一种虾青素纳米微囊的制备方法与流程

本发明属于功能食品制备技术中的纳米载体技术领域，具体涉及一种细菌细胞膜包被的虾青素纳米微囊的制备方法。

背景技术：

虾青素(astaxanthin)，又名虾黄质，是一种广泛存在于自然界的酮式类胡萝卜素，化学名称为3，3'-二羟基-4，4'-二酮基-β，β'-胡萝卜素，分子式为c40h52o4，分子量为596.86。研究表明，虾青素是迄今为止人类发现的自然界中最强的抗氧化剂，被称为“超级抗氧化剂”。其卓越的抗氧化能力赋予其强大的清除自由基、抗炎和延缓衰老等诸多功效。虾青素是目前发现的唯一能穿透血-脑、血-视网膜屏障的类胡萝卜素，对中枢神经系统和大脑功能可产生积极的影响。可作为天然着色剂用于水产养殖业；又具有增强免疫反应及抗癌的活性，所以其在食品、保健品、医药行业均有潜在的应用价值和前景。

雨生红球藻是一种兼性异氧型单细胞绿藻，是生产虾青素最好的生物来源，在胁迫条件下，可大量积累虾青素酯，如强光、高盐度、高温、营养盐(氮、磷等)缺乏等条件下，虾青素酯在雨生红球藻中的叶绿体内合成，然后运送到细胞质内的脂质液泡中。雨生红球藻提取物除富含有天然抗氧化剂虾青素酯外，还含有众多人体必需的营养成分。

脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶，能催化天然油脂水解，在食品、医药、洗涤剂和皮革等许多工业领域中都有广泛的应用，它可将虾青素酯水解为虾青素，进一步发挥生物学功效。解脂亚罗酵母(yarrowialipolytica)所产脂肪酶种类繁多，包括胞外、胞壁及胞内多种脂肪酶，其所产的脂肪酶几乎能催化所有链长底物的酯化反应，在有机相中还可以催化转酯反应，并用于分离外消旋混合物。研究发现该酵母所产的胞外脂肪酶具有低温催化活力高、在碱性条件下性质稳定、与金属离子及表面活性剂配伍性好等一系列优点。

然而，由于虾青素分子结构中的共轭双键及末端的不饱和酮基和羟基，具有活泼的电子效应，能为未配对电子或自由基提供配对电子，发挥除去自由基的作用而表现出的强抗氧化效果。然而，虾青素易受到外界光、热、金属离子等因素的影响而导致异构，使其具有溶解性差、稳定性差、生物利用率低等缺陷，严重限制了其在食品、化妆品等方面的应用。

20世纪，随着纳米技术的应用和推广，开发出很多新型的载体系统。如脂质体、软胶囊、微胶囊和乳剂等。软胶囊制备时一般要求固形物含量小于20％，且容易出现装量不稳定、均一度不合格、成品率低和生物安全性差等问题，软胶囊内容物分层也是比较常见的现象；采用经喷雾干燥法制备虾青素微胶囊的过程中，喷雾干燥对温度要求极高，制备的虾青素微胶囊损失率高且成品效果不好，高温干燥使得虾青素降解，从而造成产品的效果降低；在制作自微乳中，作为油相的物质有很多种，但很少是天然物质，大多数为合成的材料，都存在一定的毒性，不利于长期食用；脂质制剂在市面上存在剂型单一，应用范围窄的瓶颈，且同时存在着成本高、安全性差、生物相容性差等诸多问题。

植物乳杆菌是一种对人类有益的肠道菌，能够调整肠道的微环境，抑制肠道致病菌的生长，机体对植物乳杆菌具有很好的相容性和耐受性。将分离的植物乳杆菌细胞膜包覆虾青素制备形成纳米微囊利于虾青素在体内的运输和长时间体内循环，因而可提高虾青素的生物利用率。植物乳杆菌细胞膜纳米微囊应用于纳米医药领域，该项技术在国内外还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中存在的缺点和不足，提供一种虾青素细胞膜纳米粒子(虾青素纳米微囊)的制备方法，既能够保持虾青素的活性和结构的稳定性，又解决现有技术中虾青素的溶解性差、负载量低及口服生物利用度低等缺点和不足之处。

本发明提供一种虾青素纳米微囊的制备方法，其是将游离虾青素用益生菌细胞膜包被，游离虾青素单体是由虾青素酯用脂肪酶水解得到，所述脂肪酶为解脂亚罗酵母发酵产生的碱性脂肪酶，所述虾青素酯是雨生红球藻的粗提物，所述的细菌为植物乳杆菌，用反复冻融法提取植物乳杆菌细胞，再通过超声法制备负载虾青素的纳米微囊。它包括以下几个步骤：

(1)雨生红球藻中虾青素酯的提取

将雨生红球藻粉以液料比1：50～200溶于乙酸乙酯与乙醇的混合提取剂中，温度30～70℃，在水浴超声中浸提40～80min，8000～12000rpm离心3～5min取上清，混合上清液，避光于3～5℃保存；其中，所述乙酸乙酯与乙醇的体积比为1～6：1～6；

(2)解脂亚罗酵母发酵产碱性脂肪酶

将解脂亚罗酵母于28～32℃在pda固体培养基上活化，挑取平板上的单菌落接种到含有1～3ml种子培养基的试管中，于25～32℃、120～200rpm摇床培养1～3d后，全部转接到装有50ml种子培养基的锥形瓶中，相同条件下摇床培养1～3d后，以接种量10～20％接种到发酵培养基中，相同条件下摇床培养，当酶活达到60-90u/l不再上升时，收集发酵液，7000～12000rpm，4℃，离心5～15min，取上清，3～5℃保存，得到脂肪酶液；

(3)碱性脂肪酶水解虾青素酯

取步骤(1)的上清液旋转蒸干，加入1～3倍质量的吐温80乳化，再将乳化液溶于0.05～0.2m、ph6～9的pbs缓冲溶液中，定容至10ml，以每微克总类胡萝卜素加入4～16u脂肪酶的量加入脂肪酶液，30℃，150～180rpm反应4～12h；反应结束后，加入与等体积的丙酮，室温条件下用漩涡振荡器300～500rpm振荡30～60s，再加入等体积的正己烷，上述同样方法振荡30～60s后，8000～15000rpm离心1～3min，离心后的混合溶液分层，移出上相液体，吹干，得到虾青素；

(4)植物乳杆菌细胞膜的提取

将植物乳杆菌细胞，经冻融处理使细胞破碎，于3000～5000rpm离心5～15min，并用0.01mol/l、ph7.4的pbs缓冲溶液洗涤，再按照植物乳杆菌细胞与2.5mm的pbs低渗溶液的质量比为1:30～50的比例，冰浴混悬15～25min后，于12000～18000rpm离心50～80min，弃上清，获得植物乳杆菌细胞膜溶液，在0.01mol/l、ph7.4的pbs缓冲溶液置3～5℃保存备用；

(5)虾青素纳米微囊的制备

将步骤(3)得到的虾青素加入1～3倍质量的吐温80研磨乳化，再将乳化液溶于15～30ml、0.05～0.2m、ph6～9的pbs缓冲溶液中，得到虾青素溶液；再将虾青素溶液和步骤(4)所得的植物乳杆菌细胞膜溶液混合，使用挤出器重复挤压，即得负载虾青素的纳米微囊，置于4℃保存；其中，所述虾青素溶液与植物乳杆菌细胞膜溶液的体积比为5～15：6～12(如虾青素溶液的体积为5～15ml，植物乳杆菌细胞膜溶液的体积为6～12ml)。

基于以上技术方案，优选的，所述种子培养基包括下述体积百分比的组分：豆油1～3％，硫酸铵0.05～0.2％，葡萄糖0.5～0.8％，鱼蛋白胨0.5～0.8％，硫酸镁0.05～0.1％，磷酸二氢钾0.05～0.1％。

基于以上技术方案，优选的，步骤(2)中，所述发酵培养基包括下述体积百分比的组分：豆油5～8％，硫酸铵0.05～0.2％，葡萄糖0.5～2％，鱼蛋白胨0.5～2％，硫酸镁0.5～2％，磷酸二氢钾0.5～2％。

基于以上技术方案，优选的，步骤(2)中，用对硝基苯酚法测定酶活。

基于以上技术方案，优选的，步骤(1)和步骤(2)中，整个提取过程须在避光条件下进行。

本发明主要是通过溶剂法从雨生红球藻中提取虾青素酯，后虾青素酯由解脂亚罗酵母发酵产生的碱性脂肪酶水解成游离的虾青素；细菌采用植物乳杆菌，用反复冻融法提取植物乳杆菌细胞膜,再通过超声法制备负载虾青素的植物乳杆菌细胞膜纳米微囊。本发明制备的虾青素纳米微囊，具有良好的稳定性和水溶性，制备方法简单可控，重复性好，且通过细胞膜的包载，可显著避免虾青素被氧化，很大程度改善自身的稳定性。另外，植物乳杆菌和虾青素的结合使肠道菌群的构成发生有益变化，改善人体胃肠道功能，调节人体肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，维护人体健康。该纳米微囊具有安全性高的特点。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1、本发明所制备的负载虾青素的细菌细胞膜纳米粒子在贮藏过程中无析出、无分层等现象，证明该粒子稳定性良好，且具有缓释效果；

2、配方中各组分都具有很高的安全性，对机体无刺激，无毒性，可作为中间体类型与食品配方复配使用，配伍性佳，可广泛用于食品及保健品领域；

3、本发明丰富了细菌细胞膜配体修饰种类以及应用领域，合成方法简单，为细菌细胞膜应用领域提供新的思路；

4、本发明方法简单，易于实现，具有广泛的生物医学价值。

附图说明

图1是本发明实施例1制得的虾青素纳米微囊的电镜图。

图2是本发明实施例1制得的虾青素纳米微囊的粒径分布图。

图3是本发明实施例1制得的虾青素纳米微囊在4℃保存下的粒径变化图。

具体实施方式

下述实施例中雨生红球藻粉购买于西安泽邦生物科技有限公司。

下述实施例中植物乳杆菌细胞购买于佛山信航生物科技有限公司。

实施例1

本实施例公开一种虾青素纳米微囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)雨生红球藻中虾青素酯的提取：将雨生红球藻粉以液料比(g/ml)1：50溶于乙酸乙酯：乙醇(1：6)的混合提取剂中，在水浴超声和避光的条件下，温度50℃，浸提60min，10000rpm离心5min取上清，混合上清液，避光于4℃保存；

(2)解脂亚罗酵母发酵产碱性脂肪酶：将超低温冰箱(-80℃)保存的解脂亚罗酵母于28℃在pda固体培养基上活化，挑取平板上的单菌落接种到含有1ml种子培养基(v/v：豆油2％，硫酸铵0.1％，葡萄糖0.7％，鱼蛋白胨0.7％，硫酸镁0.07％，磷酸二氢钾0.07％)的试管中，于32℃，180rpm摇床培养1d后，全部转接到装有50ml种子培养基的锥形瓶中，相同条件下摇床培养2d后，以接种量10％接种到发酵培养基(v/v：豆油6％，硫酸铵0.1％，葡萄糖1％，鱼蛋白胨1％，硫酸镁1％，磷酸二氢钾1％)，相同条件下摇床培养，当酶活达到80u/l不再上升时，收集发酵液，10000rpm，4℃，离心5min，取上清，4℃保存，得到脂肪酶液；

(3)碱性脂肪酶酶解虾青素酯：取步骤(1)的上清液旋转蒸干，加入1倍质量的吐温80乳化，再将乳化液溶于0.1m、ph7.4的pbs缓冲溶液中，定容至10ml，以每微克总类胡萝卜素加入6u脂肪酶的量加入脂肪酶液，30℃，170rpm反应6h；反应结束后，加入与样品同体积的丙酮，室温条件下用漩涡振荡器400rpm振荡30s，再加入等体积的正己烷，上述同样方法振荡30s后，10000rpm离心2min，离心后的混合溶液分层，移出上相液体，避光条件下，吹干，得到虾青素；

(4)植物乳杆菌细胞膜的提取：将常规方法活化的植物乳杆菌细胞，经冻融处理使细胞破碎；于3000rpm离心15min，并用0.01mol/l、ph7.4的pbs缓冲溶液洗涤，再按照植物乳杆菌细胞与2.5mm的pbs低渗溶液的质量比为1：40的比例，冰浴混悬20min后，于12000rpm离心80min，弃上清，获得植物乳杆菌细胞膜溶液，加15ml、0.01mol/l的pbs缓冲溶液(ph7.4)置4℃保存备用；

(5)虾青素纳米微囊的制备：将步骤(3)得到的虾青素加入1倍质量的吐温80研磨乳化，再将乳化液溶于20ml、0.1m、ph7.4的pbs缓冲溶液中，然后取10ml该溶液和8ml步骤(4)所得的植物乳杆菌细胞膜溶液混合，使用挤出器重复挤压，即得负载虾青素的纳米微囊，置于4℃保存。

应用透射电子显微镜对虾青素纳米微囊进行形貌表征，如图1所示，纳米微囊呈球形，分散性较好，可见纳米微囊的粒径在80～160nm之间。经动态光散射系统测量平均粒径147.2nm，见图2。4℃保存下虾青素纳米微囊的粒径变化情况如图3所示，粒径变化不明显，说明虾青素纳米微囊稳定性良好。

实施例2

本实施例公开一种虾青素纳米微囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)雨生红球藻中虾青素酯的提取：将雨生红球藻粉以液料比(g/ml)1：50溶于乙酸乙酯：乙醇(6：1)的混合提取剂中，在水浴超声和避光的条件下，温度30℃，浸提40min，8000rpm离心3min取上清，混合上清液，避光于3℃保存；

(2)解脂亚罗酵母发酵产碱性脂肪酶：将超低温冰箱(-80℃)保存的解脂亚罗酵母于28℃在pda固体培养基上活化，挑取平板上的单菌落接种到含有1ml种子培养基(v/v：豆油1％，硫酸铵0.05％，葡萄糖0.5％，鱼蛋白胨0.5％，硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.05％)的试管中，于25℃，120rpm摇床培养1d后，全部转接到装有50ml种子培养基的锥形瓶中，相同条件下摇床培养1d后，以接种量10％接种到发酵培养基(v/v：豆油5％，硫酸铵0.05％，葡萄糖0.5％，鱼蛋白胨0.5％，硫酸镁0.5％，磷酸二氢钾0.5％)，相同条件下摇床培养，当酶活达到60u/l时不再上升时，收集发酵液，7000rpm，4℃，离心5min，取上清，3℃保存，得到脂肪酶液；

(3)碱性脂肪酶酶解虾青素酯：取步骤(1)的上清液旋转蒸干，加入1倍质量的吐温80乳化，再将乳化液溶于0.05m、ph6的pbs缓冲溶液中，定容至10ml，以每微克总类胡萝卜素加入4u脂肪酶的量加入脂肪酶液，30℃，150rpm反应4h；反应结束后，加入与等体积的丙酮，室温条件下用漩涡振荡器300rpm振荡30s，再加入等体积的正己烷，上述同样方法振荡30s后，8000rpm离心1min，离心后的混合溶液分层，移出上相液体，避光条件下，吹干，得到虾青素；

(4)植物乳杆菌细胞膜的提取：将常规方法活化的植物乳杆菌细胞，经冻融处理使细胞破碎；于3000rpm离心5min，并用0.01mol/l、ph7.4的pbs缓冲溶液洗涤，再按照植物乳杆菌细胞与2.5mm的pbs低渗溶液的质量比为1：30的比例，冰浴混悬15min后，于12000rpm离心50min，弃上清，获得植物乳杆菌细胞膜溶液，加15ml、0.01mol/l的pbs缓冲溶液(ph7.4)置3℃保存备用；

(5)虾青素纳米微囊的制备：将步骤(3)得到的虾青素加入1倍质量的吐温80研磨乳化，再将乳化液溶于15ml、0.05m、ph6的pbs缓冲溶液中，然后取5ml该溶液和6ml步骤(4)所得的植物乳杆菌细胞膜溶液混合，使用挤出器重复挤压，即得负载虾青素的纳米微囊，置于4℃保存。

实施例3

本实施例公开一种虾青素纳米微囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)雨生红球藻中虾青素酯的提取：将雨生红球藻粉以液料比(g/ml)1：200溶于乙酸乙酯：乙醇(1：6)的混合提取剂中，在水浴超声和避光的条件下，温度70℃，浸提80min，12000rpm离心5min取上清，混合上清液，避光于5℃保存；

(2)解脂亚罗酵母发酵产碱性脂肪酶：将超低温冰箱(-80℃)保存的解脂亚罗酵母于32℃在pda固体培养基上活化，挑取平板上的单菌落接种到含有3ml种子培养基(v/v：豆油3％，硫酸铵0.2％，葡萄糖0.8％，鱼蛋白胨0.8％，硫酸镁0.1％，磷酸二氢钾0.1％)的试管中，于32℃，200rpm摇床培养3d后，全部转接到装有50ml种子培养基的锥形瓶中，相同条件下摇床培养3d后，以接种量20％接种到发酵培养基(v/v：豆油8％，硫酸铵0.2％，葡萄糖2％，鱼蛋白胨2％，硫酸镁2％，磷酸二氢钾2％)，相同条件下摇床培养，当酶活达到90u/l时不再上升时，收集发酵液，12000rpm，4℃，离心15min，取上清，5℃保存，得到脂肪酶液；

(3)碱性脂肪酶酶解虾青素酯：取步骤(1)的上清液旋转蒸干，加入3倍质量的吐温80乳化，再将乳化液溶于0.02m、ph9的pbs缓冲溶液中，定容至10ml，以每微克总类胡萝卜素加入16u脂肪酶的量加入脂肪酶液，30℃，180rpm反应12h；反应结束后，加入与等体积的丙酮，室温条件下用漩涡振荡器500rpm振荡60s，再加入等体积的正己烷，上述同样方法振荡60s后，15000rpm离心3min，离心后的混合溶液分层，移出上相液体，避光条件下，吹干，得到虾青素；

(4)植物乳杆菌细胞膜的提取：将常规方法活化的植物乳杆菌细胞，经冻融处理使细胞破碎；于5000rpm离心15min，并用0.01mol/l、ph7.4的pbs缓冲溶液洗涤，再按照植物乳杆菌细胞与2.5mm的pbs低渗溶液的质量比为1：50的比例，冰浴混悬25min后，于18000rpm离心80min，弃上清，获得植物乳杆菌细胞膜溶液，加25ml、0.01mol/lpbs缓冲溶液(ph7.4)置5℃保存备用；

(5)虾青素纳米微囊的制备：将步骤(3)得到的虾青素加入3倍质量的吐温80研磨乳化，再将乳化液溶于30ml、0.2m、ph9的pbs缓冲溶液中，然后取15ml该溶液和12ml步骤(4)所得的植物乳杆菌细胞膜溶液混合，使用挤出器重复挤压，即得负载虾青素的纳米微囊，置于4℃保存。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域专业技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。