专利名称：类固醇生物化学氧化的方法和用于此方法中的遗传工程方法产生的细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备药学上有用的类固醇的生物化学氧化方法。
11β，17α，21-三羟基-4-孕甾-3，20-二酮(氧化可的松)是一种重要的药用类固醇，由于它的药理性质，可将其作为皮质甾类使用和作为制备许多有用类固醇(特别是其它皮质甾类)的起始化合物。氢化可的松由脊椎动物的肾上腺皮质产生，通过繁杂的提取方法从肾上腺皮质组织中只能原始地得到很少的量，只有在阐明结构后，才发展出一些新的生产途径，这些途径的特点是化学合成步骤与微生物转变相结合。只是因为所采用的初始化合物如甾醇、胆汁酸和皂草配基丰富而且便宜，目前的这些方法提供了不太昂贵的产品，但是这些方法仍然相当复杂。设想了几种改进现行方法的可能性，生物化学的方法也已进行过尝试。
有一种尝试是使用分离的肾上腺皮质蛋白(这些蛋白已知是与类固醇在体内的酶学转化有关)的一个体外生物化学系统，将一合适的初始类固醇转化为氢化可的松。然而，分离这些重要蛋白的困难性和必需的辅助因子的昂贵价格看来使有经济吸引力的大规模生产不能实现。另一种方法是将催化酶保留在其天然环境中并在细胞培养中使肾上腺皮质细胞产生所需的氢化可的松。但是，由于在实践中这些细胞的繁殖率低，要使得这样一种生化方法在经济上具有吸引力看来也是不可能的。
哺乳动物和其它脊椎动物肾上腺皮质中的体内过程构成了一种生化途径，它是以胆甾醇开始的，经由各种中间产物最终得到氢化可的松(见
图1)。这种途径中涉及8种蛋白质，其中有5种是酶，而4种是细胞色素P450酶，其它3种是电子转移蛋白。
第一步是胆甾醇向3β-羟基-5-孕甾-20-酮(孕烯醇酮)的转化。在这种转化中(即一种单氧化酶反应)，涉及三种蛋白质侧链裂解酶(P450SCC，一种含亚铁原卟啉-铁的蛋白)，肾上腺皮质铁氧还蛋白(ADX，一种含Fe2S2的蛋白)和肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(ADR，一种含FAD的蛋白)。此外，以胆甾醇作为底物的反应进一步需要分子氧和NADpH。
接着是通过脱氢作用/异构作用将孕烯醇酮转化为4-孕甾-3，20-二酮(孕酮)。该反应由蛋白质3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶(3β-HSD)催化，它需要孕烯醇酮和NAD+。
为了得到氢化可的松，再在孕酮的三个位置进行羟化，这种转化由单氧化酶催化。在孕酮转化为17α-羟基孕甾酮时涉及两种蛋白质类固醇17α-羟化酶(P45017α，一种含亚铁原卟啉-铁的蛋白)和NADPH细胞色素P450还原酶(RED，一种含FAD-和FMN的蛋白质)。该反应消耗孕酮，分子氧和NADPH。17α-羟基孕酮转化为17α-21-二羟基-4-孕甾-3，20-二酮(去氧可的松)时也需要两种蛋白质类固醇-21-羟化酶(P450C21，一种含亚铁原卟啉-Fe的蛋白质)和前面提及的蛋白质RED。该反应消耗17α-羟基孕酮，分子氧和NADPH。去氧可的松转变为氢化可的松涉及三种蛋白质类固醇11β-羟化酶(P45011β，一种含亚铁原卟啉-Fe的蛋白质)和上面提及的蛋白质ADX和ADR。
如上所述细胞色素P450蛋白质是胆甾醇向氢化可的松进行生化转化所必须的酶。这些酶隶属于细胞色素P450蛋白类(或简称P450蛋白质)的一个更大的组群，它们已经在原核生物(各种细菌)和真核生物(酵母、霉菌、植物和动物)中遇见过，发现在哺乳动物的肾上腺皮质、卵巢、精巢和肝中，P450蛋白质含量较高。许多P450蛋白已进行了纯化及对其特性进行了很好的描述，它们的特异活性已被测定，最近已经发表了许多有关这方面的评述，如K.Ruckpaul和H.Rein(编)，“细胞色素P450”和P.R.Ortiz de Montellano(编)“细胞色素P450、结构、机制和生物化学”。细胞色素P450蛋白的特征在于用一氧化碳还原后，在450nm处的特异性最大吸收。在原核生物中，P450蛋白质既可和膜结合也可存在于细胞质中，就目前已经对细菌P450蛋白的详细研究(如P450meg和P450cam)表明，在其羟化活性中涉及到一种铁氧还蛋白和一种铁氧还蛋白还原酶。对真核生物的两类P450蛋白质，Ⅰ和Ⅱ型已经进行了描述，两者的不同点在于1.亚细胞定位Ⅰ型位于微粒体部分而Ⅱ型位于线粒体内膜上。2.将电子转递给P450蛋白的途径Ⅰ型通过NADPH由P450还原酶还原，而Ⅱ型则通过NADPH由铁氧还蛋白还原酶(如肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶)和铁氧还蛋白(如肾上腺皮质铁氧还蛋白)还原。
根据EP-A-0281245，细胞色素P450酶可从链霉菌属菌种制备并用于化合物的羟化作用。
该酶以分离形式使用，它是一个相当麻烦和昂贵的方法。
JP-A-62236485(德温特87-331234)中指出可以将肝细胞色素P450酶的基因导入啤酒酵母菌中并表达这些基因，以此提供可利用它们的氧化活性的酶。
然而，在上述文献中没有说明用细胞色素P450酶来制备类固醇化合物。
本发明提供了生产蛋白质的多重表达基因盒，这些基因盒是构建一步就能将不贵的类固醇起始物转化为更稀有和昂贵的最终产物的多基因系统必须的，在其中，这种转化是在一些天然系统中通过多酶催化和辅助因子中介的转化完成的，如从胆甾醇生产氢化可的松。本发明的表达基因盒在最终产生进行这些多步转化的多基因系统中是有用的。
因此，一方面，本发明与在重组宿主细胞中表达异源编码DNA序列起作用的表达基因盒有关。这里所说的编码序列编码了一种酶，该酶能单独地或与另外的蛋白质一起，催化胆甾醇转化成氢化可的松的生物途径中的氢化步骤。因此，本发明的表达基因盒包括了在重组宿主中能产生下列蛋白质的基因盒，这些蛋白质是侧链裂解酶(P450SCC);肾上腺皮质铁氧还蛋白(ADX);肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(ADR);3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶(3β-HSD);类固醇17α-羟化酶(P45017α);NADpH细胞色素P450还原酶(RED);类固醇-21-羟化酶(P450C21);和类固醇11β-羟化酶(P45011β)。
另一方面，本发明涉及用本发明表达基因盒转化的重组宿主细胞、生产上述酶和用它们进行氧化作用的方法、在培养肉汤中使用所述宿主细胞进行特异氧化的方法和含有用所述方法制备的化合物的药物组合物。
附图中所用的缩写R1，EcoRⅠ;H，HindⅢ;Sc，ScaⅠ;P，PstⅠ;K，KpnⅠ;St，StuⅠ;Sp，SphⅠ;X，XbaⅠ;N，NdeⅠ;S，SmaⅠ;Ss，SstⅠ;Rv，EcoRⅤ;SI，SacⅠ;B，BamHⅠ;SⅡ，SacⅡ;Sal，SalⅠ;Xh，XhoⅠ;Pv，PvuⅡ;Bg，BglⅡ和M，MluⅠ。
图1表示的是在哺乳动物的肾上腺皮质中胆甾醇向氢化可的松转化中各接连步骤所涉及的蛋白质的图解。
图2表示质粒PGBSCC-1的构建，P450SCC序列用方框(
)表示。
图3表示将含有5′-P450SCC-序列的合成衍生的PstⅠ/HindⅢ片段插入质粒PTZ18R得到质粒PTZsynlead。
图4表示将合成的P450SCCcDNA全长(
)和用cDNA克隆(
)衍生的P450SCC序列构建到PTZ18R中得到PGBSCC-2。
图5表示质粒PBHA-1的完整的核苷酸序列。
图6是PGBSCC-3构建的图解描述。将来自质粒PGBSCC-2的P450SCCcDNA序列导入杆菌属/大肠杆菌的往返复粒PBHA-1。方框中充填的如图4图解中指出的一样。
图7表示将一个NdeⅠ限制性位点与P450SCC成熟位点前的一个ATG起始密码子一起导入到PGBSCC-3中得到PGBSCC-4。
图8表示PGBSCC-5的物理图，该质粒通过从质粒PGBSCC-4去除E.Coli序列而得到。
图9表示用抗体对P450SCC进行探针Western印迹分析，分析证明了导入到枯草杆菌(行C)和地衣型芽胞杆菌(行f)中的质粒PGBSCC-5的P450SCC表达。从枯草杆菌和地衣型芽胞杆菌得到的对照提取物分别表示在行a和d中。作为对照，纯化的肾上腺皮质P450SCC(30ng)也加入到这些对照提取物中(分别为行b和e)。
图10是PGBSCC-17构建的图解描述。将来自质粒PGBSCC-4的编码P450SCC-DNA的序列导入大肠杆菌表达载体PTZ18RN。方框(
)中表示P450SCC序列。
图11表示大肠杆菌JM101中PGBSCC-17的P450SCC的表达。
(a)对从大肠杆菌对照菌株(行3)和大肠杆菌转化株SCC-301和302(分别为行1和2)制备的细胞蛋白部分(20μl)的SDS/PAGE和考马斯亮兰染色。400ng纯化的牛P450SCC(行4)在图中作为对照。
(b)用抗体对由对照菌株大肠杆菌JM101(行2)和由大肠杆菌转化株SCC-301(行3)和SCC-302(行4)制备的细胞蛋白部分(5μl)的P450SCC进行探针Western印迹分析。100ng纯化牛P450SCC(行1)作为对照。
图12表示质粒PUCG418的构建。
图13表示通过将带有乳糖酶多克隆位点(
)的启动子和终止区插入PUCG418构建酵母表达载体PGB950。为了得到PGBSCC-6，将含有ATG起始密码子的合成SalⅠ/XhoⅠ片段和P450SCC的前8个氨基酸的密码子插入PGB950。
图14是一个图解描述，表示酵母P450SCC表达基因盒PGBSCC-7的构建。
图15表示用蛋白P450SCC的特异性抗体探针得到的Western印迹分析。
印迹A含有的提取物来自用PGBSCC-10转化的啤酒酵母273-10B(行1);来自作为对照的啤酒酵母273-10B(行2)，来自用PGBSCC-7转化的KluyveromyceslactisCBS2360(行3)和来自作为对照的K.lactisCBS2360(行4)。印迹B包含的提取物来自作为对照的K.lactisCBS2360(行1)和用PGBSCC-15(行2)、PGBSCC-12(行3)或PGBSCC-7(行4)转化的K.lactisCBS2360。印迹C包含的提取物来自作为对照的啤酒酵母273-10B(行1)，来自用PGBSCC-16(行2)或PGBSCC-13(行3)转化的啤酒酵母273-10B。
图16是构建含有来自啤酒酵母等细胞色素CI(cyc-1)启动子的酵母表达载体PGBSCC-9的图解表示。
图17表示含有啤酒酵母表达载体PGBSCC-10的P450SCCcDNA的构建图。
图18表示P450SCC表达载体PGBSCC-12的构建，其中合成获得的编码前-P450SCC序列(
)的DNA-片段是在成熟P450SCC的编码序的5′端插入的。
图19表示PGBSCC-13的构建。这个用于啤酒酵母的P450SCC表达基因盒在啤酒酵母cyc-1启动子的3′端有前-P450SCCcDNA序列。
图20是质粒PGBSCC-14和PGBSCC-15构建的图解表示，后者含有在框内的P450SCC编码序列和细胞色素氧化酶Ⅵ前序列(
)。
图21表示质粒PGBSCC-16的构建，在该质粒中，啤酒酵母的细胞色素氧化酶Ⅵ前序列
在cyc-1启动子的3′端与编码P450SCC序列融合。
图22表示质粒PGB17α-1(A)和PGB17α-2(B)的物理图，该两质粒分别含有P45017αcDNA的3′端1.4Kb片段和5′端345bp片段
。在含有P45017αcDNA序列完整长度的PGB17α-3(C)中，表示出了ATG起始密码子的位置。
图23表示通过离体诱变得到的PGB17α-3的突变。得到的质粒PGB17α-4含有SalⅠ限制性位点，其后是合适的酵母翻译信号，它正好在ATG起始密码的上游。
图24是酵母P45017α表达基因盒PGB17α-5的构建图解。
图25表示通过离体诱变得到的PGB17α-3的突变。获得的质粒PGB17α-6在ATG起始密码子处有一个NdeⅠ限制性位点。
图26是PGB17α-7构建的图解说明，将来自质粒PGB17α-6的P45017αcDNA序列导入杆菌属/大肠杆菌往返质粒PBHA-1中。
图27表示PGB17α-8的物理图，这种质粒是从质粒PGB17α-7中除去大肠杆菌序列而获得的。
图28表示PGBC21-1和-2的物理图，此两质粒在克隆载体PTZ18R的EcoRⅠ位上分别含有1.53Kb的3′-P450C21cDNA和540bp的5′-P450C21cDNAEcoRⅠ片段。
图29表示通过PGBC21-2的多聚酶的链反应(PCR)。将EcoRⅤ和NdeⅠ限制性位点导入P450C21ATG起始密码子的上游进行离体突变。再用分子克隆克隆到克隆载体PSP73中得到PGBC21-3。
图30是含有全长P450C21cDNA序列的PGBC21-4构建图。
图31是构建PGBC21-5的图解描述，将来自质粒PGBC21-4的P450C21cDNA序列导入杆菌属/大肠杆菌往返质粒(Shuttle Plasma)PBHA-1。
图32表示PGBC21-6的物理图，它是从质粒PGBC21-5除去大肠杆菌序列得到的。
图33表示通过离体诱变得到的PGBC21-2的突变，所获得的质粒PGB21-7含有一个SalⅠ限制性位点，其后为合适的酵母翻译信号，它正好在ATG起始密码的上游。
图34表示PGBC21-8的构建，该质粒含有适合于克隆到酵母表达载体上的具有修饰的侧面限制性位点的全长度P450C21cDNA。
图35是构建酵母P450C21表达基因盒PGBC21-9的图解描述。
图36表示的是离体诱变，即通过PGB11β-1的聚合酶的链反应，将合适的侧面限制性位点和ATG起始密码导入全长的P45011βcDNA序列中，再分子克隆到杆菌/大肠杆菌往返载体PBHA-1中，得到质粒PGB11β-2。
图37表示通过PGB11β-1的聚合酶的链反应，将合适的侧面限制性位点和ATG起始密码导入整长的P45011βcDNA序列中进行离体诱变，再分子克隆到酵母表达载体PGB950中，得到质粒PGB11β-4。
图38是通过聚合酶链反应，从牛肾上腺皮质多聚A+RNA/cDNA混合物得到的ADXcDNA进行分子克隆的图解说明。将编码成熟ADX蛋白的cDNA序列插入酵母表达载体PGB950合适的位点，得到质粒PGBADX-1。
图39表明了用ADX的抗体探针得到的Western印迹分析，证明了在K.lactsCBS2360转化株ADX-101和102(分别为行4和5)中质粒PGBADX-1的ADX表达，对照菌株K.latisCBS2360的提取物在行3中表示，为了比较，在行1中对凝胶还提供了纯化的肾上腺皮质ADX(100ng)。
图40表示了通过PGBADR-1的聚合酶的链反应，将合适的侧面限制性位点和ATG起始密码子导入全长的ADRcDNA序列中进行离体诱变，再分子克隆到酵母表达载体PGB950中，产生质粒PGBADR-2。
本发明包括制备和培养适合于在大规模生化生产反应器中采用的细胞，以及使用这些细胞进行化合物的氧化作用，尤其是用于如图1所示的类固醇的生产，图示的每个反应可分别进行，本发明也包括了在一个多步反应中一些步骤的相互交换。优选的宿主是微生物，但是也可利用其他细胞，如可以是在细菌培养中或活的转移基因动植物或动物组织中的植物或动物细胞。本发明的细胞是通过用载体对合适的受体细胞(最好是合适的微生物细胞)的遗传学转化作用获得，这种含有编码了与胆甾醇转化为氢化可的松有关的蛋白质的DNA序列，这些蛋白包括侧链裂解酶(P450SCC)、肾上腺皮质铁氧还蛋白(ADX)、肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(ADR)、3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶(3β-HSD)、类固醇-17α-羟化酶(P45017α)，NADPH细胞色素P450还原酶(RED)。类固醇-21-羟化酶(P450C21)和类固醇-11β-羟化酶(P45011β)。有些宿主细胞它们本身已经可以以足够的水平产生一种或多种必须蛋白质，因此，只需用补充的DNA序列转化它们。这种自身可产生的蛋白质为铁氧还蛋白，铁氧还蛋白还原酶、P450还原酶、和3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶。
已经选择了一些合适的DNA源来补偿编码子与胆甾醇转化为氢化可的松有关的蛋白的序列。补充编码了与胆甾醇转化为氢化可的松有关的所有蛋白的DNA的合适源是脊椎动物的肾上腺皮质组织，如牛肾上腺皮质组织。各种微生物的有关的DNA也能补充，如来自睾丸素假单胞菌(Pseudomas Testosteroni)，灰色肉性链霉菌(Streptomyces griseocarneus)或类固醇短颈细菌(Brevibacterium sterolicum)的DNA用于编码3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶和来自Curvularia lunata或布累克氏瘦克银汉霉菌(Cunninghamella blakesleeana)的DNA用于编码与11β-脱氧皮甾醇的11β-羟化作用有关的蛋白质。分离编码了牛P450SCC、牛P45011β蛋白或微生物相当的蛋白、牛肾上腺皮质铁氧还蛋白、牛肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶、3β-羟基类固醇脱氧酶/异构酶(牛的或微生物的)、牛P45017α、牛P450C21和牛的或微生物的NADPH细胞色素、P450还氧酶的DNA序列的步骤如下1.真核序列(cDNA′s)
a.由合适的组织制备全部RNAb.将含RNA的多聚A+转录成双股cDNA，连接到噬菌体载体中。
c.得到的cDNA库用32P标记的、对所需cDNA特异的寡聚物进行筛选，选出所需的cDNA或用一种特异性(125I标记了的)抗体对异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖(IPTG)诱导的λ-gtllcDNA库进行筛选。
d.根据形成的阳性噬菌斑数(Pfu′s)来证明cDNA插入部分插入合适载体-用核菌酶定序法得到的cDNA的整长2.原核基因a.由一个合适的微生物制备基因组DNA。
b.为了得到DNA库，将DNA片段克隆到合适载体中，并对一种合适的大肠杆菌宿主进行转化。
c.得到的DNA库用32P标记的对目的基因特异的寡聚物进行筛选或用一种特异(125I标记了的)抗体对IPTG诱导的λ-gtllcDNA进行筛选。
d.分离阳性克隆的质粒，将插入的DNA片段亚克隆入合适的载体内来证明-基因的整个长度注根据改进的方法，通过被称为聚合酶的链反应(PCR)(Saiki等人，Science，239，487-491，1988)的方法，用两种特异寡聚物放大本发明目的的cDNA(真核生物序列)或基因(原核生物序列)。然后，再将扩大的cDNA或DNA插入合适的载体。
本发明的一方面提供了合适的表达基因盒，这些基因盒的异源DNA是用前面的步骤分离的，并被放在适当的控制序列之间以进行转录和转译，使得DNA在一个合适宿主的细胞环境中被表达，提供所需的一种或多种蛋白质。也可以在这些起始控制序列后有一个分泌信号序列。
通过所述的表达基因盒必须把合适控制序列导入结构DNA中，通过合适宿主细胞和含有控制序列(它与相关宿主一致，可操纵地与所需表达的编码序列连接)的载体转化作用，可以进行表达。
另外，采用了存在于宿主基因组中合适的控制序列。通过合适宿主细胞和含所需要的蛋白编码序列的载体的转化作用也可进行表达。这些编码序列与宿主基因组同源重组的宿主序列是侧面连接的，并使宿主控制序列适当地控制导入DNA的表达。
作为总的理解，术语控制序列包括对可操纵地连于其上的编码序列表达的合适调节是必要的所有的DNA片段如操纵子、促进子和尤其是启动子和控制转录的序列。
启动子可受或可以不受调节它的环境控制，原核生物的合适启动子有如trp启动子(由色氨酸的丧失来诱导)、lac启动子(由乳糖类似物IPTG诱导)、β-乳胺酶(β-Lactamase)启动子和噬菌体衍生的PL启动子(由温度变化诱导)。此外，尤其适用于在杆菌中表达的有用启动子有α-淀粉酶、蛋白酶、Spoz、Spac和φ105的启动子以及合成的启动子序列。优选的启动子是在图5中表示的启动子，用“HpaⅡ”表示。适合于在酵母中表达的合适启动子有3-磷酸甘油酸激酶启动子及其其他糖酵解酶的启动子和乙醇脱氢酶和酵母磷酸酶的启动子。转录延长因子(TEF)和乳酸酶的启动子也是合适的，哺乳动物表达系统通常采用来自病毒的启动子(如腺病毒启动子和SV40启动子)，但是它们还包括可调节启动子(如金属硫因启动子，它由重金属或糖皮质激素的浓度控制)。现在，以病毒为基础的昆虫细胞表达系统和以如nopaline合成酶启动子这样的植物细胞启动子的表达系统也是适宜的。
转译控制序列在原核生物系统中有一个核结合位点(RBS)，而在真核生物系统中转译可由含如AUG那样的启始密码子的核苷酸序列来控制。
除了必须的启动子和转译控制序列外，许多其他控制序列，包括调节终止(如真核生物系统中的多聚腺苷作用序列)可用于控制表达。某些系统含有促进子元素，这些元素是在实现表达时可以是希望的但大部分不是必须的。
本发明还公开了还含有另外一个异源编码序列的表达基因盒，这个异源编码序列编码了一种酶，它能单独地或与一种或多种其他蛋白共同催化图1途径的另一个步骤。
用PGBSCC-n表示的载体组，这里的“n”为1至17的任何整数，这些载体专门开发用在编码P450SCC酶的DNA。
用PGB17α-n表示的另一组载体，这里的“n”表示1至5的任何整数，它们专门开发用于编码P45017α酶的DNA。
还有一组用PGBC21-n表示的载体，这里的“n”是1至9的任一整数，它们专门开发用于编码P450C21的酶的DNA。
还有另一组用PGB11β-n表示的载体。这里的“n”是1至4的任一整数，它们专门开发用于编码P45011β酶的DNA。
根据本发明的另外一个方面，已选择了能接受本发明的载体并使得导入的DNA表达的合适宿主细胞。当培养转化宿主细胞时，与胆甾醇转化为氢化可的松有关的蛋白质出现在其细胞组成中。可用DNA杂交方法证明所需DNA的存在，用RNA杂交方法证明它们的转录，通过免疫法证明它们的表达和在体外或体内与起始化合物一起保温后评定氧化产物的存在，证明它们的活性。
转化的微生物是那些优选的宿主，尤其是细菌(更优选的是大肠杆菌和杆菌属和链球菌属的菌株和酵母(如酵母属和Kluyveromy-ces)。在植物和动物(包括昆虫)中找到其它合适的宿主生物，它们的分离出来的细胞用于细胞培养，如Cos细胞、C127细胞、CHO细胞和Spodoptera frugrperda(Sfg)细胞。另外还可采用转化基因的动物或植物。
特殊类型的重组宿主细胞是导入本发明的两个或更多个表达基因盒或者已由一个至少编码了两种异源蛋白的表达基因盒转化的细胞，使得细胞能产生至少两种与图1中途径有关的两种蛋白。
本发明的一个主要特点是制备的新的细胞不仅能产生类固醇氧化转化作用、最终得到氢化可的松有关的蛋白质，而且完全能将这些蛋白用于加至培养液中的相应的底物化合物预期的氧化转化。类固醇是优选的底物，用异源DNA转化的细胞尤其适用于用图1中提到的类固醇培养，包括其他的甾醇如β-谷甾醇。结果获得被氧化的类固醇。
根据存在于宿主细胞中的编码了与图1途径有关的蛋白质的多重异源DNA，得到包括甾醇的侧链裂解和/或C11，C17，C3和C21上的氧化修饰的几个生物化学转变作用。所以，本发明的表达基因盒在构建一个多基因系统中是有用的，该系统能很快实现图1中表示的多步骤中接连的细胞内转化作用，导入一些所需的宿主表达基因盒可能是必须的，全部基因盒编码了所需的蛋白质。在某些情况中，所述途径涉及的一种或多种蛋白质可能已存在于宿主中作为天然蛋白发挥相同的活性作用。例如在宿主中可能已经存在铁氧还蛋白、铁氧还蛋白还原酶和P450还原酶。在那些情况下，只有剩下的酶才必须通过重组转化作用提供。
作为体内生化转化的一个替换方法，收集与胆甾醇转化为氢化可的松有关的蛋白质，必要时纯化，用于无细胞系统的类固醇的体外转化(如在一个柱上固定化)。另外，含有一种或多种途径的酶的一定程度纯化的混合物本身被用于类固醇转化。一个示例性的宿主含有编码了两种异源蛋白质的DNA，即对产生孕酮所必须的酶P450SCC和蛋白质ADX的DNA。与只有P450SCCDNA的宿主相比较，在加入ADR、NADPH和胆甾醇后的一个无细胞提取物中的孕酮产量大大提高。
本发明提供了一些构建几种有用类固醇的一步生产方法所必须的表达基因盒。从便宜和丰富易得的起始化合物开始，它特别适用于氢化可的松和中间产物的生产。本发明结束了陈腐的传统昂贵的化学反应。中间产物不必被分离。除了新的宿主细胞，在类固醇转化方面，培养这些细胞使用的方法本身与该技术领域中众所周知的生物技术方法相似。
下列实施例进一步说明本发明，但不是对本发明的限制。
例1编码了牛细胞色素P450侧链裂解酶(P450SCC)的整个cDNA的分子克隆采用Maniatis等人，MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratory，1982的手册中描述的普通克隆技术以及DNA和RNA分析。除非特别说明，所有DNA修饰酶、分子克隆载体和大肠杆菌菌株均由供应商提供并按照制造商的说明使用。分离和纯化DNA和RNA的材料和仪器按照供应商的说明使用。
从新鲜的牛肾中制备牛肾上腺皮质组织，正在液氮中速冻并贮存于-80℃。
从冷冻的牛肾上腺皮质中，用Auffrey和Rougeon(Enr.J.Biochem，107，303-314，1980)描述的方法制备全部细胞的RNA。在寡聚(dT)层析上选择多聚A前，于65℃加热全部RNA样本得到肾上腺多聚A+RNA。
与来自牛肾上腺皮质的多聚A+RNA互补的DNA被合成如下用氢氧化甲基汞处理过的10μg多聚A+RNA用β-巯基乙醇中和。将混合物调节至50mM Tris/Hcl(在42℃将PH8.3)，40mM Kcl、6mM Mgcl2、10mM DTT、3000U R Nasin/ml、4mM Na4P2O7、50μg放线菌素D/ml、0.1mg寡聚(dT12-18)/ml、0.5mM dGTP、0.5mM dATP、0.5mM dTTP、0.25mM dCTP和400μCi α32P-d CTP/ml，所有的物质浓度都是在最终体积为100μl中的浓度。将混合物在冰上放置10分钟，于42℃下加热2分钟，加入150U AMV逆转录酶(Anglian Biotechnology Ltd.)起动这种合成，于42℃保温1小时。
加入Gubler和Hoffman(Gene，25，263-269，1983)的DNA聚合酶和R Nase H进行第二条链的合成。用T4DNA聚合酶(BRL)处理ds DNA后得到钝性末端，将decameric EcoRI连接子(Biolabs Inc.)与ds DNA片段连接。用EcoRI(Boehringer)消化后，通过生物凝胶A15m(Bio-Rad)层析从大量的EcoRI连接子中分离双股cDNA片段。通过T4-DNA连接酶(Boehringer)将约200ng含双股cDNA的EcoRI连接子与用10μg EcoRI消化和牛肠道磷酸酶(Boehringer)处理的λ-gtll载体DNA(Promega)连接，就像Huynh等人所描述的那样(在“DNACloning techniquesA Practical approach”，PP.49-78，Oxford IRL-Press，1985中)。在体外进行这种连接混合物包装后得到的噬菌体用来感染大肠杆菌Y1090宿主(Promega)。
从这个cDNA库中，用32P末端标记的合成寡聚物SCC-1(5′-GGC TGA CGA AGT CCT GAG ACA CTG GAT TCA GCA CTGG-3)筛选出约106个噬菌斑形成单位(Pfu′s)，这种合成寡聚物对如Morohashi等人(Proc.Natl.Acad.Scl.USA.81，4647-4651，1984)所描述的牛P450SCC DNA序列具有特异性。得到六个杂交的Pfu′s，再用两轮感染、平板化和杂交法进行进一步的纯化，将P450SCCcDNA EcoRI插入段亚克隆入PTZ18R(Pharmacia)的EcoRI位点。用限制性酶图和序列测定对含有最大EcoRI插入段(1.4Kb)的来自克隆λ-gtll SCC-54的克隆PGBSCC-1(图2)进行进一步分析。
序列数据表明PGBSCC-1EcoRI插入段与P450SCCcDNA图上的251位和1824位之间的SCCcDNA的核苷酸序列(如Morohashi等人描述的)是一致的。
通过将177bp Pst/HindⅢ片段克隆入pTZ18R合适的位点中，合成得到其余的5′-P450SCCcDNA核苷酸，得到如图3所示的PTZ/Synlead，它除了含有编码了Morohashi等人发表的从118位至273位的成熟P450SCC蛋白的核苷酸外，还在不影响P450SCC蛋白质预期的氨基酸序列下含有ScaⅠ，AvrⅡ和StuⅠ的限制性位点。
通过在含有1372bp HindⅢ/KpnⅠPGBSCC-1片段、177bp Pst/HindⅢPTZ/Synlead片段和用PstⅠ和KpnⅠ消化了的PTZ19R DNA的连接混合物的大肠杆菌JM101(ATCC33876)进行分子克隆，构建整长的P450SCCcDNA。
得到的质粒PGBSCC-2含有编码了成熟牛P450侧链裂解蛋白的全部核苷酸序列，它被表示在图4中。
例2在枯草杆菌细菌宿主中P450SCC的构建、转化和表达为了在杆菌宿主中得到细胞色素P450SCC的表达，将P450SCCcDNA序列转移到大肠杆菌/杆菌往返载体PBHA-1中。
图5表示了往返质粒PBHA-1的核苷酸序列，该质粒含有11-105和121-215位细菌噬菌体FO终止子(两个);221-307位质粒PBR322的一部分(即2069-2153位);313-768位细菌噬菌体F1，复制起点(即5482-5943位);772-2571位质粒PBR322部份，即复制起点和β-乳胺酶基因;2572-2685位转位子TN903，完整基因组;2719-2772位色氨酸终止子(2个);2773-3729位转位子Tn9，氯霉素乙酰转移酶基因。在3005(A)、3038(C)、3302(A)和3409(A)位的核苷酸不同于野生型猫的编码序列。导入这些突变是为了消除NcoⅠ、BalⅠ、EcoRⅠ和PvuⅡ位点3730-3804位多克隆位点;3807-7264含有杆菌“HpaⅡ”启动子的质粒PUB110的部分，复制和卡那霉素抗性基因(EcoRⅠ-PvuⅡ片段)(Mckenzie等人，Plasmid15，93-103，1986和Mckenzie等人，Plasmid17，83-85，1987);7261-7331位多克隆位点。用已知的克隆技术将这些片段放在一起，这些技术例如将Klenow片段填入粘性末端、转接物克隆法等，所有数据均来自于GenbankR，National Nucleic Acid Sequence Data Bank，NIH，USA。
在大肠杆菌JM101内，将PGBSCC-2的KpnⅠ/SphⅠP450SCCcDNA插入段(如例1描述)分子克隆到如图6所示的PBHA-1的合适位点中，得到PGBSCC-3。
通过在大肠杆菌JM101中进行分子克隆，用合成的SphⅠ/StuⅠ片段交换PGBSCC-3中的StuⅠ/SphⅠ片段导入甲硫氨酸起始密码。
SPH1STU 1CATATGATCAGTACTAAGACCCCTAGGGTACGTATACTAGTCATGATTCTGGGGATCCNDE1成SphⅠ/StuⅠ片段在ATG起始密码处有NdeⅠ位点。得到的质粒PGBSCC-4被表示在图7中。通过用限制性酶NdeⅠ消化PGBSCC-4，将“HpaⅡ”杆菌启动子导入P450SCCcDNA序列的上游，用琼脂糖凝胶电泳分离往返质粒的大肠杆菌部分，然后重新连接，再转化到枯草杆菌1A40(BGSC1A40)的适当的细胞中。分析新霉素抗性克隆，得到质粒PGBSCC-5(图8)，通过制取在含有10μg/ml新霉素的TSB培养基(Gibco)中37℃下过夜培养物的细胞蛋白质部分来研究牛P450SCC的表达。离心收获约含5×106细胞的100μl细胞培养物，再在10mM Tris/Hcl PH7.5中重新悬浮，加入溶菌酶(1mg/ml)进行溶菌作用，再于37℃培养15分钟。于37℃用0.2mg DNase/ml处理5分钟后，将混合物调至1×SB缓冲液(如Laemmli，Nature227，680-685，1970描述的)，最终体积为200μl。于100℃加热5分钟后，将15μl混合物在7.5%SDS/聚丙烯酰凝胶中进行电泳。通过P450SCC特异抗体对凝胶进行探针免疫印迹分析，可检测如图9(行C)所示的53KDa带。
用从牛肾上腺皮质组织分离纯化的P450SCC蛋白对兔进行免疫接种，得到牛P450SCC特异抗体。
例3P450SCC在细菌宿主地衣形芽孢杆菌中的表达将质粒PGBSCC-5转化到合适宿主菌株地衣芽孢杆菌T5(CBS470.83)中，使得牛P450SCC在地衣形芽孢杆菌中表达。从含有10μg/ml新霉素的Trypton Soy Broth(TSB)培养基(Oxoid)中于37℃培养过夜的培养物中，用例2描述的方法制备细胞蛋白质部份，用SDS/PAGB和Western-blotting印迹分析进行分析。在将硝基纤维滤纸和牛P450SCC特异抗体培养后，可看到图9(行5)中所示的53KDa大小的蛋白质带。对转化株SCC-201的P450SCC的体内活性进行进一步的分析(见例11)。
例4P450SCC在细菌宿主大肠杆菌中的表达(a)表达基因盒的构建为了得到适合于牛P450SCC在宿主大肠杆菌中表达的载体，用位点诱变方法突变PTZ18R，诱变方法如Zoller和Smith的“Methods in Enzymology”100，468-500，1983;Zoller和Smith的“Methods in Enzymology154，329-350，1987和Kramer和Fritz的“Methods in Enzymology”154，350-367，1987所描述的。体外诱变实验的质粒和菌株从Pharmacia Inc.得到。
一个合成得到的具有序列为
的寡聚体用来在PTZ18R中lacZ基因的ATG起始密码处产生NdeⅠ限制性位点。
得到的质粒PTZ18RN用NdeⅠ和KpnⅠ消化，采用如图10所示的分子克隆方法，插入含有整长SCCcDNA的PGBSCC-4的NdeⅠ/KpnⅠDNA片段。
所得到的质粒PGBSCC-17中P450SCCcDNA序列的转录由大肠杆菌lac启动子驱动。
(b)P450SCC在宿主大肠杆菌JM101中的表达通过选择氨苄青霉素抗性菌落，将PGBSCC-17导入大肠杆菌JM101适当的细胞中。于37℃将转化株SCC-301和302在含有50μg/ml氨苄青霉素的2XTY培养基(每升去离子水含有细菌蛋白胨(Difco)，16g;酶母提取物(Difco)，10g和Nacl，5g)中培养过夜，从中制备细胞蛋白质部分(如例2描述)，来研究细胞色素P450SCC的表达。
由SDS/PAGE分析、用考马斯亮兰染色(图11A)或用Western印迹分析和用牛P450SCC特异抗体探针(图11B)来分析蛋白质部分。两种分析分别显示了转化体SCC-301和SCC-302的预期长度的蛋白质(图11A中，行1和行2和图11B中的行3和行4)，而在大肠杆菌JM101对照菌株中是没有的(图11A，行3和图11B中的行2)。
例5P450SCC在酵母Kluyveromyces lactis中的构建、转化和表达(a)PUC19中发生素(geneticin)抗性标记的导入与Bennetzen和Hall(J.Biol.Chem.，257，3018-3025，1982)中描述的相似，将含Tn5基因(Reiss等人，EMBOJ.，3，3317-3322，1984)(在啤酒酵母乙醇脱氢酶I(ADHI)启动子赋于发生素抗性的基因)的DNA片段插入PUC19的SmaⅠ位点(Yanisch-Perron等人，Gene，33，103-119，1985)，得到的质粒PUCG418被表示在图12中。
含PUCG418的大肠杆菌保藏于CentraalBureauVoorSchimmelcultures保藏号为CBS872.87。
(b)表达基因盒的构建构建一个载体，该载体包括用XbaⅠ和HindⅢ切割的PUCG418(如例5(a)描述)、来自PGB901含乳糖酶启动子的XbaⅠ-SalⅠ片段(见J.A.VandenBerg等人，美国专利申请号为572.414的部份继续申请Kluyveromyves作为宿主菌株)和含有K.lactis乳糖酶基因的3′非编码区域部分的合成DNA。这个质粒PGB950表示在图13中。
用SalⅠ和XhoⅠ切割PGB950，插入人工合成的DNASAL1STU 1XHO1TCGACAAAAATGATCAGTACTAAGACTCCTAGGCCTATCGATTCGTTTTTACTAGTCATGATTCTGAGGATCCGGATAGCTAAGAGCT得到的质粒PGBSCC-6如图13所示。
从含P450SCC编码区域的PGBSCC-2(见例1)中分离StuⅠ-EcoRI片段，使用Klenow DNA聚合酶填充粘性末端。这个片段插入用StuⅠ切割的PGBSCC-6中，含有正确取向片段的质粒称为PGBSCC-7(见图14)。
(c)K.lactis的转化作用将K.lactis菌株CBS2360在含2.5ml6.7%(W/W)酵母氮碱基(Difco实验室)溶液的100mlYEPD培养基(1%酵母提取物，2%的胨、2%的葡萄糖-水合物)中培养，培养至OD61-0约为7。从10ml培养物中，离心收集细胞，用TE缓冲液冲洗(10mM Fris-Hcl，PH7.5;0.1mM EDTA)，再重新悬浮在1ml TE-缓冲液中。加入等体积0.2M的乙酸锂，于30℃在振荡水浴中，将混合物保温1小时。在乳糖酶启动子的单拷贝SacⅡ位点切割15ug PGBSCC-7，用乙醇沉淀并重新悬浮于15ul TE-缓冲液中，在该DNA制剂中加入100ul预保温过的细胞，保温延续30分钟，然后加入等体积的70%PEG4000，混合物在相同温度下保温1小时，再于42℃进行5分钟热振荡，再加入1ml YEPD培养基，将这些细胞在30℃的振荡水浴中保温1.5小时。最后离心收集细胞，悬浮于300μl YEPD中，再扩散到含15ml YEPD琼脂和300μg/ml遗传素的琼脂平板上，在使用前1小时用15ml浸有G418的YEPD琼脂覆盖一层，菌落于30℃生长3天。
(d)转化株的分析转化株和对照菌株CBS2360于30℃在YEPD培养基中生长约64小时。离心收集细胞，再悬浮在OD610为300的生理盐水溶液中，在Vortex振荡器中，以最大速度用玻璃珠振荡破碎3分钟。在Hearaeus Christ minifuge GL中，转速为4500rpm离心10分钟，除去细胞碎屑，从上清液中取40μl样本用于免疫印迹分析(见图15A，行3和图15B，行4)。
结果显示了预期长度的蛋白质在用PGBSCC-7转化的K.lactis细胞中被表达。转化株称为K.lactisSCC-101。
例6P450SCC在酵母菌啤酒酵母中的构建，转化和表达。
(a)表达基因盒的构建为了去除乳糖酶启动子，用XbaⅠ和SalⅠ切割PGB950〔见例4(b)〕，采用KlenowDNA聚合酶填充其粘性末端，然后再连接，在所得到的质粒PGBSCC-8中，XbaⅠ位点被破坏，但保留了SalⅠ位点。
对从PGB161(见J.A.VandenBerg等人;EP96430)中分离的、含有啤酒酵母的异细胞色素CI(Cyc)启动子的SalⅠ片段，用XhoⅠ部分地消化，分离670bpXhoⅠ-SalⅠ片段，克隆到PGBSCC-8的SalⅠ位点。在选择的质粒PGBSCC-9中，保持Cyc1启动子和乳糖酶基因的3′端非编码区域之间的SalⅠ位点(图16)(用HindⅢ部份地消化)。
将来自PGBSCC-7，含有P450SCC编码区域的SalⅠ-HindⅢ片段插入用SalⅠ和HindⅢ切割的PGBSCC-9中，在得到的质粒PGBSCC-10中，P450SCC编码区域在cyc1启动子的下游(如图17)。
(b)啤酒酵母的转化于30℃将啤酒酵母菌菌株D273-10B(ATCC25657)在100ml YEPD培养过夜，再用新鲜培养基稀释(1∶10000)并生长至OD610为6，从10ml培养物中离心收集细胞，悬浮在5ml TE-缓冲液中，再用离心方法收集细胞，悬浮于1ml TE-缓冲液中，再加入1ml0.2M乙酸锂。将这些细胞于30℃振荡水浴中保温1小时。在cyc1启动子的单拷贝MluⅠ-位点处切割15μg PGBSCC-10，乙醇沉淀后，再悬浮于15μlTE中。在这个DNA制剂中加入100μl预培养过的酵母细胞，于30℃保温(振荡)30分钟。加入115μl的70%PEG4000溶液后，持续保温60分钟(不振荡)。然后，于42℃对细胞热振荡5分钟，加入1ml YEPD培养基，再于30℃在振荡水浴中保温1 1/2 小时。最后用离心方法收集细胞，重悬浮于300μlYEPD中并扩散到含发生素(300μg/ml)的YEPD的琼脂平板上。
菌落于30℃生长三天。
(c)转化株分析转化株和对照株在YEPL-培养基(1%酵母提取物，2%细菌蛋白胨，3.48%K2HP4和2.2%的90%L-(+)-乳酸溶液，在灭菌前用25%的氨溶液将PH调至6.0)中于30℃生长64小时，再用如例5(d)中描述的方法进行分析。
免疫印迹分析证明了P450SCC在啤酒酵母中的表达(图15A，行1)。
例7前-P450SCC编码DNA在酵母Kluyveromyces lactis中的构建、转化和表达
(a)表达基因盒的构建用SalⅠ和XhoⅠ切割质粒PGB950(见例5(b))，并插入合成的DNA
得到质粒PGBSCC-11(图18)。与例5(b)中描述的类似，将PGBSCC-2的P450SCC编码区域插入用StuⅠ切割的PGBSCC-11中。含正确取向片段的质粒叫作PGBSCC-12(图18)。
(b)K.lactis的转化和转化体的分析用如例5(c)中描述的方法用PGBSCC-12转化K.lactis，用例5(d)描述的方法分析转化株，分析证明通过K.lactis的P450SCC的生产(图15B，行3)。
例8前-P450SCC的编码DNA在啤酒酵母中的构建、转化和表达(a)表达基因盒的构建将来自PGBSCC-12、含有前-P450SCC编码区域的SalⅠ-HindⅢ(HindⅢ被部分地消化)片段插入用SalⅠ和HindⅢ切割的PGBSCC-9中，得到的质粒叫做PGBSCC-13(图19)。
(b)啤酒酵母的转化和转化株的分析如例6(b)描述的方法，用PGBSCC-13转化啤酒酵母菌株D273-10B，转化株分析用如例5(c)描述的方法进行，结果(如图15(c)(行3)表示)，证明了由啤酒酵母表达P450SCC。进一步分析了一个转化株，SCC-105的P450SCC的体外活性(见例12)。
例9融合到啤酒酵母的细胞色素氧化酶Ⅵ的前区域的P450SCC序列在Kluyveromyces lactis中构建、转化及其表达(a)表达基因盒的构建用SalⅠ和XhoⅠ切割质粒PGB950(见例6(b))并插入合成的DNA
得到质粒PGBSCC-14。
来自细胞色素氧化酶Ⅵ(COX Ⅵ)前序列的氨基酸序列出自Wright等人(J.Biol.Chem，259，15401-15407，1984)的文章。采用优选的酵母密码子，设计合成DNA。与例5(b)中描述的相似，将PGBSCC-2的P450SCC编码区域插入用StuⅠ切割的PGBSCC-14中。在COXⅥ前序列框内含有P450SCC编码序列的质粒叫做PGBSCC-15(图20)。
(b)K.lactis的转化和转化株的分析用例5(c)描述的方法，用PGBSCC-15对K.lactis转化。用如例5(d)描述的方法分析转化株，结果(图15B，行2)显示了P450SCC被表达。
例10融合于啤酒酵母的细胞色素氧化酶Ⅵ前区域的P450SCC在啤酒酵母中的构建，转化和表达(a)表达基因盒的构建来自PGBSCC-15，含有融合到COX Ⅵ前序列上的P450SCC的编码区域的SalⅠ-HindⅢ(HindⅢ部分地消化)片段被插入用SalⅠ和HindⅢ切割的PGBSS-9中，得到的质粒叫做PGBSCC-16(图21)。
(b)啤酒酵母的转化和转化株的分析用例6(b)中描述的方法，用PGBSCC-16转化啤酒酵母菌株D273-10B。用例6(C)描述的方法分析转化株。结果(如图15C(行2)所示)显示了P450SCC在啤酒酵母中的表达。
例11地衣形芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)SCC201中P450SCC在活体内的活性按照例3中所描述的方法得到地衣形芽孢杆菌SCC-201。将此生物体接种于100ml培养基A中。培养基A由下列成分组成Cacl2·6H2O 1g硫酸铵5gMgcl2·6H2O 2.25gMgSO4·4H2O 20mg六合水氯化钴1mg一水合柠檬酸1.65g蒸馏水600ml微量元素原料溶液1ml防沫剂(SAG5693)0.5mg微量元素原料溶液在每1毫升蒸馏水中含有CuSO4·5H2O 0.75gH3BO30.60gKI0.30gFeSO4(NH4)2SO4·2H2O 27gZnSO4·7H2O 5g柠檬酸·H2O 15gMnSO4·H2O 0.45gNa2MoO4·H2O 0.60g
H2SO4(96%) 3ml经灭菌并冷却至30℃制成培养基后，将60g溶于200ml蒸馏水(120℃灭菌20分钟)的一水合麦芽糖酶、200ml1M的磷酸钾缓冲液(PH6.8;120℃灭菌20分钟)、以及溶于100ml蒸馏水(膜过滤灭菌)的1.7g酵母氮基(Difco公司)加入培养基中。
此培养物在37℃下生长64小时，然后取2ml培养物接种于含10mg胆固醇的100ml培养基A中，胆固醇以一种溶液的方式加入，该溶液含有10mg胆固醇、0.75mlTergitol(注册商标)/乙醇(体积比1∶1)、以及20μlTween80(注册商标)。培养物在37℃生长48小时，然后用100ml二氯甲烷萃取。离心分离混合物并收集有机溶剂层。萃取过程重复两次并汇集3×100ml的二氯甲烷组分。真空蒸馏二氯甲烷蒸发，并用气相色谱-质谱联合分析法对干提取物(大约为450mg)进行孕甾烯酮分析。
气相色谱-质谱分析从干提取物中取一定的量，并通过加入一种吡啶双-(三甲硅烷)-三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷的混合物使其硅烷化。按照被选择离子的方式对硅烷化样品进行GL-MS-DS联合分析(CarloErbaMEGA5160-FinniganMAT311A-KratosDS90)。气相色谱是在下述条件下进行的在300℃用自动注射器注射;内径为0.25、df0.2μm的M。Cpsil29色谱柱在300℃恒温操作;直接引入质谱源。
在800的分辨率下，通过对孕甾烯醇酮离子苛质比M/Z298的监测，对样品进行分析。测量结果显然表明在宿主菌株为地衣形芽孢杆菌T5的情况下未检查出孕甾烯醇酮(检出的最低限为1微微克)，而在地衣形芽孢杆菌SCC-201的情况下，很容易检测到孕甾烯醇酮产物。
例12从啤酒酵母菌SCC-105得到的P450SCC在活体内的活性将按照例8中描述的方法得到的啤酒酵母菌SCC-105接种于100ml培养基B中。培养基B在每升蒸馏水中含有酵母提取物10gBactoPeptone(Oxoid)20g乳酸(90%)20g磷酸氢二钾35gPH＝5.5(用25%W/W的氨调至)此培养物在30℃生长48小时，然后将其接种于含有培养基的发酵罐内。培养基C由下列成分组成酵母提取物100gBactoPeptone(OXoid)200g乳酸(90%)220g磷酸氢二钾35g蒸馏水7800ml用25%的氨将PH调至6.0并将内含培养基的发酵罐灭菌(1小时，120℃)。
冷却后，将溶于25ml蒸馏水的2.4g发生素(geneticin)经膜过滤灭菌并加入培养基中。在30℃下，在搅拌反应器中(800rpm)使接种混合物生长，同时以300升/小时的速度使无菌空气通过培养液，并且用4N H2SO4及5%NH4OH(5%NH4OH的蒸馏水溶液;经膜过滤灭菌)使PH值自动保持在6.0。48小时后，开始以20克/小时的速度加入乳酸(90%，膜过滤灭菌)。然后再发酵40小时，离心(4000×g，15分钟)收集细胞。
用0.9%(W/W)的Nacl洗涤沉淀，然后离心(4000×g，15分钟);用磷酸盐缓冲液(50mM，PH＝7.0)洗涤沉淀物并离心(4000×g，15分钟)收集细胞。取沉淀物置于磷酸盐缓冲液(50mM，PH＝7.0)中，得到每毫升含湿重0.5g沉淀物的悬浮液。用Dyno(注册商标)-粉碎机(WillyA.Bachofen，Maschinenfabrik，Basel，Schweiz)处理该悬浮液。离心(4000×g，15分钟)除去未破碎的细胞。将没有细胞的提取物(2250ml，15-20mg蛋白质/毫升)于-20℃贮存。
通过下述方法对P450SCC粗提纯。经超速离心(125000×g，30分钟)将粗的膜成分从50ml解冻的无细胞提取物中沉淀，并再次悬浮于50ml含1%胆酸钠的75mM磷酸钾溶液(PH7.0)中。将此分散体在0℃轻轻搅拌1小时，然后离心(125000×g，60分钟)。向所得的含可溶性膜蛋白的上清液中加入(NH4)2SO4(30%W/V)，同时通过加入少量NH4OH溶液(6N)使PH保持在7.0。此悬浮液在0℃搅拌20分钟，然后离心(15000×g，10分钟)收集沉淀蛋白质部分。将沉淀物再次悬浮于2.5ml含有0.1mM二硫-threitol和0.1mM EDTA的100mM的磷酸钾缓冲液中(PH7.0)。此悬浮液经凝胶过滤柱(PD10，Pharmacia)洗脱，得到3.5ml脱盐蛋白质成分(6mg/ml)，此成分用于P450SCC活性分析。
大体上根据Doering的方法(Methods Enzymology，15，591-596，1969)对P450SCC的活性进行测定。分析混合物由下列溶液构成溶液A(天然P450SCC电子供给系统)10mM磷酸钾缓冲液(PH7.0)，其中含有3mM EDTA、3mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、20μM肾上腺皮质铁氧还蛋白及1μM肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(电子受体;均由牛肾上腺皮质提纯)、1mMNADPH(电子供体)和15mM葡萄糖-6-磷酸盐以及8单位/毫升葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶(NADPH再生系统)。
溶液B(底物)于10%(V/V)Tergitol(注册商标)NP40/乙醇(1∶1，V/V)中的37.5μM胆固醇胶束溶液(用〔26，27-14C〕胆固醇(40Ci/mol)与〔7-α-3H〕胆固醇(400Ci/mol)双放射标记)。
首先将75μl溶液A与50μl溶液B及125μl粗提纯的P450SCC组分(或是缓冲液，作为参照)混合。混合物在30℃轻轻搅拌。在0、30和180分钟时取出50μl样品并用100μl水稀释。向稀释的样品中加入100μl甲醇和150μl氯仿。经萃取与离心(5000×g，2分钟)后，收集氯仿层并干燥。将干燥的残余物溶于50μl含有0.5mg类固醇混合物(胆固醇、孕甾烯醇酮与孕酮1∶1∶1，W/W/W)的丙酮中，然后加入110μl浓甲酸。悬浮液在120℃加热15分钟。然后通过双标记液体闪烁计数测定14C/3H的比值，这种比值是侧链断裂反应的一个直接的量度，因为14C-标记的侧链在加热过程中以异辛酸的形式从混合物中蒸发了。
通过这种分析发现从啤酒酵母菌中得到的粗提纯的P450SCC成分具有侧链断裂活性。在保温3小时的过程中，45%的胆固醇被转化了。通过薄层色谱法鉴定出反应产物是孕甾烯醇酮。
例13编码了牛细胞色素P450类固醇17α-羟化酶(P45017α)的整长cDNA的分子克隆。
通过用对P45017αcDNA特异的二种32P-末端标记的合成寡聚物进行筛选，对例1中所描述的约106Pfu′s的牛肾上腺皮质cDNA库选择P45017αcDNA序列。寡聚物17α-1(5′-AGT GGC CAC TTT GGG ACG CCC AGA GAA TTC-3′)与寡聚物17α-2(5′-GAG GCT CCT GGG GTA CTT GGC ACC AGA GTG CTT GGT-3′)分别与Zuber等人(J.Biol.Chem.261，2475-2482，1986)描述的牛P45017αcDNA序列中位349-320及位139-104互补。
用寡聚物17α-1进行选择显示出±1500杂交Pfu′s。对几种杂交Pfu′s进行选择、提纯和扩大，用于初步的噬菌体DNA的分离。重组体λ-gtllDNA′s的EcoRI插入段亚克隆于PTZ18R的EcoRI位点。一种克隆，PGB17α-1进一步由限制性核酸内切酶图和DNA定序表征其特性。质粒PGB17α-1含有一个1.4Kb的EcoRI插入段，该插入段与Zuber等人描述的P45017α3′部分从320号位置的EcoRI位点至1721号位置的多腺苷酸作用位点互补。
PGB17α-1的图谱被表示在图22A上。
通过用寡聚物17α-2选择cDNA库得到8个杂交Pfu′s。在重组噬菌体提纯、扩大和分离rec λ-gtll DNA′s后，EcoRI插入段亚克隆于PTZ18R的EcoRI位点。EcoRI插入段长度变化可以从270bp至1.5Kbp。只有一种克隆，含有一个345bp EcoRI片段的PGB17α-2通过核苷酸定序被进一步研究，并与Zuber等人公布的P45017αcDNA序列进行比较。如图22B所示，PGB17α-2中P45017αcDNA序列起始于所预料的47号位的AUG起始密码上游的72bp，并表明和Zuber等人所描述的一样，与P45017αcDNA的5′部分直至320位的EcoRI位点完全符合。
通过在一个连接混合物的大肠杆菌(E.coli)JM101中进行分子克隆构建一条整长的牛P45017αcDNA，该连接混合物中含有PGB17α-1的部分EcoRI消化液及345bp PGB17α-2的EcoRI片段。所得到的克隆PGB17α-3含有一条整长的牛P45017αcDNA，并被表示在图22C中。
例14克隆于酵母菌Kluyveromyces lactis中的整长P45017αcDNA的构建与转化(a)表达载体的构建为得到一适合于牛P45017α在酵母菌宿主中表达的载体，根据Zoller与Smith(MethodsinEnzymol.，100，468-500，1983)、Zoller与Smith(MethodsinEnzymol.，154，329-350，1987)以及Kramer与Fritz(MethodsinEnzymol.，154，350-360，1987)所描述的通过位变诱变使PGB17α-3发生突变。活体外诱变实验用的质粒与菌株从PharmaciaInc.买到。
如图23所示，使用合成的寡聚物17α-3SAL 15′-TCTTTGTCCTGACTGCTGCCAGTCGACAAAAATGTGGCTGCTC-3改变ATG起始密码子上游的9bp，从而得到一个SalⅠ限制位点和最佳酵母菌转译信号。
所得到的质粒PGB17α-4用SalⅠ和SmaⅠ消化，通过凝胶电泳分离出含有整长P45017αcDNA的DNA片段，经过在大肠杆菌(E.Coli)JM101中进行分子克隆使其分离并转移至预先被XhoⅠ消化的PGB950载体中(参见例5)，用Klenow DNA聚合酶填充粘性末端，然后用SalⅠ消化，从而得到图24所示的质粒PGB17α-5。
(b)K.lactis的转化如例5中所表示的，在乳糖酶启动子中单拷贝的SalⅡ位点处被切割的15μg PGB17α-5被用于转化K.lactis菌株CBS2360。通过Southern分析对转化株宿主基因组中是否存在整合PGB17α-5序列进行分析。对在基因组宿主DNA中含有至少三个复制的PGB17α-5的一种转化株17α-101进一步进行P45017α的活体内活性分析(参见例16)。
例15枯草杆菌与地衣形芽孢杆菌细菌宿主中P45017α的构建与转化(a)表达载体的构建为得到适合于牛P45017α在芽孢杆菌属宿主中表达的载体，按照例14中所描述的方法通过位点诱变使PGB17α-3发生突变。
如图25所示，用合成寡聚物17α-4
将一个NdeⅠ限制位点引入ATG起始密码子。
用EcoRI将得到的质粒PGB17α-6部分消化，通过凝胶电泳将含有整长P45017αcDNA的DNA片段分离，按图26所示的方法分离并连接于EcoRI消化的PBHA-1DNA。通过将该连接混合物转移至大肠杆菌JM101中使连接物分子克隆，从而得到PGB17α-7。
(b)枯草杆菌与地衣形芽孢杆菌的转化通过用限制酶NdeⅠ消化PGB17α-6，用琼脂糖凝胶电泳分离往返质粒中的大肠杆菌部分，然后重新连接并使枯草杆菌1A40(BGSC 1A40)足够的细胞转化，从而使“HpaⅡ”芽孢杆菌属启动子引入到P45017αcDNA序列的上游。对新霉素抗性菌落进行分析结果得到质粒PGB17α-8(图27)。
又用PGB17α-8进行宿主地衣形芽孢杆菌T5(CBS470.83)的转化。PGB17α-8的限制性分析表明，即使在很多代后，在适当的芽孢杆菌属中，该质粒仍保持稳定。
例16在Kluyveromyces lactis 17α-101中P45017α在活体内的活性按照例14中描述的方法得到K.lactis17α-101。将此生物体接种于100ml培养基D中。培养基D在每升蒸馏水中含有酵母提取物(Difco)10gBactopeptone(Oxoid)20g右旋糖20g经灭菌并冷却至30℃后，将溶于40ml蒸馏水(膜过滤灭菌)的2.68g酵母氮基(Difco)与溶于1ml蒸馏水(膜过滤灭菌)的50mg新霉素加入培养基中。然后将溶于1.5ml二甲基甲酰胺中的50mg孕酮加入100ml培养基中。此培养物在30℃生长120小时，然后用50ml二氯甲烷对50ml培养液进行萃取。将混合物离心并分离出有机溶剂层。通过真空蒸馏将二氯甲烷蒸发，将干燥的提取物(约200mg)放入0.5ml氯仿中。如同薄层色谱所表示的，该提取物含有17α-羟基孕酮。通过H-NMR与13C-NMR进一步证实了该化合物的结构。NMR分析还表明，提取物中17α-羟基孕酮/孕酮的比率约0.3。
例17编码了牛细胞色素P450类固醇21-羟化酶(P450C21)的整长cDNA的分子克隆将按照例1中描述的方法制备的牛肾上腺皮质cDNA库的约106Pfu′s与32P末端标记的寡聚C21-1杂交。如Yoshioka等人所描述的那样(J.Biol.Chem.，261，4106-4109，1986)，含有5′-GAT GAT GCT GCA GGT AAG CAG AGA GAA TTC-3′序列的这种寡聚物是位于P450C21cDNA序列中EcoRI位点下游的牛P450C21基因的一种特异探针。经过筛选得到一种杂交Pfu。这种重组体λ-gtll DNA的EcoRI插入段亚克隆于PTZ18R的EcoRI位点，从而得到一种命名为PGBC21-1的结构。如图28所示，根据核苷酸定序表明，该质粒含有一个1.53Kb的EcoRI插入段，如Yoshioka等人所描述的，该插入段与P450C21cDNA序列从489位的EcoRI位点至多腺苷酸作用点互补。
为了分离P450C21cDNA中残余的5′部分(490bp)按照例1中所描述的过程，仅用一种修饰制备一种新的牛肾上腺皮质cDNA库。作为第一条DNA链合成的引物，加入另一种寡聚物C21-2。具有5′-AAG CAG AGA GAA TTC-3′核苷酸序列的寡聚物C21-2被定位于P450C21cDNA从504至490位的EcoRI位点的下游。
用含有P450C21特异序列5′-CTT CCA CCG GCC CGA TAG CAG GTG AGC GCC ACT GAG-3′(72-37号位)的32P末端标记的寡聚物C21-3对这种cDNA库的筛选表明了约100个杂交Pfu′s。仅有一种重组λ-gtll DNA的EcoRI插入段亚克隆于PTZ18R的EcoRI位点，从而得到一种称为PGB21-2的结构。该质粒(图28)含有一个540bp的插入段，如核苷酸定序所表明的那样，该插入段与P450C21cDNA序列从-50位到489位的EcoRI位点互补。
例18P450C21cDNA芽孢杆菌属表达载体的构建与枯草杆菌和地衣形芽孢杆菌细菌宿主的转化(a)表达载体的构建为了构建一条整长的具有对芽孢杆菌属表达载体PBHA-1特异的侧链序列的P450C21cDNA，首先通过聚合酶的链反应(PCR)方法用PGBC21-2作为模板以及两种特异的P450C21-寡聚物作为引物对P450C21基因的5′部分进行修饰。寡聚物C21-4(5′-CTG ACT GAT ATC CAT ATG GTC CTC GCA GGG CTG CTG-3′)含有与C-21序列从1-21位互补的21个核苷酸以及产生EcoRV限制位点及ATG起始密码子的NdeⅠ限制位点的18个碱基。
寡聚物C21-5(5′-AGCTCAGAATTCCTTCTGGATGGTCAC-3′)是21个与49g位的EcoRI位点上游的负链互补的碱基。
根据Saiki等人的描述(Science 239，487-491，1988)，用较少的修饰进行聚合酶的链反应(PCR)。PCR反应是在100μl体积中进行的，这100μl体积中含有50mM Kcl，10mM Tris-Hcl PH8.3，1.5mM MgCl2，0.01%(W/V)白明胶，200μM每一种dNTP，1μM的每个C21底物和10ng PGBC21-2模板。在变性(100℃，7分钟)及加入2U Taq-聚合酶(Cetus)后，在一个DNA放大设备中(Perkin-Elmer)使反应混合物进行25次放大循环(每次为55℃，2分钟;72℃，3分钟;94℃，1分钟)。在最后一次循环中，去掉变性步骤。P450C21cDNA放大的图解被表示在图29中。
放大的片段用EcoRV与RcoRI消化，并通过分子克隆插入PSP73(Promega)适当的位点。所得到的质粒命名为PGBC21-3。如图30所示，将PGBC21-1的3′P450C21-EcoRI片段在右侧插入PGBC21-3的EcoRI位点。所得到的载体PGBC21-4用EcoRV和KpnⅠ消化(KpnⅠ位于PSP73的多克隆位点)，通过凝胶电泳法分离含有整长P450C21cDNA的片段，并通过分子克隆将该片段插入PBHA-1的适当位点。所得到的质粒PGBC21-5被表示在图31中。
(b)芽孢杆菌属的转化通过用限制性酶NdeⅠ消化PGBC21-5，用琼脂糖凝胶电泳分离往返质粒的大肠杆菌部分，然后重新连接并转化枯草杆菌1A40(BGSC 1A40)足够的细胞，将“HpaⅡ”芽孢杆菌属启动子引入P450C21cDNA基因的上游。对新霉素抗性菌落进行分析，从而得到PGBC21-6(图32)。
又用PGBC21-6进行宿主地衣形芽孢杆菌T5(CBS470.83)的转化。限制性分析表明，在两种芽孢杆菌属宿主中该质粒保持稳定。
例19P450C21cDNA酵母菌表达载体的构建以及酵母菌宿主Kluyveromyces lactis的转化(a)表达载体的构建为了得到适合于牛P450C21在酵母菌宿主中表达的载体，根据例14所描述的方法，通过位点诱变使PGBC21-2发生突变。对于这种突变体，如图33所示，利用寡聚物C21-6(5′-CCTCTGCCTGGGTCGACAAAAATGGTCCTCGCAGGG-3′)产生一个SalⅠ限制性位点和在ATG起始密码子上游的最佳酵母菌转译信号。
如图34所示，将得到的质粒PGBC21-7的SalⅠ/EcoRIDNA片段与PGBC21-1的3′P450C21-EcoRI片段连接，并通过分子克隆将其插入PSP73的适当位点。用SalⅠ和EcoRV切割所得到的PGBC21-8(EcoRV位点位于PSP73的多克隆位点)，并将含有整长P450C21cDNA的DNA片段插入酵母菌表达载体PGB950。所得到的PGBC21-9被表示在图35中。
(b)K.lactis的转化按照例5(C)中所描述的方法，用SacⅡ将15μgPGBC21-9消化，并使K.lactisCBS2360转化。
例20编码了牛细胞色素P450类固醇11β-羟化酶(P45011β)的整长cDNA的分子克隆如例1中所述的方法，通过一次修饰制备牛肾上腺皮质cDNA库。将另一个具有5′-GGC AGT GTG CTG ACA CGA-3′序列的P45011β-特异引物(寡聚物11β-1)加到第一链cDNA合成的反应混合物中。寡聚物11β-1定位于与转译终止子1530至1513位的下游。根据Morohashi等人描述(J.Biochem.102，(3)，559-568，1987)的P45011βcDNA序列资料，得到核苷酸序列及所述P45011β-寡聚物的图谱位置。cDNA库用32P标记的寡聚物11β-2(5′-CCG CAC CCT GGC CTT TGC CCA CAG TGC CAT-3′)进行修饰，并位于P45011βcDNA5′端的36至1位。
寡聚物11β-2的筛选揭示了6个杂交Pfu′s。它们被进一步纯化并用寡聚物11β-3(5′-CAG CTC AAA GAG AGT CAT CAG CAA GGG GAA GGC TGT-3′，990至955号位)对它们进行分析。六个之中有两个显示出具有32P标记寡聚物11β-3的阳性杂交信号。
将两个11β-λ-gtll重组体的EcoRI插入段亚克隆于PTZ18R的EcoRI位点。用限制性酶图对具有一个2.2Kb的EcoRI插入段的一种克隆(PGB11β-1)进一步进行分析，并被表示在图36中。根据Morobashi等人的测定，PGB11β-1含有全部编码了P45011βcDNA的序列。
例21P450C21cDNA芽孢杆菌属表达载体的构建以及枯草杆菌和地衣形芽孢杆菌细菌宿主的转化(a)表达载体的构建对于芽孢杆菌属表达载体PBHA-1修饰了侧链序列的整长P45011βcDNA通过PCR方法(在例18中描述过)，以PGB11β-1作为模板和两种特异的P45011β-寡聚物作为引物获得。
寡聚物11β-4(5′-TTT GAT ATC GAA TTC CAT ATG GGC ACA AGA GGT GCT GCA GCC-3′)含有21个与成熟的P45011βcDNA序列从72至93号位互补的碱基以及21个产生EcoRV、EcoRI和NdeⅠ限制性位点和ATG起始密码子的碱基。
寡聚物11β-5(5′-TAA CGA TAT CCT CGA GGG TAC CTA CTG GAT GGC CCG GAA GGT-3′)含有21个与在1511号位的转译中止子上游的P45011βcDNA页链互补的碱基，以及21个产生EcoRV、XhoⅠ和KpnⅠ限制性位点的碱基。
利用上述模板与P45011β引物进行PCR放大后，将放大的片段(1.45Kb)用EcoRI和KpnⅠ消化，并通过分子克隆将其插入用EcoRI和KpnⅠ切割的芽孢杆菌属表达载体PBHA-1中，从而得到载体PGB11β-2(参见图36)。
(b)芽孢杆菌属的转化通过用NdeⅠ消化PGB11β-2，经琼脂糖凝胶电泳分离往返质粒的大肠杆菌部分，然后重新连接(如例18中所述)并转化枯草杆菌1A40(BGSC1A40)足够的细胞，将“HpaⅡ”芽孢杆菌属启动子引入P45011βcDNA序列的上游。对新霉素抗性菌落进行分析并得到质粒PGB11β-3，所得到的质粒PGB11β-3也被传递给地衣形芽孢杆菌宿主株T5(CBS470.83)。
例22P45011βcDNA酵母菌表达载体的构建以及酵母菌宿主Kluyveromyces lactis的转化(a)表达基因的构建对于酵母菌表达载体PGB950，修饰了侧链序列的整长P45011βcDNA可通过PCR方法(例18中所述)用PGB11β-1作为模板和两种特异P45011β寡聚物作为引物获得。
寡聚物11β-6(5′-CTTCAGTCGACAAAAATGGGC ACA AGA GGT GCT GCA GCC-3′)含有21个与成熟的P45011βcDNA序列从72至93号位互补的碱基，以及产生一个SalⅠ限制性位点、一个最佳酵母菌转译信号和一个ATG起始密码子的另外18个碱基。
寡聚物11β-5在例21(a)中进行了描述。在用提到过的模板与P45011β引物进行PCR放大后，将放大的片段(1.45Kb)用SalⅠ和XhoⅠ消化，并通过分子克隆将其插入用SalⅠ切割的酵母菌表达载体PGB950中，从而得到载体PGB11β-4(图37)。
(b)K.lactis的转化在乳糖酶启动子中单拷贝的SacⅡ位点处切割15μgPGB11β-4，并如例5(C)所述方法进行K.lactisCBS2360的转化。
例23编码了牛肾上腺皮质铁氧还蛋白(ADX)的整长cDNA的分子克隆与构建，以及随后在酵母菌K.lactis中ADXcDNA的转化与表达(a)ADX的分子克隆对于酵母菌表达载体PGB950，修饰了5′和3′侧链序列的整长ADXcDNA可通过用PCR方法放大(参见例18)直接由牛肾上腺皮质mRNA/cDNA库获得(详见例1)。
为放大ADXcDNA，合成了两个合成的寡聚物引物。
根据Okamura等人所述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，5705-5709，1985)，寡聚物ADX-1(5′CTTCAGTCGACAAAAATGAGCAGCTCAGAAGATAAAATA-3′)含有21个与成熟的ADXcDNA序列的5′端从173至194号位互补的碱基。该寡聚物ADX-1在5′端含有另外18个生成一个SalⅠ限制性位点、一个最佳酵母菌转译信号和一个ATG起始密码子的核苷酸。
寡聚物ADX-2(5′-TGTAAGGTACCCGGGATCCTTATTCTATCTTTGAGGAGTT-3′)与ADXcDNA页链的3′端从561至540号位互补，另外它含有一些生成BamHI、SmaⅠ和KpnⅠ限制性位点的核苷酸。
如例18所述，以1μM的每种ADX引物及10μlmRNA/cDNA混合物(如例1所述)作为模板进行聚合酶的链反应(PCR)。
ADXcDNA放大的图解被表示在图38上。
放大的片段含有整长的修饰了侧链的ADXcDNA序列，它的特性由限制性位点分析以及核苷酸定序来描述。
(b)表达载体的构建将放大的ADXcDNA片段用SalⅠ和SmaⅠ消化，并通过分子克隆将其插入用SalⅠ和EcoRV切割的酵母菌表达载体PGB950。所得到的质粒PGBADX-1被表示在图38中。
(c)K.lactis的转化在乳糖酶启动子中的单拷贝SacⅡ位点处切割15μgPGBADX-1，并按例5(C)所述的方法进行K.lactisCBS2360的转化。
(d)转化株的分析选择两种转化株ADX-101-5，ADX102以及对照株CBS2360进行进一步的分析。这些菌株于30℃在YEPD培养基中生长约64小时。如例5(d)所述分离出总的细胞蛋白质。从上清液中取8μl样品进行免疫印迹分析(参见图39，行3、4和5)。
结果表明，所预期长度(14KDa)的蛋白质在用PGBADX-1转化的K.lactis细胞中得到表达。
转化株ADX-102在活体外的活性在例24中被描述。
例24从K.lactisADX-102中得到的肾上腺皮质铁氧还蛋白在活体外的活性按照例23所述得到的K.lactis ADX-102以及对照株K.lactis CBS2360于30℃在100ml YEPD培养基(1%酵母提取物，2%胨，2%葡萄糖-水合物)中生长56小时，该培养基中含有2.5ml6.7%(W/V)酵母菌氮基(Difco实验室)溶液以及100mg1-1发生素(G418 Sulphate;Gibco Ltd)。离心(4000×g，15分钟)收集细胞，重新悬浮于生理盐水中并用磷酸盐缓冲液(PH7.0，50mM)冲洗。经离心(4000×g，15分钟)后沉淀物再次悬浮于磷酸盐缓冲液(PH7.0，50mM)中，从而得到一个每毫升含有湿重0.5g细胞的悬浮液。用Braun MSK匀浆器(6×15秒，0.45-0.50mM的玻璃珠)将细胞打碎。离心(4000×g，15分钟)除去未破碎的细胞。将无细胞的提取物(每毫升40mg蛋白质)在-20℃贮存。
通过P450SCC活性分析对无细胞提取物中ADX活性、即从肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶向细胞色素P450SCC传递电子的能力进行测定，所分析的混合物由下列溶液组成溶液A(除ADX外的天然P450SCC电子供给系统)50mM磷酸钾缓冲液(PH7.0)，其中含有3mM EDTA、2μM肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(由牛肾上腺皮质提纯)、1mM NADPH(电子供体)、15mM葡萄糖-6-磷酸盐以及16单位/ml葡萄糖-6-磷酸盐-脱氢酶(NADPH再生系统)。
溶液B(底物与酶)75μM胆固醇的胶囊溶液(用〔26，27-14C〕胆固醇(40Ci/mol)与〔7α-3H〕胆固醇(400Ci/mol)双放射标记)以及在10%(V/V)Tergitol(注册商标)NP40/乙醇(1∶1V/V)中的1.5μM P450SCC(由牛肾上腺皮质提纯)。
分析首先将75μl溶液A与50μl溶液B和125μl无细胞提取物或125μl磷酸钾缓冲液(50mM，PH7.0)混合，该缓冲液中含有10μM ADX(由牛肾上腺皮质提纯)。混合物在30℃轻轻搅拌。在保温15分钟后取出样品并用100μl水稀释。用100μl甲醇及150μl氯仿从样品中萃取出底物与产物。离心后(5000×g，2分钟)收集氯仿层并使其干燥。将干燥的残余物溶于50μl含有0.5mg类固醇混合物(胆固醇、孕甾烯醇酮与孕酮(1∶1∶1W/W/W))的丙酮中，然后加入110μl浓甲酸。悬浮液在120℃加热15分钟。然后通过双标记液体闪烁计数测定14C/3H的比值。这个比值是侧链断裂反应的一个直接量度，因为在加热过程中，14C标记的侧链以异辛酸的形式从混合物中蒸发掉了。
在K.lactisADX102的无细胞提取物中，利用这种分析能够很容易地证明ADX的电子受体活性。在用K.lactisADX-102的无细胞提取物或用提纯的ADX进行的分析中，在15分钟之内，50%的胆固醇侧链发生断裂，而在用对照株K.lactisCBS2360的无细胞提取物进行的分析中未检测到侧链断裂。
例25编码了牛肾上腺皮质铁氧还蛋白氧化-还原酶(ADR)的整长cDNA的分子克隆与构建，以及随后在酵母菌K.lactis中ADRcDNA的转化(a)肾上腺皮质铁氧还蛋白氧化-还原酶的分子克隆如例1所述，通过一次修饰制备牛肾上腺皮质cDNA库。将另一种具有5′-GGCTGGGATCTAGGC-3′核苷酸序列的ADR特异引物(寡聚物ADR-1)加入到合成cDNA第一链的反应混合物中。寡聚物ADR-1位于1494至1480位的转译中止子的下游。所述ADR寡聚物的核苷酸序列及位置图都是由Nonaka等人(Biochem.Biophys.Res.Comm.145(3)，1239-1247，1987)所述的ADRcDNA序列资料得到的。
所得到的cDNA库用32P标记的寡聚物ADR-2(5′-CAC CAC ACA GAT CTG GGG GGT CTG CTC CTG TGG GGA-3′)进行筛选。
对4个杂交Pfu′s进行鉴定并提纯。但是只有1个Pfu还显示出寡聚物ADR-3(5′-TTGCATCAGCCGCTTCCTCGGGCGAGCGGCCTCCCT-3′)的阳性信号，该寡聚物位于ADRcDNA的中间(840至805号位置)。该ADRcDNA插入段(约2Kb)被分子克隆于PTZ18R的EcoRI位点。
限制性酶图及核苷酸定序表明所得到的质粒PGBADR-1含有整长的ADRcDNA。PGBADR-1的物理图表示在图40中。
(b)表达基因盒的构建对于酵母菌表达载体PGB950，通过PCR方法(参见例18)，以PGBADR-1作为模板和两种特异的ADR寡聚物作为引物，得到对侧链序列进行了修饰的整长ADRcDNA。
寡聚物ADR-4(5′-CGAGTGTCGACAAAAATGTCCACACAGGAGCAGACC-3′)含有18个从96至114号位与成熟的ADRcDNA序列互补的碱基，以及18个引入一个SalⅠ限制性位点、一个最佳酵母菌转译信号和一个ATG起始密码子的碱基。
寡聚物ADR-5(5′-CGTGCTCGAGGTACCTCAGTGCCCCAGCAGCCGCAG-3′)含有18个与在1479位转译中止子上游的ADRcDNA的负链互补的碱基，以及15个用于在各种表达载体中进行分子克隆的KpnⅠ和XhoⅠ限制性位点。
在用上述模板与ADR引物进行放大后，放大的片段(1.4Kb)用SalⅠ和XhoⅠ消化，并通过分子克隆将其插入用SalⅠ和XhoⅠ切割的酵母菌表达载体中。
所得到的质粒PGBADR-2被表示在图40上。
(c)K.lactis的转化在乳糖酶启动子中单拷贝的SacⅡ位点处切割15μgPGBADR-2，并如例5(C)所述方法进行K.lactisCBS2360的转化。
例26编码了牛NADPH细胞色素P450还原酶(RED)的整长cDNA的分子克隆用32P标记的合成寡聚物5′-TGC CAG TTC GTA GAG CAC ATT GGT GCG TGG CGG GTT AGT GAT GTC CAG GT-3′对例1中所描述的牛肾上腺皮质cDNA库进行筛选，如Katagari等人(J.Biochem.，100，945-954，1986)与Murakami等人(DNA，5，1-10，1986)所述，该寡聚物对大鼠、猪和兔RED的保守氨基酸区是特异的。
获得5个杂交的Pfu′s，并进一步用限制性酶图及核苷酸定序来描述它们的特性。将整长的REDcDNA插入表达载体并按照例2、3和6所述方法将其转化为相应的宿主。
例27编码了蛋白质P450SCC与酵母菌K.lactis中的ADX的表达基因盒的构建、转化与表达(a)表达基因盒的构建将表达基因盒PGBADX-1(参见例23)用SacⅡ和HindⅢ(部分地)消化，利用KlenowDNA聚合酶填充粘性末端。分离由部分乳糖酶启动子(但仍保持其功能)、编码ADX序列和乳糖酶终止子组成的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，然后将其插入PGBSCC-7，PGBSCC-7首先经XbaⅠ消化使其线性化(参见例5(6))，并用KlenowDNA聚合酶填充粘性末端。按照这样一种方式进行构建，产生一个单拷贝的限制性位点(SacⅡ)，这个位点是将质粒转移至K.lactis中所必需的。这个单拷贝SacⅡ限制性位点位于乳糖酶启动子序列的SCC侧链序列中，因为乳糖酶启动子ADX侧链序列中的SacⅡ限制性位点被这种填充反应破坏了。所得到的表达基因盒PGBSCC/ADX-1含有分别被乳糖酶启动子控制的SCC和ADX的编码序列。
(b)K.lactis的转化如例5(C)中所述方法，用在单拷贝SacⅡ限制性位点被线性化的PGBSCC/ADX-1进行K.lactisCBS2360的转化，选择一种转化株(SCC/ADX-101)以进行SCC及ADX表达的研究。
(c)转化株K.lactisSCC/ADX-101的分析如例5(d)中所述方法，从SCC/ADX-101及对照株CBS2360培养物制备细胞蛋白质成分，并对它们进行SDS/PAGE及Western印迹分析。印迹分别是用SCC和ADX的特异抗体作为探针得到的。与对照株相比较，转化株SCC/ADX-101的细胞蛋白质组分显示出另外两段所期望的长度(分别为53和14KDa)，反映出蛋白质SCC与ADX的表达。转化株SCC/ADX-101中两种蛋白质的表达水平可与只表达一种蛋白质的转化株中观察到的水平相比拟(对于SCC，参见图15A，行3;对于ADX，参见图39，行5)。转化株SCC/ADX-101活体外的SCC活性及ADX活性在例28中已描述。
例28P450SCC以及从K.lactis SCC/ADX-101得到的肾上腺皮质铁氧还蛋白的活体外活性在30℃，按照例27所述方法得到的K.lactisSCC/ADX-101以及按照例5(d)中所述方法得到的对照株K.lactis SCC-101在1升YEPD培养基(1%酵母提取物，2%胨，2%葡萄糖一水合物)中生长72小时，该培养基中含有100mg1-1发生素(G418 Sulphate;Gibco Ltd)。离心(4000×g，15分钟)收集细胞，将其再悬浮于生理盐水中并用磷酸盐缓冲液(PH7.5，75mM)洗涤，在离心(4000×g，15分钟)后，将沉淀物悬浮在磷酸盐缓冲液(PH7.5，75mM)中，从而得到一个每毫升含湿重0.5g细胞的悬浮液。用Braun MSK匀浆器(6×15秒，0.45-0.50mM玻璃珠)将细胞打碎。离心(4000×g，15分钟)除去未破碎的细胞。
在有NADPH和ADR存在下，通过对胆固醇侧链断裂反应的测定，对无细胞提取物中蛋白质复合物P450SCC/ADX进行分析。所分析的混合物由下述溶液组成溶液A(除ADX外的天然P450SCC电子供给系统)50mM磷酸钾缓冲液(PH7.0)，其中含有3mM EDTA、2μM肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(由牛肾上腺皮质提纯)、1mM NADPH(电子供体)、15mM葡萄糖-6-磷酸盐及16单位/毫升葡萄糖-6-磷酸盐-脱氢酶(NADPH再生系统)。
溶液B(底物)于10%(V/V)Tergitol(注册商标)NP40/乙醇(1∶1，V/V)中的37.5μM胆固醇胶囊溶液(用〔26，27-14C〕胆固醇(40Ci/mol)和〔7α-3H〕胆固醇(400Ci/mol)双放射标记)。
分析首先将75μl溶液A与50μl溶液B及125μl无细胞提取物混合。在30℃轻轻搅拌混合物。在保温60分钟后取出样品，并用100μl水稀释。用100μl甲醇和150μl氯仿从样品中萃取底物和产物。离心后(5000×g，2分钟)收集氯仿层并使之干燥。将干燥的残余物溶于50μl丙酮，其中含有0.5mg类固醇混合物(胆固醇、孕甾烯醇酮和孕酮(1∶1∶1，W/W/W)，然后加入110μl浓甲酸。
在120℃将悬浮液加热15分钟。然后通过双标记液体闪烁计数测定14C/3H的比值，该比值是侧链断裂反应的一个直接量度，因为在加热过程中14C标记的侧链以异辛酸的形式从混合物中蒸发掉了。
利用这种分析证明了K.lactisSCC/ADX-101在无细胞提取物中胆固醇侧链的断裂活性，而在K.lactisSCC-101的无细胞提取物中没有能检测到活性。通过HPLC分析的方法，对由K.lactisSCC/ADX-101无细胞提取物产生的反应产物鉴定是孕甾烯醇酮。
权利要求
1.一种在重组宿主中操作的表达基因盒，包括一个编码了一种蛋白的异源DNA编码序列，该蛋白能单独地或与一个或多个另外的蛋白共同合作、在胆甾醇转化为氢化可的松的生物学途径中具有催化氧化作用步骤的功能，这个步骤选自于由以下组成的组胆甾醇转化成孕甾烯醇酮；孕甾烯醇酮转化成孕酮；孕酮转化成17α-羟基孕酮；17α-羟基孕酮转化成11－脱氧皮甾醇；和11-脱氧皮甾醇转化成氢化可的松。以及在所述宿主中起作用的相应的控制序列。
2.根据权利要求1的一种表达基因盒，其特征在于其中的异源DNA编码序列编码了至少两种蛋白质，这两种蛋白质单独地或与一种或多种蛋白质合作、具有催化权利要求1组中的至少两个氧化步骤的功能。
3.根据权利要求1的表达基因盒，其特征在于它至少含有一个另外的异源DNA，该DNA具有它自己的起作用的控制序列，编码了一种蛋白质，能单独地或与一个或多个另外蛋白质共同合作、具有催化权利要求1组中的一个氧化步骤的功能。
4.根据权利要求1-3的任一权利要求的表达基因盒，其特征在于所述蛋白质选自由以下组成的组侧链裂解酶(P450SCC);肾上腺皮质铁氧还蛋白(ADX);肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶(ADR);3β-羟基类固醇脱氢酶/异构酶(3β-HSD);类固醇-17α-羟化酶(P45017α);NADPH细胞色素P450还原酶(RED);类固醇-21-羟化酶(P450C21)和类固醇-11β-羟化酶(P45011β)。
5.根据权利要求4的表达基因盒，其特征在于所述异源DNA编码序列来源于牛种属。
6.根据权利要求4或5的表达基因盒，其特征在于该异源DNA编码了至少一种权利要求4的组中的蛋白质。
7.根据权利要求4或5的表达基因盒，其特征在于它至少含有另一个异源DNA，该DNA具有它自己的起作用的控制序列，编码了权利要求4组中的一种蛋白质。
8.根据权利要求6或7的表达基因盒，其特征在于该异源DNA编码了牛P450SCC和牛的ADX。
9.根据权利要求5中的表达基因盒，其特征在于该异源DNA编码了酶P450SCC，并且该表达基因盒取自于用PGBSCC-n表示的组，其中n是1至17的任一整数。
10.根据权利要求5的表达基因盒，其特征在于该异源DNA编码了酶P45017α，并且该表达基因盒取自于用PGB17α-n表示的组，其中n是1至5的任一整数。
11.根据权利要求5的表达基因盒，其特征在于该异源DNA编码了酶P45021C，并且该表达基因盒取自于用PGBC21-n表示的组，其中n是1至9的任一整数。
12.根据权利要求5的表达基因盒，其特征在于该异源DNA编码了酶P45011β，并且该表达基因盒取自于用PGB11β-n表示的组，其中n是1至4的任一整数。
13.一种重组宿主细胞及其子代，包括有微生物、植物或动物的细胞，并含有异源DNA的表达基因盒，其特征在于该表达基因盒为权利要求1至12的任一权利要求中的表达基因盒。
14.根据权利要求13的重组宿主细胞及其子代，其特征在于该宿主是一种微生物。
15.根据权利要求14的重组宿主细胞及其子代，其特征在于该宿主是一种酵母菌(Saccharomyces)、Kluyveromyces或杆菌(Bacillus)或者是大肠杆菌(EscherichiaColi)。
16.根据权利要求13至15的任一权利要求的重组宿主细胞及其子代，其特征在于它至少含有两个如权利要求1至12的任一权利要求中限定的表达基因盒。
17.一种由重组细胞制备外源蛋白的方法，包括在能形成所述蛋白质并在培养物中累积的培养条件下将重组细胞在营养培养基中培养，其特征在于该重组细胞是权利要求13至15的任一权利要求限定的重组宿主细胞。
18.一种在营养培养基中、在能形成所述蛋白质并在培养物中累积的培养条件下、由一种重组细胞制备外源蛋白混合物的方法，其特征在于所述的重组细胞是如权利要求16所限定的重组宿主细胞。
19.一种用于体外选择性生物氧化的方法，该方法包括在一种或多种蛋白质存在时，在能够发生所述氧化并使氧化化合物能在培养液中累积的条件下，保温待氧化的化合物，再回收氧化后的化合物，其特征在于所述的一种或多种蛋白质是通过权利要求17或18的方法生产的。
20.一种氧化一个选取的化合物的方法，该方法包括在所述化合物存在时，在能够发生所需的氧化作用并能在培养液中累积该氧化后的化合物的培养条件下，培养重组细胞再回收氧化后的化合物，其特征在于所述重组细胞是权利要求13至16的任一权利要求中的重组宿主细胞。
21.根据权利要求19或20的方法，其特征在于该氧化作用选自于以下组中的一个氧化作用裂解甾醇化合物的侧链产生孕甾烯醇酮;孕甾烯醇酮转化成为孕酮;孕酮转化成为17α-羟基孕酮;17α-羟基孕酮转化成11-脱氧皮甾醇和11-脱氧皮甾醇转化成氢化可的松。
22.根据权利要求21的方法，其特征在于该氧化作用是裂解甾醇化合物的侧链，得到孕甾烯醇酮。
23.根据权利要求21的方法，其特征在于该氧化作用是孕酮的17α-羟化作用。
24.根据权利要求21的方法，其特征在于在同一底物分子上一步完成所述组中至少两个氧化作用。
25.含有根据权利要求19-24的任一权利要求的方法制备的活性化合物的药物制剂。
全文摘要
本发明提供了含有新的表达基因盒的遗传工程方法得到的宿主细胞，它能完成类固醇的生物化学氧化作用，尤其是用导入了编码了与胆甾醇转化为氢化可的松的生物途径有关的蛋白质的DNA的细胞来完成氧化作用。合适的宿主细胞有杆菌属(Bacillus)、酵母菌属(Saccharomgces)或Kluyveromyces的菌种。这些新的宿主细胞适合于胆甾醇，导甾烯醇酮、孕酮、17α-孕酮和11-脱氧皮质醇的微生物氧化作用，它们是所述生物途径的中间产物。这些新的表达基因盒在最终产生一个一步完成胆甾醇向氢化可的松转化的多基因系统中也是有用的。
文档编号C12N15/09GK1038667SQ89104208
公开日1990年1月10日 申请日期1989年5月6日 优先权日1988年5月6日
发明者荷曼·斯利杰克惠斯, 格拉杜斯·考尼利斯·玛利亚·塞尔坦, 埃利克·巴斯提安·思马尔 申请人:吉斯特-布罗卡迪斯公司