一种能预防及改善阿尔兹海默症的猪脑提取物代餐粉及其用途的制作方法

本发明涉及功能性代餐食品技术领域，尤其涉及一种能预防及改善阿尔兹海默症的猪脑提取物代餐粉及其用途。

背景技术：

阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)是一组发生于老年和老年前期的原发性中枢神经系统退行性疾病，以进行性认知障碍和记忆力损害为主要临床表现，但视力、运动能力往往不受影响。随着我国老龄化进程的加快，阿尔茨海默病的发病率也在逐年增加。2010年我国ad患者已达569万，是1990年ad患者总数的近3倍，且在2010年65岁及以上的老年人已占ad患者总数的98.5％以上。阿尔茨海默病不仅会对患者及其家庭造成严重的精神压力，也会给政府、医疗服务机构、社会福利机构等带来沉重的经济负担。据统计，2007年全球阿尔茨海默病造成的经济损失达3150亿美元，而2010年阿尔茨海默病在全球范围内造成的经济损失已达6040亿美元；而在2050年，美国阿尔茨海默病患者的总数将达到2016年的两倍，说明其造成的经济损失仍在飞速增长。

临床上应用于ad治疗的药物主要包括以多奈哌齐为代表的胆碱酯酶抑制剂和以美金刚为代表的的n-甲基-d-天门冬氨酸(n-methyl-d-asparticacidreceptor，nmda)受体拮抗剂，但目前只能暂时改善ad患者的认知功能和行为症状，并不能从根本上延缓或终止疾病的进程。目前针对aβ靶点的抗ad药物研发方向集中于剪切app形成aβ的γ、β分泌酶抑制剂，结合aβ阻止淀粉样蛋白聚集的配体受体，以及抗aβ的免疫治疗单克隆抗体上；tau蛋白聚集抑制剂、tau蛋白过度磷酸化抑制剂以及抗tau蛋白免疫治疗疫苗等相关药物的开发也取得了一定的研究成果。但近年来曾被寄予厚望的关键酶β分泌酶1抑制剂维芦司他(verubecestat)、靶向aβ的索拉珠单抗(solanezumab)和阿度奴单抗(aducanumab)、具有tau蛋白聚集抑制作用的亚甲蓝等药物均未取得积极的临床实验结果，ad药物的研发仍需要新的视角和思路。

morris水迷宫被广泛应用于空间学习、记忆相关的神经生物学、药理学研究，其目的是为了测试与海马组织相关的空间记忆获取能力与长时空间记忆能力，在验证ad小鼠模型等神经认知障碍的啮齿动物模型中起到了重要的作用。morris水迷宫实验常用到以下指标：

逃避潜伏期：定位航行实验中，小鼠在60s内找到平台的时间，未找到平台则记为60s。逃避潜伏期可反映小鼠在每次训练时找到平台的快慢；结合6d内逃避潜伏期的变化，可显示小鼠训练期内空间记忆能力的阶段学习成果和进步快慢，也可初步比较训练期内小鼠寻找平台能力的组间差异。由于训练期内小鼠仍处于理解实验目标(找到并站上平台)和寻找定位方法的阶段，因此每天的平均逃避潜伏期并不能准确体现小鼠当天的空间记忆能力。

第一次到达平台区域的时间：空间探索实验中，小鼠在60s内第一次到达平台所在区域的时间，未找到平台记为60s。第一次到达平台所在区域的时间越短，说明小鼠对平台的定位越准确，定位方法越优，空间定位能力和记忆能力越强。

穿越平台次数：空间探索实验中小鼠在60s内穿越平台所在区域的次数，以进入平台区域至离开平台区域的过程记为一次穿越。穿越平台次数越多，说明小鼠成功到达平台区域后，未找到平台因而反复尝试定位平台位置的越准确，尝试次数也多，可在一定程度上反映小鼠空间定位的准确性。

平台停留时间：空间探索实验中小鼠在60s内处于平台所在区域的时间。平台停留时间越长，代表小鼠对于平台的定位、记忆越准确，远离平台区域的无效探索越少，可在一定程度上反映小鼠空间定位的准确性。

平台所在象限的停留时间：空间探索实验中小鼠在60s内处于平台所在象限的停留时间。由于平台面积相对较小，小鼠移动速度较快不易停留，因此认为小鼠平台所在象限内的探索是对平台定位较为准确的探索，平台所在象限外的探索为远离平台区域的无效探索；小鼠在平台所在象限内的停留时间越长，说明小鼠的无效探索越少，有效探索越多，对于平台的定位、空间记忆也越准确，能够反映小鼠空间定位的准确性与探索策略的优劣。

平台所在象限的移动路径：空间探索实验中小鼠于60s内在平台所在象限移动的路径。评价意义类似于平台所在象限停留时间，即小鼠在平台所在象限移动路径越长，说明小鼠在平台周围进行的有效探索越多，远离平台区域的无效探索越少，对于平台的定位、空间记忆也越准确，能够反映小鼠空间定位的准确性与探索策略的优劣。

空间探索实验轨迹图：小鼠在60s空间探索实验中的完整运动轨迹。轨迹图能够较为直观的体现小鼠是否到达平台所在区域，到达平台区域的探索路线，以及到达平台区域后的探索路径等，从而反映小鼠探索策略的优劣以及空间定位、记忆的准确性。

本申请拟提供一种能够辅助预防ad的代餐粉，增加对ad的预防和改善的途径。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供了一种能预防及改善阿尔兹海默症的猪脑提取物代餐粉，以食补的方式预防及改善ad病症。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种能预防及改善阿尔兹海默症的猪脑提取物代餐粉，100g代餐粉包括13g植物提取物、21g植物蛋白、29g植物全粉、16g添加剂、0.117g维生素、以及15g猪脑提取物，余量为糊精，其中，猪脑提取物的平均分子量为小于5000，所述猪脑提取物中含有50％的糊精。

进一步地，所述猪脑提取物包括平均分子量为2000～5000的大分子提取物，和平均分子量小于2000的小分子提取物，其中，大分子提取物与小分子提取物的比例为0.77：99.23。

进一步地，所述植物提取物包括核桃肽和脱苦大豆肽。

进一步地，所述植物蛋白包括豌豆分离蛋白和燕麦蛋白。

进一步地，所述植物全粉包括针叶樱桃粉、柠檬果粉、胡萝卜粉、藜麦粉和南瓜粉。

进一步地，所述添加剂包括魔芋精粉、酵母β葡聚糖、抗性糊精、低聚木糖、三氯蔗糖、异麦芽酮糖醇、葡萄糖酸镁、磷酸氢钙和乳酸亚铁。

进一步地，所述维生素包括维生素a、维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素c和维生素e。

进一步地，所述代餐粉的配方还包括3g营养酵母f55、3g圆苞车前子壳和1.5g水苏糖。

本发明提供了一种猪脑提取物代餐粉，其用于预防和改善阿尔兹海默症，按体重计使用量为0.6～2.4mg/kg，每日一次。

所述猪脑提取物的提取工艺记载于本公司同日进行的另一申请中。

与现有的技术相比，本发明有以下有益之处：

代餐粉中含有日常所需的营养成分，可以取代正常饮食，从而能够避免日常饮食影响本代餐粉的效果，经试验证明，本代餐粉能够提高ad小鼠的空间学习记忆能力，维持海马区神经元数目、形态并在一定程度上抑制aβ1-42的沉积，因此，本代餐粉能够预防及改善阿尔兹海默症。

附图说明

图1为本发明的实施例的morris水迷宫空间探索实验轨迹图：

a：低剂量组小鼠在60s空间探索实验中的移动轨迹图；

b：中剂量组小鼠在60s空间探索实验中的移动轨迹图；

c：高剂量组小鼠在60s空间探索实验中的移动轨迹图；

d：阴性组小鼠在60s空间探索实验中的移动轨迹图；

e：阳性组小鼠在60s空间探索实验中的移动轨迹图；

f：假手术组小鼠在60s空间探索实验中的移动轨迹图；

图2为本发明的实施例的小鼠morris水迷宫实验结果的比较：

a：定位航行实验6d内各组小鼠逃避潜伏期变化趋势图。图中数据点为当天每组内小鼠4次训练的平均逃避潜伏期的平均值；未在60s内找到平台的小鼠。其逃避潜伏期记录为60s；

b：空间探索实验小鼠第一次到达平台区域时间图。每条柱形代表该组小鼠在60s空间探索实验中第一次到达平台区域时间的平均值；

c：空间探索实验小鼠穿过平台区域次数图。每条柱形代表该组小鼠在60s空间探索实验中穿过平台区域次数的平均值；

d：空间探索实验小鼠平台区域停留时间图。每条柱形代表该组小鼠在60s空间探索实验中在平台所在区域停留时间的平均值；

e：空间探索实验小鼠平台所在象限停留时间图。每条柱形代表该组小鼠在60s空间探索实验中在平台所在象限内停留时间的平均值；

f：空间探索实验小鼠平台所在象限移动路径图。每条柱形代表该组小鼠在60s空间探索实验中在平台所在象限内移动路径的平均值；

(*表示与阴性组相比，p＜0.1；**表示与阴性组相比，p＜0.05；***表示与阴性组相比，p＜0.01)；

图3为本发明的实施例的小鼠大脑海马ca3区甲苯胺蓝染色图像：

a：ntdcf低剂量组；b：ntdcf中剂量组；c：ntdcf高剂量组；d：阴性对照组；e：阳性对照组；f：假手术组。画圈箭头所指的是正常的椎体细胞，未画圈箭头所指的是非正常椎体细胞。图像的基准尺为200μm。

图4为本发明的实施例的小鼠大脑海马区aβ1-42免疫组化染色图像：

a：ntdcf低剂量组；b：ntdcf中剂量组；c：ntdcf高剂量组；d：阴性对照组；e：阳性对照组；f：假手术组。图像基准尺为200μm；

图5为本发明的实施例的猪脑提取物液相分子量图谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

请参阅图1至图5，一种能预防及改善阿尔兹海默症的猪脑提取物代餐粉，具体见表1：

表1代餐粉配方

取上表中所列配方进行评价试验：

一、材料与试剂：

猪脑提取物代餐粉(ntdcf)；盐酸多奈哌齐片(陕西方舟制药有限公司，规格5mg/片，国药准字h20030583)；aβ1-42(a11875，cas107761-42-2，阿拉丁)；aβ1-42抗体(bs-0107r，北京博奥森)，hrp标记山羊抗兔(gb23303，servicebio)；组化试剂盒dab显色剂(k5007，dako)；morris水迷宫跟踪分析系统(复旦大学脑科学研究院)；c57bl/6j小鼠48只，雌雄各半，体重18-22g。

海马组织与空间、长时记忆之间具有密切联系，海马等脑区的神经元变性缺失，会造成ad患者空间记忆力、判断力和智力上的损伤，因此海马区神经元的损伤程度也可在一定程度上用于反映ad动物模型的病程。

目前针对ad动物模型的构造方法主要包括自然衰老模型、d-半乳糖促衰老模型、aβ注射模型、胆碱能损毁模型、转基因模型等。其中自然衰老模型中老龄实验动物难以获得且死亡率高，d-半乳糖促衰老模型具有一定的不稳定性，胆碱能损毁仅能模拟ad功能缺陷而无法反映病理过程，转基因模型成本较高且仅能根据特定基因反映部分ad的临床表现与病理特征；而aβ注射模型具有成本相对较低、更贴近发病机制、病理定位更加准确、更能真实模拟病变过程等优点，其中aβ1-42与aβ1-40、aβ25-35相比疏水性更强、淀粉样斑块沉积与aβ纤维长度更接近ad病理状态，属于相对较为理想的ad造模方法。因此本实施例采用aβ1-42注射的方法诱导ad小鼠模型。

二、ad小鼠模型与分组

实验前动物适应性喂养1周。将小鼠随机分为6组：假手术组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性组、阴性组。将aβ1-42溶解于生理盐水(1.5mg/ml)中并在37℃下静置7天以形成聚集肽。将小鼠用10％水合氯醛麻醉(0.1ml/10g)并固定在立体定位仪器中。每只小鼠双侧海马(中线外侧±1.8mm，前囟后方2.3mm和颅骨表面2.0mm处)分别注入5μlaβ1-42溶液，假手术组小鼠双侧海马分别注入5μl生理盐水。

给药方法

小鼠建模手术完成七天后开始灌胃给药。各组小鼠给药方法如表2所示。给药周期为3周，期间动物自由饮水和进食。

表2ad小鼠给药方法

三、试验效果评价

一)morris水迷宫实验

将圆形水池人工划分为4个象限。第2象限中放入一个低于水面1cm的平台，小鼠面向池壁从一固定入水点方式放入水池中，小鼠找到平台并在平台上保持10s后终止，记录为逃避潜伏期；未在60s内找到平台的，逃避潜伏期记录为60s。对未在60s内找到平台的小鼠，用小木棒引导小鼠找到平台，并让小鼠在平台上待30s。小鼠从水中取出后，用毛巾将其擦干，以防小鼠受凉，影响实验结果。休息10min后，进行另一个象限的训练。每日1次，每次训练4个象限。每天持续6d，记录每只小鼠60s内找到平台的时间，即逃避潜伏期。

1空间探索实验

定位航行实验结束1d后，撤除平台。小鼠面朝池壁在第4象限同一个入水点放入水中，记录小鼠在60s内的游泳路径，记录小鼠第一次到达平台区域的时间、穿过平台的次数、在平台区域的停留时间、在平台所在象限的停留时间及平台所在象限的移动路径，同时捕捉小鼠的运动轨迹图。

2甲苯胺蓝染色

morris水迷宫实验结束后，小鼠行腹腔注射10％水合氯醛麻醉(0.1ml/10g)，用生理盐水灌注，处死取脑，用4％多聚甲醛溶液固定，石蜡切片脱蜡至水。

将制成的切片放入甲苯胺蓝溶液染色5min，1％冰醋酸稍分化，自来水洗终止反应，显微镜下控制分化程度。洗涤后，将切片置于烤箱烤干。切片放入二甲苯5min，中性树胶封片。光学显微镜下对海马区进行观察拍照并分析。

3免疫组化染色

将石蜡切片置于柠檬酸抗原修复缓冲液(ph6.0)中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，自然冷却后将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤。后将切片放入3％过氧化氢溶液(双氧水：纯水＝1:9)，室温避光孵育25min后洗涤。在组化圈内滴加山羊血清均匀覆盖组织，室温封闭30min；甩掉封闭液，在切片上滴加经pbs稀释的一抗(1:100)，平放于湿盒内4℃孵育过夜。玻片洗涤甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(hrp标记，1:200)覆盖组织，室温孵育50min。洗涤甩干后在圈内滴加新鲜配制的dab显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。harris苏木素复染3min左右，自来水冲洗；1％盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗；氨水返蓝，流水冲洗。切片脱水透明，中性树胶封片。光学显微镜下对海马区进行观察拍照并分析。

二)结论分析

1ntdcf对ad小鼠空间学习记忆能力的影响

从空间探索实验轨迹图中可观察到，低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性组、假手术组小鼠在入水后，均以近似直线的路径抵达平台所在区域，并且之后的大部分探索路径都在平台周围区域。低剂量组小鼠探索路径基本全部处于平台所在象限中，只有少部分处于平台稍远位置；中剂量组和假手术组小鼠在平台所在象限外也有比较多的探索路径；而阳性组和高剂量组小鼠在未找到平台后出现了围水池壁绕圈的探索路线。阴性组小鼠则始终在入水点周围的水池壁反复徘徊，没有到达平台区域也没有进入平台所在象限。这直观说明了经ntdcf治疗的ad小鼠与未治疗的ad小鼠相比，能够选择相对高效的探索路径，成功到达平台区域并且定位相对更加准确。

图2a显示，在定位航行实验中，整体上各组小鼠平均逃避潜伏期随训练天数的增加而缩短，表明各组小鼠经过训练，找到平台的速度均有一定程度的提高。阴性组小鼠在1-6d内逃避潜伏期逐渐缩短，折线下降幅度较小，说明阴性组小鼠学习寻找平台的速度较慢；在前5d内阴性组逃避潜伏期均大于其他组；在第6d仅低于低剂量组，说明在训练时间内阴性组小鼠找到平台的速度整体上慢于其他组。经ntdcf治疗的小鼠都在训练时间内出现了不同程度的学习停滞或反复，但寻找平台的速度均有明显提高，整体上也快于阴性组。低剂量组、高剂量组在1-5d逃避潜伏期均逐渐缩短，但第6d逃避潜伏期均高于第5d，趋势线末段出现回升，其中低剂量组第6d的逃避潜伏期甚至高于阴性组小鼠，说明低剂量组、高剂量组小鼠在前5d寻找平台的速度明显提升，但均在第6d突然减慢，出现反复。中剂量组小鼠在1-4d寻找平台的时间明显缩短，但在4-6d逃避潜伏期没有明显的变化，找到平台的速度没有进一步的提升，说明小鼠可能进入了学习瓶颈期。阳性组小鼠在1-6d逃避潜伏期均以较大幅度缩短。假手术组小鼠在第1d逃避潜伏期最短，但在1-3d找到平台的速度反而变慢，直到4d开始寻找平台的能力才显著提高。

在空间探索实验中，图2b显示低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性组、假手术组小鼠均比阴性组更快到达平台所在区域(p＜0.05)，但五组之间第一次到达平台的时间没有显著差异(p＞0.1)。根据图2c、d，假手术组小鼠穿过平台区域的次数最多，在平台区域停留的时间也最长，且与阴性组相比均有一定的统计学差异(p＜0.1)。低剂量组、中剂量组、高剂量之间组穿过平台区域的次数均多于阴性组，在平台区域停留的时间也长于阴性组。其中低剂量组小鼠穿过平台的次数明显多于阴性组(p＜0.1)，中剂量组小鼠在平台区域停留时间与阴性组相比也有一定的统计学差异(p＜0.1)；除此之外，经ntdcf治疗的小鼠在穿过平台次数与平台区域停留时间上与阴性组没有统计学差异(p＞0.1)。低剂量组、中剂量组与高剂量组之间没有明显的剂量依赖效应；阳性组在穿过平台区域的次数多与平台区域停留时间上，与低剂量、中剂量、高剂量组没有明显差异(p＞0.1)。

图2e显示，低剂量组、中剂量组、高剂量组在平台所在象限停留的时间明显长于阴性组(p＜0.05)，其中低剂量组与阴性组相比有显著差异(p＜0.01)；三组之间中剂量组在象限的停留的时间较短，低剂量组、高剂量组停留时间相近，但三组之间并没有明显差异(p＞0.1)；阳性组在平台象限停留时间与低、中、高剂量组没有显著差异(p＞0.1)但明显长于阴性组(p＜0.05)；假手术组在平台所在象限停留的时间显著长于阴性组(p＜0.01)但与低、中、高剂量组与阳性组没有得到统计学差异(p＞0.1)。根据图2f，六组在象限移动路径上的结果与图1e平台所在象限停留时间的得到的结果基本一致。低剂量组、高剂量组、阳性组、假手术组在平台所在象限移动的路径与阴性组相比均明显较长(p＜0.05)，低剂量组在平台所在象限移动的路径明显长于阴性组(p＜0.01)，但低、中、高剂量组之间没有明显差异(p＞0.1)，低、中、高剂量组与假手术组、阳性组之间相比也没有显著差异(p＞0.1)。

水迷宫定位航行实验中小鼠逃避潜伏期的变化趋势，以及空间探索实验结果中小鼠第一次到达平台的时间、穿越平台的次数、平台区域停留时间、平台所在象限的停留时间和移动路径，均能够不同程度的体现出服用ntdcf的ad小鼠空间学习记忆能力明显强于阴性组小鼠，且与经盐酸多奈哌齐治疗的ad小鼠的空间学习记忆能力相近，也不弱于假手术组中没有诱导ad的小鼠，这说明ntdcf可以在一定程度上改善ad小鼠的空间学习记忆能力；低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠的在实验结果上并没有明显差异，说明ntdcf在改善小鼠的空间学习记忆能力的疗效上没有体现出剂量依赖效应。

2ntdcf对ad小鼠海马神经元数目、形态的影响

光学显微镜下显示，假手术组小鼠大脑海马ca3区的椎体细胞数目较多，排列相对密集、整齐，胞体完整，呈圆形或椭圆形，细胞核显著，未观察到显著的形态学变化；阴性对照组的椎体细胞数目显著较少，并且有较多细胞出现深染、固缩，呈三角形或四边形等不规则的形状；ntdcf低剂量组、ntdcf中剂量组、ntdcf高剂量组与阴性对照组相比，正常形态的椎体细胞数目显著增多，非正常形态的椎体细胞数目有不同程度的减少，且椎体细胞总数也有增多，其中ntdcf中剂量组、ntdcf高剂量组非正常形态的椎体细胞数目显著少于ntdcf低剂量组；阳性对照组与阴性对照组相比，正常形态的椎体细胞数目有增多，非正常形态的椎体细胞数目相对减少，但椎体细胞总数增多相对不显著。甲苯胺蓝染色结果显示ntdcf可相对显著的抑制ad小鼠海马区神经元缺失以及向非正常形态的转变。

3ntdcf对ad小鼠aβ42沉积程度的影响

免疫组化染色结果显示，假手术组小鼠海马区椎体细胞周围以及细胞间隙中未观察到显著的aβ1-42分布；阴性对照组椎体细胞周围及细胞间隙中均有显著而广泛的褐色aβ1-42沉积，并且可观察到椎体细胞边缘散在分布的染色较深的aβ1-42斑块；ntdcf低剂量组椎体细胞周围与细胞间隙也观察到显著的aβ1-42沉积及aβ1-42斑块，但与阴性对照组相比aβ1-42分布更少；ntdcf中剂量组、ntdcf高剂量组椎体细胞间微观察到显著的aβ1-42沉积，但在少部分椎体细胞周围仍可观察到显著的褐色aβ1-42斑块；阳性对照组可在椎体细胞周围及细胞间隙中观察到褐色aβ1-42沉积，但整体aβ1-42分布少于阴性对照组。免疫组化结果显示ntdcf可能在一定程度上起到了改善ad小鼠海马区aβ1-42沉积的作用。

经过以上试验证明，ntdcf能够提高ad小鼠的空间学习记忆能力，维持海马区神经元数目、形态并在一定程度上抑制aβ1-42的沉积，因此，本实施例提供的代餐粉能够预防及改善阿尔兹海默症。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。