同步提取及组成特性研究，201811034409.x。

s2、自由基诱导分离蛋白：向步骤s1所述分离蛋白溶液中加入其0.02～0.025倍体积的5m过氧化氢溶液和l-抗坏血酸，搅拌混匀得大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液；所述l-抗坏血酸和分离蛋白溶液的重量体积比为0.25～0.3：50g/ml；

s3、加入表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)：向步骤s2所述大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液中加入表没食子儿茶素没食子酸酯，搅拌混匀，得大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液；所述表没食子儿茶素没食子酸酯和大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液的重量体积比为(0.045～0.09):50g/ml；

s4、透析：使用1～3.5kda的透析膜及去离子水对步骤s3所述大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液进行透析，除去未结合的egcg，得大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物溶液；

s5、干燥：将步骤s4所述大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物溶液进行真空冷冻干燥，得到大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物；

优选方式下，步骤s2所述搅拌混匀具体为：25～30℃、300～400rpm搅拌2h。

优选方式下，步骤s3所述搅拌混匀具体为：25～30℃、300～400rpm搅拌20～24h。

优选方式下，步骤s4所述透析为：利用1～3.5kda的透析膜、去离子水对步骤s3所述大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液进行透析72～84h，所述去离子水的体积为所述大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液体积的15～20倍，每8h更换一次去离子水，透析温度为4℃。

优选方式下，步骤s5所述真空冷冻干燥参数为：1～5pa，-25℃～-50℃，干燥60～72h。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中使用的表没食子儿茶素没食子酸酯厂家:宝希迪、商品号:989-51-5；l-抗坏血酸厂家:科密欧、商品号:50-81-7；过氧化氢厂家：上海生工生物工程有限公司、商品号：7722-84-1。

申请号为201811034409.x，《大黄鱼卵中蛋白及脂质的同步提取及组成特性研究》的发明专利申请中记载一种大黄鱼卵分离蛋白的制备方法，下述实施例所述大黄鱼卵分离蛋白选用该发明申请实施例1所述制备方法制备的大黄鱼卵分离蛋白。

实施例1

s1、制备大黄鱼卵分离蛋白溶液：将大黄鱼卵分离蛋白溶解于去离子水中，制备成分离蛋白溶液；所述大黄鱼卵分离蛋白和去离子水的重量体积比为0.1:50g/ml；

s2、自由基诱导分离蛋白：向步骤s1所述分离蛋白溶液中加入其0.02倍体积的5m过氧化氢溶液和l-抗坏血酸，在25℃、300rpm条件下搅拌混匀2h得大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液；所述l-抗坏血酸和分离蛋白溶液的重量体积比为0.25:50g/ml；

s3、加入表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)：向步骤s2所述大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液中加入表没食子儿茶素没食子酸酯，在25℃、300rpm条件下搅拌混匀20h，得大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液；所述表没食子儿茶素没食子酸酯和大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液的重量体积比为0.045:50g/ml；

s4、透析：使用1kda的透析膜及去离子水对步骤s3所述大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液进行透析72h，所述去离子水的体积为所述大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液体积的15倍，每8h更换一次去离子水，透析温度为4℃；

s5、干燥：将步骤s4所述大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物溶液在1pa，-50℃条件下真空冷冻干燥72h，得到大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物。

本实施例制备的结合物中egcg含量为13.24mg/g大黄鱼卵分离蛋白，dpph自由基清除能力为1.44μmoltrolox/mg样品，abts⁺自由基清除能力为0.47μmoltrolox/mg样品，还原能力为0.7246。

实施例2

s1、制备大黄鱼卵分离蛋白溶液：将大黄鱼卵分离蛋白溶解于去离子水中，制备成分离蛋白溶液；所述大黄鱼卵分离蛋白和去离子水的重量体积比为0.2:50g/ml；

s2、自由基诱导分离蛋白：向步骤s1所述分离蛋白溶液中加入其0.025倍体积的5m过氧化氢溶液和l-抗坏血酸，在25℃、300rpm条件下搅拌混匀2h得大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液；所述l-抗坏血酸和分离蛋白溶液的重量体积比为0.3:50g/ml；

s3、加入表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)：向步骤s2所述大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液中加入表没食子儿茶素没食子酸酯，在27℃、350rpm条件下搅拌混匀24h，得大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液；所述表没食子儿茶素没食子酸酯和大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液的重量体积比为0.09:50g/ml；

s4、透析：使用3.5kda的透析膜及去离子水对步骤s3所述大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液进行透析72h，所述去离子水的体积为所述大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液体积的20倍，每8h更换一次去离子水，透析温度为4℃；

s5、干燥：将步骤s4所述大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物溶液在5pa，-25℃条件下真空冷冻干燥60h，得到大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物。

本实施例制备的结合物中egcg含量为13.73mg/g大黄鱼卵分离蛋白，dpph自由基清除能力为1.40μmoltrolox/mg样品，abts⁺自由基清除能力为0.48μmoltrolox/mg样品，还原能力为0.7207

实施例3

s1、制备大黄鱼卵分离蛋白溶液：将大黄鱼卵分离蛋白溶解于去离子水中，制备成分离蛋白溶液；所述大黄鱼卵分离蛋白和去离子水的重量体积比为0.1:50g/ml；

s2、自由基诱导分离蛋白：向步骤s1所述分离蛋白溶液中加入其0.02倍体积的5m过氧化氢溶液和l-抗坏血酸，在30℃、400rpm条件下搅拌混匀2h得大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液；所述l-抗坏血酸和分离蛋白溶液的重量体积比为0.25：50g/ml；

s3、加入表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)：向步骤s2所述大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液中加入表没食子儿茶素没食子酸酯，在30℃、400rpm条件下搅拌混匀24h，得大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液；所述表没食子儿茶素没食子酸酯和大黄鱼卵分离蛋白自由基诱导溶液的重量体积比为0.045:50g/ml；

s4、透析：使用1kda的透析膜及去离子水对步骤s3所述大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液进行透析84h，所述去离子水的体积为所述大黄鱼卵分离蛋白与egcg混合溶液体积的15倍，每8h更换一次去离子水，透析温度为4℃；

s5、干燥：将步骤s4所述大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物溶液在3pa，-45℃条件下真空冷冻干燥70h，得到大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物。

本实施例制备的结合物中egcg含量为13.48mg/g大黄鱼卵分离蛋白，dpph自由基清除能力为1.46μmoltrolox/mg样品，abts⁺自由基清除能力为0.47μmoltrolox/mg样品，还原能力为0.7362.

分别对本发明实施例制备的大黄鱼卵分离蛋白-结合物的egcg含量、dpph自由基清除能力、abts⁺自由基清除能力和还原能力进行测定；其中，使用国标gbt8318-2018方法对结合物的egcg含量进行测定。

结合物的egcg含量结果如图1所示，实施例1～3分别表示实施例1～实施例3制备的大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物。本发明制备的大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物的egcg含量为13.24～13.73mg/g大黄鱼卵分离蛋白，这一结果表明通过本发明可以有效的将大黄鱼卵分离蛋白与egcg结合起来。

对本发明制备的大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物的的抗氧化活性进行测定，其中主要考察的是结合物的自由基清除能力和还原能力，图2为结合物的dpph、abts⁺自由基清除能力的结果；参照下述文献的方法检测结合物的自由基清除能力：

wuht,jinwg,sunsg,etal.identificationofantioxidantpeptidesfromproteinhydrolysatesofscallop(patinopectenyessoensis)femalegonads[j],europeanfoodresearchandtechnology,2015,242(5)

hanjr,duyn,tangy,etal.structuralchanges,volatilecompoundsandantioxidantactivitiesofmaillardreactionproductsderivedfromscallop(patinopectenyessoensis)femalegonadhydrolysates[j],journalofaquaticfoodproducttechnology,2018

图2中，分离蛋白表示未经处理的大黄鱼卵分离蛋白，实施例1～3分别表示实施例1～实施例3制备的大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物，结果表明，结合物的自由基清除能力较分离蛋白有显著的提高。

图3为结合物的还原能力的结果，参照下述文献检测结合物的还原能力:

wuht,jinwg,sunsg,etal.identificationofantioxidantpeptidesfromproteinhydrolysatesofscallop(patinopectenyessoensis)femalegonads[j],europeanfoodresearchandtechnology,2015,242(5)

图3中，分离蛋白表示未经处理的大黄鱼卵分离蛋白，实施例1～3分别表示实施例1～实施例3制备的大黄鱼卵分离蛋白-egcg结合物，结果表明，结合物的还原能力较分离蛋白有显著的提高。这些结果进一步证明了本专利方法可以有效的提高大黄鱼卵分离蛋白的抗氧化能力。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。