动物饲料组合物及其用途的制作方法

本发明涉及一种用于改善动物在妊娠期和/或哺乳期期间的健康状况和性能的方法。

背景技术：

1、胞壁质酶，也称为溶菌酶，是许多生物体产生作为对抗细菌的防御机制的o-糖基水解酶。所述酶通过切割肽聚糖(细菌中的重要结构分子)的糖苷键引起细菌细胞壁的水解。在细菌细胞壁已经被胞壁质酶作用削弱后，细菌细胞会因渗透压不平衡而裂解。

2、胞壁质酶天然存在于许多生物体中，例如病毒、植物、昆虫、鸟类、爬行动物和哺乳动物中。胞壁质酶已被分为五种不同的糖苷水解酶(gh)家族(cazy,www.cazy.org)：母鸡卵清胞壁质酶(gh22)、鹅卵清胞壁质酶(gh23)、噬菌体t4胞壁质酶(gh24)、鞘脂单胞菌属(sphingomonas)鞭毛蛋白(gh73)和拟鞘孢属(chalaropsis胞壁质酶(gh25)。已知来自gh23和gh24家族的胞壁质酶主要来自噬菌体，并且最近才在真菌中被鉴定出。已发现胞壁质酶家族gh25在结构上与其他胞壁质酶家族无关。

3、胞壁质酶已由于其天然丰度而传统上从母鸡卵清中提取，并且直到最近，母鸡卵清胞壁质酶还是唯一研究用于动物饲料的胞壁质酶。从母鸡卵清中提取的胞壁质酶是商业市场上可获得的主要产品，但不切割例如金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)细胞壁中的n,6-o-二乙酰基胞壁酸，并且因此尤其无法裂解这种重要的人类病原体(masschalck b、deckers d、michiels cw(2002),“lytic and nonlytic mechanism ofinactivation of gram-positive bacteria by muramidase under atmospheric andhigh hydrostatic pressure”,j food prot.65(12):1916-23)。

4、wo2000/21381公开了一种组合物，所述组合物包含至少两种抗微生物酶和多不饱和脂肪酸，其中所述抗微生物酶中的一种抗微生物酶是来自鸡卵清的gh22胞壁质酶。gb2379166公开了一种组合物，所述组合物包含破坏细菌的肽聚糖层的化合物和破坏细菌的磷脂层的化合物，其中所述破坏肽聚糖的化合物是来自鸡卵清的gh22胞壁质酶。

5、wo2004/026334公开了一种用于抑制家畜肠道中肠道病原体生长的抗微生物组合物，所述抗微生物组合物包含(a)裂解细胞壁的物质或其盐、(b)抗微生物物质、(c)螯合剂和(d)羊毛硫细菌素，其中所述裂解细胞壁的物质或其盐是来自母鸡卵清的gh22胞壁质酶。

6、令人惊讶的是，本发明的发明人探索出补充到哺乳期日粮中的胞壁质酶提供对妊娠期和/或哺乳期期间的动物的健康状况和性能的有益效应。

技术实现思路

1、因此，本发明提供了一种用于改善在妊娠期和/或哺乳期期间的雌性动物及其仔畜的健康状况和/或性能的方法，所述方法包括向所述雌性动物施用一种或多种微生物胞壁质酶。

2、序列表的概述

3、seq id no:1是具有n末端spirr的来自嗜碱枝顶孢菌(acremoniumalcalophilum)的野生型gh25胞壁质酶的成熟氨基酸序列，如wo 2013/076253中所述。

4、seq id no:2是从囊状长毛盘菌(trichophaea saccata)分离的gh24胞壁质酶的基因序列。

5、seq id no:3是从seq id no:2推导的氨基酸序列。

6、seq id no:4是来自囊状长毛盘菌的野生型gh24胞壁质酶的成熟氨基酸序列。

7、seq id no:5是来自原鸡(gallus gallus)的野生型gh22胞壁质酶(母鸡卵清胞壁质酶)的成熟氨基酸序列。

8、seq id no:6是引物f-80470。

9、seq id no:7是引物r-80470。

10、seq id no:8是引物8643。

11、seq id no:9是引物8654。

12、seq id no:10是来自嗜碱枝顶孢菌的野生型gh25胞壁质酶的成熟氨基酸序列，如wo 2013/076253中所述。

13、定义

14、微生物胞壁质酶：术语“微生物胞壁质酶”意指获自或可获自微生物来源的具有胞壁质酶活性的多肽。微生物来源的示例有真菌；即，胞壁质酶获自或可获自真菌界，其中术语界是分类级别。具体地，微生物胞壁质酶获自或可获得自子囊菌门(ascomycota)，例如盘菌(pezizomycotina)亚门，其中术语门和亚门是分类级别。

15、如果多肽的分类级别未知，则本领域技术人员可以通过执行多肽的blastp搜索(使用例如国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information,ncib)网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)并将其与最接近的同源物进行比较来容易地确定所述分类级别。作为已知多肽的片段的未知多肽被认为属于相同的分类物种。在多达10个位置中包含取代、缺失和/或插入的未知天然多肽或人工变体被认为来自与已知多肽相同的分类物种。

16、胞壁质酶活性：术语“胞壁质酶活性”意指在肽聚糖中的n-乙酰胞壁酸与n-乙酰基-d-葡糖胺残基之间或在壳糊精中的n-乙酰基-d-葡糖胺残基之间的1,4-β-键的酶促水解，产生由于渗透压而导致的溶菌作用。胞壁质酶属于酶类别ec 3.2.1.17。胞壁质酶活性通常通过浊度测定来测量。该方法基于胞壁质酶的裂解作用诱发的藤黄微球菌(micrococcus luteus)atcc 4698悬浮液的浊度变化。在适当的实验条件下，这些变化与培养基中胞壁质酶的量成比例(参见联合国(un)粮食及农业组织食品添加剂标准综合纲要(www.fao.org)的ins1105)。出于本发明的目的，根据实施例5(“胞壁质酶活性的测定”)中所述的浊度测定来测定胞壁质酶活性。在一个方面中，本发明的多肽具有seq id no:1的胞壁质酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。在一个方面中，本发明的多肽具有seq id no:4的胞壁质酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。在一个方面中，本发明的多肽具有seq id no:10的胞壁质酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。

17、片段：术语“片段”意指具有成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽或催化结构域；其中所述片段具有胞壁质酶活性。在一个方面中，所述片段包含seq id no:1的至少170个氨基酸，例如至少175个氨基酸、至少177个氨基酸、至少180个氨基酸、至少185个氨基酸、至少190个氨基酸、至少195个氨基酸或至少200个氨基酸，并且具有胞壁质酶活性。

18、在另一方面中，所述片段包含seq id no:4的至少210个氨基酸，例如至少215个氨基酸、至少220个氨基酸、至少225个氨基酸、至少230个氨基酸、至少235个氨基酸或至少240个氨基酸，并且具有胞壁质酶活性。

19、在一个方面中，所述片段包含seq id no:10的至少170个氨基酸，例如至少175个氨基酸、至少177个氨基酸、至少180个氨基酸、至少185个氨基酸、至少190个氨基酸、至少195个氨基酸或至少200个氨基酸，并且具有胞壁质酶活性。

20、分离的：术语“分离的”意指为在自然界中在环境中不存在的形式的物质。分离物质的非限制性示例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)被从在自然界中与其缔合的天然存在的成分中的一种或多种或所有天然存在的成分至少部分地去除的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的物质经人工改性的任何物质；或(4)通过相对于与其天然缔合的其他组分增加该物质的量而改性的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；使用比与编码该物质的基因天然缔合的启动子更强的启动子)。分离物质可以存在于发酵液样品中。

21、成熟多肽：术语“成熟多肽”是指处于在翻译和任何翻译后修饰(例如n末端处理、c末端截断、糖基化、磷酸化等)之后的最终形式下的多肽。

22、序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。

23、出于本发明的目的，使用如在emboss包的needle程序(emboss:the europeanmolecular biology open software suite,rice等人，2000,trends genet.16:276-277)，优选地5.0.0或更高版本中实现的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是为10的空位开放罚分、为0.5的空位延伸罚分，以及eblosum62(eblosum62的emboss版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”(使用-nobrief选项获得的)的needle输出用作同一性百分比，并且计算如下：

24、(相同残余物×100)/(比对长度-比对中总空位数)

25、变体：术语“变体”意指具有胞壁质酶活性的多肽，所述多肽包含在一个或多个(例如，几个)位置处的一个或多个(几个)氨基酸残基的改变，即取代、插入和/或缺失。取代意指将占据某个位置的氨基酸替换为不同的氨基酸；缺失意指去除占据某个位置的氨基酸；并且插入意指在占据该位置的氨基酸附近并紧接该氨基酸后添加1、2或3个氨基酸。

26、在一个方面中，根据本发明的胞壁质酶变体可包含1至5个；1至10个；1至15个；1至20个；1至25个；1至30个；1至35个；1至40个；1至45个；或1-50个，即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个改变，并且具有亲本胞壁质酶(例如seq id no:1、seq id no:4或seq id no:10)的胞壁质酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。

27、动物饲料：术语“动物饲料”是指适合或旨在被动物摄入的任何化合物、制剂或混合物。用于单胃动物的动物饲料通常包含浓缩物以及维生素、矿物质、酶、直接饲喂的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(例如在预混物中)，而用于反刍动物的动物饲料通常包含草料(包括粗饲料和青贮料)并且还可以包含浓缩物以及维生素、矿物质、酶、直接饲喂的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(例如在预混物中)。

28、浓缩物：术语“浓缩物”意指具有高蛋白质和能量浓度的饲料，例如鱼粉、糖蜜、低聚糖、高粱、种子和谷物(整粒玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦，或通过压碎、碾磨等从例如玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦制成)、油料压榨饼(例如，来自棉籽、红花、向日葵、大豆(例如豆粕)、油菜籽/低芥酸菜籽、花生)、棕榈仁饼、酵母衍生材料和蒸馏酒粕(例如湿蒸馏酒粕(wet distillers grains,wds)和具有可溶物的干蒸馏酒粕(dried distillers grainswith solubles,ddgs))。

29、草料：如本文所定义的术语“草料”还包括粗饲料。草料是来自饲用植物、禾草和其他饲用植物、海藻、发芽谷物和豆类或它们的任何组合的新鲜植物材料，例如干草和青贮料。饲用植物的示例为苜蓿(紫花苜蓿)、百脉根(birdsfoot trefoil)、芸苔属(例如羽衣甘蓝、油菜(卡诺拉)、芜菁甘蓝(瑞典芜菁)、芜菁(turnip))、三叶草(例如杂种车轴草、红车轴草、地三叶草、白三叶草)、禾草(例如狗牙根、雀麦草、假燕麦草、羊茅草(fescue)、欧石楠草(heath grass)、草地早熟禾、鸭茅草(orchard grass)、黑麦草、提摩西草(timothy-grass))、玉米(玉蜀黍)、小米、大麦、燕麦、黑麦、高粱、大豆和小麦以及蔬菜(例如甜菜)。草料还包括来自粮食生产的作物残茬(例如玉米秸秆；来自小麦、大麦、燕麦、黑麦和其他谷物的秸秆)；来自蔬菜的残余物，如甜菜缨(beet tops)；来自油籽生产的残余物，如来自大豆、油菜籽和其他豆类的茎和叶；以及来自供动物或人食用的谷物的提炼或来自燃料生产或其他工业的级分。

30、粗饲料：术语“粗饲料”是指具有高纤维水平的干燥植物材料，例如纤维、麸皮、来自种子和谷粒的外皮以及作物残茬(例如秸秆、干椰子肉、糠秕、甜菜渣)。