一种饲用原料中霉菌毒素的生物降解方法与流程

1.本发明涉及饲料添加剂领域，具体涉及一种饲用原料中霉菌毒素的生物降解方法。


背景技术：

2.饲料及原料中霉菌毒素污染问题已经成为饲料企业及养殖企业共同面临的一个全球性难题，霉菌毒素是存在于饲料及饲料原料中的抗营养因子，是由黄曲霉菌素、青霉菌素、镰刀菌素在一定温湿条件下产生的次级代谢产物，生产过程中危害较大的主要有：黄曲霉毒素、单端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、烟曲霉毒素、赭曲霉毒素等等。其中黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一类强烈生物碱性的化合物，也是目前为止最强的致癌性物质，其主要危害的作物有花生、大米、豆类等作物。
3.霉菌毒素几乎影响畜禽的各个器官，特别是对肝脏、肾脏、口腔、胃肠道、神经系统、生殖系统，在外观上直接表现为畜禽采食量下降、体重增加缓慢、呕吐等，这样使得饲料的转化率下降。玉米赤霉烯酮主要作用于生殖系统，当玉米赤霉烯酮中毒直接表现为假发情、流产、外阴红肿、不孕、泌乳反常等。单端孢霉烯族毒素主要包括t-2、don、das毒素，这些毒素呈现较强的碱性，此类毒素中毒主要危害口腔、胃肠道、神经系统，它们通过影响蛋白质合成及机体免疫来发挥毒性作用。
4.随着人们对霉菌毒素危害认识的逐渐增强，以及霉菌毒素对我国畜禽养殖的重大危害已有大量的报道，越来越多的研究人员去寻求开发一种降低霉菌毒素毒性或减少其对食品和原料污染的方法，如作物收割前可以通过较好的预防措施防止作物受霉菌侵染，在作物收割后做好作物及加工成品的存储工作(干燥、产品分类分等级存放、降低存储温度、湿度)来加以控制，然而在日常生产中，霉菌毒素污染问题是无法避免的，因此，寻求合适有效的方法对霉菌毒素进行处理控制，是畜牧业发展的当务之急。
5.目前对霉菌毒素脱毒处理主要有：机械脱毒、生物脱毒、化学脱毒及物理吸附脱毒等方法。其中，物理脱毒操作繁杂、成本高昂等缺陷，化学脱毒因化学品残留问题无法在生产实践中有效使用；吸附剂脱毒法主要是通过在饲料或谷物中添加各种吸附剂，可以吸附霉菌毒素的物质，使毒素在经过动物肠道时不被动物所吸收，直接排出体外。这是目前饲料市场上较为成熟且较可行的一种霉菌毒素脱毒方法，但霉菌毒素结构多样性常规吸附剂不能有效解决多种霉菌毒素的污染及危害问题。目前广泛研究的霉菌毒素吸附剂包括粘土类吸附剂或者有机多聚体，但效果均不理想，普遍吸附量较小，需要较大的添加量，进而影响饲料养分含量；生物脱毒则存在降解效率低下的问题。


技术实现要素：

6.针对上述问题，本发明提供一种饲用原料中霉菌毒素的生物降解方法。
7.本发明的目的采用以下技术方案来实现：
8.一种饲用原料中霉菌毒素的生物降解方法，具体是在饲用原料中加入霉菌毒素吸
附剂和生物降解剂制备为饲料或饲料前体，其中，所述霉菌毒素吸附剂包括酵母细胞壁；所述生物降解剂包括益生菌和复合酶制剂。
9.优选的，所述饲用原料与所述霉菌毒素吸附剂、所述生物降解剂的混合质量比例为1000：(1-3)：(2-7)；所述生物降解剂中所述益生菌和所述复合酶制剂的质量比例为(2-3)：1。
10.优选的，所述酵母细胞壁的制备方法包括以下步骤：
11.(1)将干酵母或废弃酵母分散在盐水中质解，离心分离沉淀，经洗涤、干燥后得到细胞壁原料，将所述细胞壁原料分散在乙醇的水溶液中，得到分散液a；称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物并溶解在四氢呋喃中，配制为浓度10-20g/l的溶液，按体积比1：(3-4)分散在去离子水中，得到分散液b，在所述分散液b中加入所述分散液a，混合搅拌后离心分离沉淀，经洗涤、干燥后得到所述酵母细胞壁；
12.其中，所述细胞壁原料与所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比例为(2-3)：1。
13.优选的，所述酵母细胞壁的制备方法还包括以下步骤：
14.(2)分别称取3,5-二甲基吡啶和ω-卤代烷基酸并溶解在乙腈溶剂中，升温至60-70℃搅拌反应4-8h，反应完成后蒸去溶剂，以乙醚洗涤后溶解在二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酸二亚胺盐酸盐和2-叠氮基乙醇，在室温和保护气氛下搅拌反应过夜，反应完成后蒸去溶剂，以硅胶层析柱除去未反应单体，得到产物a；
15.(3)分别称取氨丁三醇和二碳酸二叔丁酯并分散溶解在叔丁醇溶剂中，在室温下搅拌反应过夜，反应完成后蒸去溶剂，以冷的乙酸乙酯洗涤后再次溶解在四氢呋喃中，在保护气氛下加入3-溴丙炔和氢氧化钾，在30-35℃下搅拌反应12-15h，反应完成后加入乙酸乙酯稀释，去离子水洗涤，有机相蒸去溶剂后再次溶解在二氯甲烷中，加入三氟乙酸，室温下搅拌反应2-3h，反应完成后依次加入饱和碳酸钠溶液稀释、乙酸乙酯萃取，有机相以饱和盐水洗涤，干燥后蒸去溶剂，得到产物b；
16.(4)称取1,3,5-苯三甲酸并溶解在二甲基甲酰胺中，升温至35-40℃，加入n，n-二异丙基乙胺、步骤(1)所述酵母细胞壁和所述产物b，在室温和保护气氛下搅拌反应3-4h，分离沉淀并以饱和盐水洗涤，得到产物c；
17.(5)将所述产物c、所述产物a分散在二氯甲烷中，加入抗坏血酸钠、碘化亚铜和五甲基二乙烯三胺，在室温和保护气氛下搅拌反应过夜，分离沉淀并以去离子水洗涤，冻干后制得。
18.优选的，所述益生菌包括嗜酸乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌、唾液酸乳杆菌、嗜热链球菌和枯草芽孢杆菌，其活菌配合比例为(1.3-1.5)：(1.3-1.5)：1：1：1。
19.优选的，所述益生菌由畜禽肠道分离纯化扩增所得。
20.优选的，所述复合酶制剂包括葡萄糖氧化酶。
21.优选的，所述饲用原料中还添加有天然植物提取物，所述天然植物提取物包括金银花提取物、山茶油提取物、甘草酸、紫锥菊提取物、丁香酚、桂皮醛和黄苓苷。
22.本发明的有益效果为：
23.针对现有技术中的霉菌毒素的生物降解效率低下的问题，本发明在现有的生物降解方法基础上通过吸附富集的方法提高霉菌毒素的生物降解效率，具体的，本发明以酵母细胞壁为吸附材料，以益生菌复合酶制剂作为生物降解材料，既降解了霉菌毒素，又提高了
降解效率，可以兼具两种方法的处理优势；针对现有吸附材料吸附量不高的问题，本发明以可生物降解的plga纳米胶束为模板，以酵母细胞壁为壳层制备为吸附材料，利用酵母细胞壁间的组装间隙提高对霉菌毒素的吸附量和富集作用；进一步的，本发明在所述吸附材料的基础上还通过表面改性进一步提高其吸附选择性和吸附量，具体的，先以ω-卤代烷基酸对吡啶环进行季铵化，再与叠氮醇通过酯化反应引入叠氮基，得到具有两亲性的含叠氮基季铵化产物；以氨丁三醇为骨架，氨基保护后通过醇羟基引入炔基，以均苯三甲酸为支化骨架，以羧基与脱保护后的骨架氨基以及酵母细胞壁表面的氨基反应连接所述酵母细胞壁，再以多元炔基通过叠氮-炔点击反应将所述具有两亲性的含叠氮基季铵化产物引入，得到具有表面强极性和两亲性长链结构的改性酵母细胞壁，提高与包括强/弱极性的多种霉菌毒素的亲和性，有利于霉菌毒素的捕获和富集，进而提高吸附选择性、吸附量和吸附效率，再通过益生菌和复合酶制剂的生物降解作用进行高效降解，进而实现低掺量下的高效去除；本发明还通过加入多种具有抗菌性的天然植物提取物以降低霉菌活性，进而抑制霉菌毒素的产生，实现抑制产生、吸附和降解的多重作用。
具体实施方式
24.结合以下实施例对本发明作进一步描述。
25.实施例1
26.一种饲用原料中霉菌毒素的生物降解方法，具体是在饲用原料中加入霉菌毒素吸附剂和生物降解剂制备为饲料或饲料前体，其中，所述吸附剂包括酵母细胞壁；所述生物降解剂包括益生菌和复合酶制剂；
27.所述益生菌包括嗜酸乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌、唾液酸乳杆菌、嗜热链球菌和枯草芽孢杆菌，其活菌配合比例为4：4：3：3：3；
28.所述嗜酸乳杆菌、嗜淀粉乳杆菌、唾液酸乳杆菌、嗜热链球菌是从畜禽肠道内容物中分离得到的菌种，其制备过程可参照公开号cn109938244a的专利内容；
29.所述复合酶制剂为所述霉菌毒素降解酶，包括t-2毒素降解酶、伏马毒素降解酶、黄曲霉毒素降解酶、呕吐毒素降解酶、玉米赤霉烯酮降解酶、赭曲霉毒素降解酶中的一种或几种；
30.所述饲用原料与所述霉菌毒素吸附剂、所述生物降解剂的混合质量比例为1000：2.5：6；所述生物降解剂中所述益生菌和所述复合酶制剂的质量比例为3：1。
31.实施例2
32.一种饲用原料中霉菌毒素的生物降解方法，同实施例1，区别在于，所述酵母细胞壁的制备方法包括以下步骤：
33.(1)将干酵母或废弃酵母分散在盐水中质解，离心分离沉淀，经洗涤、干燥后得到细胞壁原料，将所述细胞壁原料分散在乙醇的水溶液中，得到分散液a；称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物并溶解在四氢呋喃中，配制为浓度20g/l的溶液，按体积比1：4分散在去离子水中，得到分散液b，在所述分散液b中加入所述分散液a，混合搅拌后离心分离沉淀，经洗涤、干燥后得到所述酵母细胞壁；其中，所述细胞壁原料与所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比例为2.4：1。
34.实施例3
35.一种饲用原料中霉菌毒素的生物降解方法，同实施例2，区别在于，所述酵母细胞壁的制备方法还包括以下步骤：
36.(2)分别称取等摩尔的3,5-二甲基吡啶0.53g和溴代十二烷酸1.79g并溶解在40ml的乙腈溶剂中，升温至60℃并搅拌反应6.5h，反应完成后减压蒸去乙腈溶剂，以20ml的冷乙醚洗涤后溶解在20ml二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶0.18g、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酸二亚胺盐酸盐1.2g和2-叠氮基乙醇0.7g，在室温和氮气气氛下搅拌反应过夜，反应完成后减压蒸去溶剂，以硅胶(500目，流动相为1：3的乙酸乙酯/石油醚)层析柱除去未反应单体，得到产物a；
37.(3)分别称取氨丁三醇5.3g和二碳酸二叔丁酯7.0g并分散溶解在40ml叔丁醇溶剂中，在室温下搅拌反应过夜，反应完成后减压蒸去溶剂，以冷的乙酸乙酯洗涤后再次溶解在30ml四氢呋喃中，在氮气气氛下加入3-溴丙炔16.2g和氢氧化钾9.5g，在30-35℃下搅拌反应13h，反应完成后加入等体积的乙酸乙酯稀释，加入去离子水洗涤，取有机相，减压蒸去溶剂后再次溶解在30ml二氯甲烷中，加入三氟乙酸14ml，在室温下搅拌反应2h，反应完成后依次加入饱和碳酸钠溶液稀释、乙酸乙酯萃取，取有机相以饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后过滤，减压蒸去溶剂，得到产物b；
38.(4)称取1,3,5-苯三甲酸6g并溶解在40mln,n-二甲基甲酰胺中，升温至35-40℃，加入n，n-二异丙基乙胺4ml、步骤(1)所述酵母细胞壁9.6g和所述产物b1.12g，在室温和氮气气氛下搅拌反应3h，反应完成后分离沉淀并以饱和盐水洗涤，得到产物c；
39.(5)将所述产物c 9.6g、所述产物a0.8g分散在二氯甲烷中，加入抗坏血酸钠1.3g、碘化亚铜0.09g和五甲基二乙烯三胺0.3ml，在室温和氮气气氛下搅拌反应过夜，反应完成后分离沉淀并以去离子水洗涤，冻干后制得。
40.实施例4
41.一种饲用原料中霉菌毒素的生物降解方法，同实施例2，区别在于，所述复合酶制剂包括有葡萄糖氧化酶(2wt.％)。
42.实施例5
43.一种饲用原料中霉菌毒素的生物降解方法，同实施例2，区别在于，所述饲用原料中还添加有天然植物提取物，所述天然植物提取物包括金银花提取物、山茶油提取物、甘草酸、紫锥菊提取物、丁香酚、桂皮醛和黄苓苷。
44.对比例
45.一种饲用原料中霉菌毒素的生物降解方法，同实施例1，区别在于，不含霉菌毒素吸附剂。
46.以添加霉菌毒素吸附剂和生物降解剂的全价料为样品，以不添加添加霉菌毒素吸附剂和生物降解剂的全价料为对照例，对不同存放时间的样品中黄曲霉毒素、呕吐毒素、t-2毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的吸附情况进行测定，利用雷杜r6000酶标仪在450nm处吸光值，利用标准曲线法标定霉菌毒素，测定结果如下表(单位：ppm)：
[0047][0048]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。