一种水果果肉中膳食纤维-结合酚加合物的提取方法与流程

本发明涉及天然产物提取工艺领域，具体涉及一种利用超声辅助酶解提取水果果肉中膳食纤维-结合酚加合物的提取方法。

背景技术：

膳食纤维-结合酚加合物是一种重要的功能性食品成分，广泛存在于水果，蔬菜等植物性食品中。其中酚类物质和膳食纤维以酯键共价相结合。已有研究表明，膳食纤维-结合酚加合物可以吸附胆汁酸与胆固醇以及提高胰岛素，也可以与一些重金属离子结合，使金属离子与人体粪便一起排出，减小重金属离子对人体的伤害作用。因此，其可以用来防肥胖，糖尿病，降低胆固醇，降低心血管疾病，癌症发病率。同时，也有其他的研究表明，膳食纤维-结合酚加合物还具有很好的抗菌抗病毒效果，在抗氧化和清除自由基方面也具有一定的能力。

然而，现阶段常用的提取膳食纤维-结合酚加合物的方法存在很多明显的缺陷，如酸法提取和碱法提取容易破坏膳食纤维-结合酚加合物的结构，使结合酚脱离，从而失去特有的功能。普通酶法的提取时间过长，通常需数十个小时，不利于工业化生产。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种水果果肉中膳食纤维-结合酚加合物的提取方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种提取水果果肉膳食纤维-结合酚加合物的提取方法，其具体操作步骤如下：

(1)将水果果肉剪碎，用乙醇清洗，进行脱糖脱色；

(2)将脱糖脱色后的水果果肉浸泡在其10～20倍质量的水中，用胰酶、α-淀粉酶在超声条件下进行酶解；酶解完成后调节其ph，用胃蛋白酶在超声条件下进行酶解，得到果肉提取物；

(3)加热果肉提取物，使其中的酶失活；

(4)离心，过滤，收集滤除液体部分的果肉提取物，水洗2至3次，干燥，即得水果果肉膳食纤维-结合酚加合物。

本发明的第二个方面，提供：

一种提取水果果肉膳食纤维-结合酚加合物的提取方法，其具体操作步骤如下：

(1)将水果果肉剪碎，用乙醇清洗，进行脱糖脱色；

(2)将脱糖脱色后的水果果肉浸泡在其10～20倍质量的水中，调节ph，用胃蛋白酶在超声条件下进行酶解；酶解完成后调节其ph，用胰酶、α-淀粉酶在超声条件下进行酶解；得到果肉提取物；

(3)加热果肉提取物，使其中的酶失活；

(4)离心，过滤，收集滤除液体部分的果肉提取物，水洗2至3次，干燥，即得水果果肉膳食纤维-结合酚加合物。

进一步地，上述第一与第二方面中，酶的添加量具体为：按质量计，胰酶的添加量为1.5～2％；α-淀粉酶的添加量为1～2％；胃蛋白酶的添加量为0.5～1％。

更进一步地，上述第一与第二方面中，胰酶和α-淀粉酶的酶解ph为6.5～7.5，酶解时间为15～25min；上述胃蛋白酶的酶解ph为1.5～2.5，酶解时间为20～30min。

更进一步地，上述第一与第二方面中，胰酶、α-淀粉酶和胃蛋白酶的酶解温度为35～40℃。

进一步地，上述第一与第二方面中，步骤(1)乙醇溶液与果肉质量比为：(10～20)：1；体积分数为70～85％。

进一步地，上述第一与第二方面中，步骤(1)中清洗次数为2～3次。

进一步地，上述第一与第二方面中，步骤(2)中超声的功率为150～400w。

进一步地，上述第一与第二方面中，步骤(3)中所述加热的温度为90～100℃，时间5～10min。

本发明的有益效果是：

本发明相较于常规酶法或超声辅助酶法，在提取膳食纤维-结合酚加合物时，所需的酶量更少，提取过程中所需的温度更低，提取过程用时更短，所使用的超声辅助中，超声功率更低，范围更广，更节省能源，有利于膳食纤维-结合酚加合物的规模化及工厂化生产，而且，有助于膳食纤维-结合酚加合物的进一步市场化，提升其经济以及使用价值。

附图说明

图1为实施例1、2和对比例1-4的酶解或化学反应时间对比结果；

图2为实施例1、2和对比例1-4总酚含量测试对比结果；以没食子酸为标准品，总酚含量以每g样品中没食子酸当量(gae)表示；

图3为实施例1、2和对比例1-4总黄酮含量测试对比结果；芦丁为标准品，总黄酮含量以每g样品中芦丁当量(re)表示；

图4为实施例1、2和对比例1-4酚类物质frap抗氧化能力测试对比结果；以换算所得的feso4浓度表示；纵坐标为frap抗氧化值，以硫酸亚铁当量计，fee为ferroussulfateequivalents缩写，以每g样品的硫酸亚铁当量表示；

图5为实施例1、2和对比例1-4酚类物质abts+自由基清除能力的测试对比结果；纵坐标单位为abts抗氧化值，以trolox当量计，te是troloxequivalents的缩写，以每g样品的trolox当量表示。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

实施例1提取荔枝果肉中膳食纤维-结合酚加合物

具体步骤如下：

(1)取荔枝果肉剪碎，按料液比1：10加入体积分数为85％的乙醇溶液，搅拌20min倒出，重复两次；用蒸馏水清洗两次，并沥干水分；

(2)取步骤(1)处理后的荔枝果肉，浸泡在其10倍质量的水中，加入质量比为1％的胃蛋白酶，用4mhcl调节ph恒定在1.5，在200w、40℃条件下超声酶解30min；用4mnaoh溶液调节酶解后的溶液ph至7.5，加入0.5％的胰酶和0.7％的α-淀粉酶；200w、35℃条件下超声酶解15min；

(3)将经过三种酶水解后的荔枝果肉提取物，100℃条件下加热10min；

(4)在8000rpm下离心10min；分离出不溶性膳食纤维；用孔径为40μm的漏斗过滤，收集得到的残留物用蒸馏水洗涤两次，所得残留物冷冻干燥得到荔枝膳食纤维-结合酚加合物。

实施例2提取苹果果肉中膳食纤维-结合酚加合物

(1)取苹果果肉剪碎，按料液比1：17加入体积分数为80％的乙醇溶液，搅拌20min倒出，重复两次；然后用蒸馏水清洗两次，并沥干水分；

(2)取步骤(1)处理后的苹果果肉，浸泡在其20倍质量的水中，加入1％的α-淀粉酶、0.8％的胰酶，在7.5、温度35℃、250w条件下超声酶解20min；用hcl溶液调节酶解后的溶液ph至1.5，加入0.7％的胃蛋白酶；在温度37℃、250w条件下超声酶解20min；

(3)将经过三种酶水解后的苹果果肉提取物，100℃条件下加热10min；

(4)在8000rpm下离心10min；分离出不溶性膳食纤维；用孔径为80μm的漏斗过滤，收集得到的残留物用蒸馏水洗涤两次，所得残留物冷冻干燥得到苹果膳食纤维-结合酚加合物。

对比例1酶重量法提取荔枝果肉中膳食纤维-结合酚加合物

取与实施例1等质量的荔枝果肉剪碎，加入mes-tris缓冲溶液，避光加入耐高温α-淀粉酶，90℃条件下酶解30min。冷却至45℃，调节ph至10.5，加入碱性蛋白酶，酶解30min。调节ph至4.25，加入糖化酶酶解30min。离心，收集沉淀部分，过滤洗涤，沉淀部分冷冻干燥即为膳食纤维-结合酚加合物。

对比例2酶重量法提取苹果果肉中膳食纤维-结合酚加合物

参照对比例1的方法，提取苹果果肉中膳食纤维-结合酚加合物。

对比例3酶-化学法提取荔枝果肉中膳食纤维-结合酚加合物

取与实施例1等质量的荔枝果肉剪碎，加入乙酸乙酯室温浸泡，用蒸馏水洗涤去除有机溶剂。然后加入α-淀粉酶，在ph5.8，温度35℃条件下酶解1h。酶解完成后加按料液比1：10加入0.5mol/l的naoh溶液，在65℃中水解1h。水解完成后用蒸馏水洗涤至中性，按料液比1：13加入蒸馏水，按料液比1：0.1加入冰醋酸，按料液比1：0.12加入亚氯酸钠，75℃条件下反应1h后按同样比例加入冰醋酸及亚氯酸钠，重复三次。收集沉淀部分，用蒸馏水反复洗涤至中性，然后用丙酮洗涤，沉淀部分冷冻干燥即为膳食纤维-结合酚加合物。

对比例4酶-化学法提取苹果果肉中膳食纤维-结合酚加合物

参照对比例3的方法，提取苹果果肉中膳食纤维-结合酚加合物。

实施例3荔枝和苹果果肉中膳食纤维-结合酚加合物中多酚含量、抗氧化能力测试对比

利用碱法提取实施例1、2和对比例1-4所得提取物的多酚：

取实施例1、2和对比例1-4所得的干燥荔枝和苹果的膳食纤维-结合酚加合物，加入naoh溶液，常温下搅拌12h，调节ph至6.5～7.5。8000rpm离心10min，分离并保存上清液。

以下测试均使用该方法所得到的上清液。

总酚含量测试：

取碱法提取所得上清液，加入蒸馏水和福林酚试剂。静置6min后加入na2co3溶液和蒸馏水，轻轻振荡使之混匀。在暗室中室温条件下反应90min，用紫外可见分光光度计测定其在760nm的波长下的吸光度。以没食子酸为标准品。总酚含量以每g样品中没食子酸当量(gae)表示，单位为mggae/g。

总黄酮含量测试：

取碱法提取所得上清液，加入蒸馏水和nano2溶液，轻轻振荡使之混匀。静置6min后加入alcl3·6h2o溶液，反应5min后加入naoh溶液，加蒸馏水定容至3ml，振荡摇匀，并用紫外可见分光光度计在510nm波长下测定吸光度。总黄酮测定以芦丁为标准品，总黄酮含量以每g样品中所含芦丁当量(re)表示，单位为mgre/g。

frap抗氧化能力测试：

取碱法提取所得上清液，加入预热至37℃的frap工作液，轻轻摇匀后避光放置10min，使用紫外分光光度计在593nm波长下，测定其吸光度。通过制作标准曲线并计算转换求得相应feso4浓度。frap值越大，表明抗氧化活性越强。

abts+自由基清除能力的测试

取碱法所得上清液，加入abts+工作液，充分混合。静置6min，用紫外分光光度计在734nm波长下，测定其吸光度a。以无水乙醇作为空白对照，得到的吸光度为a0。

清除率计算公式如下：

测试结果与分析：

根据本申请中提供的制备方法，实施例1、2和对比例1-4的酶解或化学反应时间对比结果如图1所示。

总酚和总黄酮含量测试结果如图2和图3所示，实施例中提取物总酚和总黄酮含量显著高于对比例，其中总酚含量荔枝实施例是对比例1的2.33倍，对比例3的3.50倍，苹果实施例为对比例2的2.00倍，对比例4的2.05倍。总黄酮含量荔枝实施例是对比例1的2.19倍，对比例3的3.39倍，苹果实施例为对比例2的2.10倍，对比例4的3.32倍。实施例和对比例测试结果差异显著，这可能是本法可以在短时低温的条件下提取出较高纯度的膳食纤维-结合酚加合物，而对比例所用的方法中提取到的膳食纤维-结合酚加合物中杂质含量较高。也可能与对比例中所用方法破坏膳食纤维-结合酚加合物这一结构，破坏酚类物质的生物活性有关。

frap抗氧化能力测试和abts+自由基清除能力测试结果如图4和图5所示，实施例中提取物中酚类物质抗氧化能力明显高于对比例。frap抗氧化能力测试中，荔枝实施例的frap值是对比例1的2.50倍，对比例3的4.66倍，苹果实施例的frap值是对比例2的2.02倍，对比例4的2.70倍。abts+自由基清除能力测试中，荔枝实施例的abts值为对比例1的1.80倍，对比例3的3.23倍，苹果实施例的abts值为对比例2的1.75倍，对比例4的3.90倍。实施例中所用方法提取到的膳食纤维-结合酚加合物抗氧化活性显著高于对比例，而且两种抗氧化能力测试结果变化趋势和总酚总黄酮变化趋势保持一致，进一步说明了本发明所用的方法所得的提取物纯度更高，也更能较好的保护膳食纤维-结合酚加合物结构，保护酚类物质生物活性不被破坏。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。